謝佳芮，寇美玲，高華峰，高林，陳文瑾，苗海生

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

阿卡斑病 (Akabane disease)又名赤羽病，是由阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)引起的一種病毒病，主要感染牛羊，以流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、木乃伊胎、新生胎兒發(fā)生關(guān)節(jié)彎曲和積水性無(wú)腦綜合征(AH 綜合征)為特征，主要傳播媒介為吸血昆蟲。阿卡斑病毒隸屬泛布尼亞病毒科(Peribunyaviridae)、正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)、辛波血清群(Simbu)，是單股負(fù)鏈RNA病毒。該病毒最早于1959年在日本群馬縣赤羽村的金色庫(kù)蚊和三帶喙庫(kù)蚊體內(nèi)分離獲得，其后在韓國(guó)、臺(tái)灣、土耳其、以色列及澳大利亞先后發(fā)現(xiàn)該病毒，其中2002—2006 年間在日本發(fā)生14次疫情，給日本牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的損失[1-4]。我國(guó)云南、廣西、陜西、內(nèi)蒙古、湖南、河北、山東、上海、吉林等地區(qū)也相繼檢測(cè)或分離到該病毒[5-7]。

阿卡斑病與其他多數(shù)病毒病一樣，無(wú)特效治療藥物，主要通過(guò)接種疫苗進(jìn)行防控，但由于多數(shù)動(dòng)物感染后臨床癥狀不明顯，因此極易造成誤診，被發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已成大流行態(tài)勢(shì)。目前，國(guó)外已開(kāi)發(fā)出多種弱毒苗和滅活苗，減毒活疫苗已在日本使用，滅活疫苗已在澳大利亞、日本和韓國(guó)使用。日本開(kāi)發(fā)了利用HmLu-1細(xì)胞傳代致弱的減毒活疫苗，但是該疫苗用本國(guó)毒株制備[8]，對(duì)中國(guó)流行毒株的免疫效果無(wú)評(píng)價(jià)結(jié)果。目前，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有商品化阿卡斑疫苗批準(zhǔn)和相關(guān)研究報(bào)道，因此亟需針對(duì)我國(guó)流行毒株開(kāi)發(fā)安全、高效的疫苗。本研究應(yīng)用3種細(xì)胞分別對(duì)阿卡斑病毒CX-01株進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用BEI滅活劑進(jìn)行滅活，評(píng)價(jià)病毒增殖滴度，探索滅活程序，并利用小鼠模型評(píng)價(jià)了ISA 206佐劑滅活疫苗的免疫效力。

1 材料與方法

1.1 阿卡斑病毒毒株培養(yǎng)及組織半數(shù)感染量(TCID50)檢測(cè)

阿卡斑病毒CX-01株于2019年分離自云南省楚雄州一羊場(chǎng)，由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏，同時(shí)保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為：CGMCC No.45207，可適應(yīng)BHK-21、Vero和HmLu-1細(xì)胞培養(yǎng)。擴(kuò)繁病毒時(shí)，首先將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿單層的BHK-21、Vero和HmLu-1細(xì)胞接種適量的阿卡斑病毒種毒，再補(bǔ)加MEM維持液，以種毒和MEM維持液混合后病毒的初始滴度不低于104.5TCID50/mL為準(zhǔn)，置37 ℃溫箱培養(yǎng)，當(dāng)觀察到70%～80%細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE)時(shí)收獲病毒培養(yǎng)液，凍融1次后，3 000 r/min離心30 min，上清液即為制備滅活疫苗的病毒液，進(jìn)行TCID50檢測(cè)。

TCID50檢測(cè)方法：將待檢病毒液用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基作10-1～10-6連續(xù)倍比稀釋，加入提前準(zhǔn)備長(zhǎng)滿上述相應(yīng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每個(gè)稀釋度加4孔，每孔0.1 mL，然后每孔補(bǔ)加0.1 mL無(wú)血清MEM培養(yǎng)基，置5%二氧化碳37 ℃溫箱中培養(yǎng)。5 d后觀察細(xì)胞病變，K?rber法計(jì)算TCID50。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

主要試劑：BEA(二乙烯亞胺)、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、ISA 206佐劑、分析純左旋咪唑鹽酸鹽，購(gòu)自云南豐科生物科技有限公司。蔗糖、海藻糖購(gòu)自昆明諾華生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c小鼠，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠實(shí)驗(yàn)在云南生物制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。

1.3 病毒增殖特征

應(yīng)用已經(jīng)適應(yīng)HmLu-1、Vero、BHK-21細(xì)胞的阿卡斑病毒CX-01種毒，分別接種3種細(xì)胞測(cè)定病毒增殖規(guī)律，以確定病毒在不同傳代細(xì)胞上的增殖特性。將上述3種細(xì)胞培養(yǎng)的種毒分別作病毒滴度(TCID50)檢測(cè)，并用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使培養(yǎng)液內(nèi)的病毒最終滴度為104.5TCID50/mL，分別加入到對(duì)應(yīng)長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的HmLu-1、Vero、BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37 ℃溫箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72、84、96、108和120 h取樣，每次取樣0.5 mL，同時(shí)補(bǔ)加0.5 mL的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液。取樣完成后分別用HmLu-1、Vero、BHK-21細(xì)胞對(duì)相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的病毒樣品進(jìn)行TCID50檢測(cè)。

1.4 病毒滅活

制備0.2 mol/L的BEI滅活劑，具體方法為：在1.6%氫氧化鈉溶液中加入4.1%的二乙烯亞胺，充分溶解，置37 ℃ 1.5 h進(jìn)行環(huán)化，期間每15 min劇烈晃動(dòng)10 s，反應(yīng)結(jié)束后即得到0.2 mol/L的BEI滅活劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，共制備3個(gè)批次。將病毒滴度106.75TCID50/mL的病毒液平均分為3份，每份30 mL。首先將3批次待滅活的病毒懸液置37 ℃水浴鍋中，使病毒液溫度達(dá)到37 ℃，然后將0.2 mol/L BEI滅活劑按照1%的量加到病毒液中，即BEI終濃度為0.002 mol/L，置37 ℃溫箱中緩慢攪拌滅活。分別在滅活0、1、2、3、4、5、6、7和8 h時(shí)各取樣5 mL，并添加2 mol/L的硫代硫酸鈉溶液10 μL到樣品內(nèi)，終止滅活反應(yīng)，4 ℃保存待檢。所有樣品用無(wú)血清MEM培養(yǎng)液分別作10-1～10-6倍比梯度稀釋，進(jìn)行TCID50檢測(cè)。

1.5 不同疫苗添加劑對(duì)免疫效果的影響

將滅活好的阿卡斑病毒液分為4份，每份10 mL。為評(píng)估疫苗添加劑蔗糖、海藻糖和左旋咪唑?qū)π∈竺庖咝Ч挠绊?，試?yàn)設(shè)4個(gè)不同添加劑配方組別：第1組為10 mL病毒；第2組為10 mL病毒液+0.5 mL蔗糖+0.5 mL海藻糖；第3組為10 mL病毒液+0.5 mL蔗糖+0.5 mL海藻糖+1%左旋咪唑(0.11 g)；第4組為10 mL病毒液+1%左旋咪唑(0.1 g)；第5組為對(duì)照組，為HmLu-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液。然后按照體積比1∶2的量加入ISA 206佐劑攪拌乳化，4～6 ℃放置30 d后進(jìn)行疫苗免疫試驗(yàn)。每種疫苗接種5只小鼠，每只小鼠皮下接種0.2 mL，21 d后心臟采血分離血清，進(jìn)行中和抗體檢測(cè)。

中和試驗(yàn)方法為：在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上將待檢血清作1∶4～1∶512倍比稀釋，應(yīng)用100 TCID50的病毒液在5%二氧化碳37 ℃溫箱中進(jìn)行中和反應(yīng)1 h，然后以HmLu-1細(xì)胞作為感作細(xì)胞，每孔加100 μL細(xì)胞生長(zhǎng)液(約含1×104個(gè)細(xì)胞)，5%二氧化碳、37 ℃溫箱培養(yǎng)5 d后判定結(jié)果，K?rber法計(jì)算中和抗體效價(jià)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SSPS軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 病毒培養(yǎng)和毒價(jià)檢測(cè)

阿卡斑病毒滴度(TCID50/mL)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，HmLu-1、Vero、BHK-21細(xì)胞均在84～96 h時(shí)滴度最高，其中HmLu-1細(xì)胞培養(yǎng)病毒滴度最高為106.75TCID50/mL。

表1 3種細(xì)胞擴(kuò)繁病毒滴度檢測(cè)結(jié)果-lg TCID50/mL

2.2 病毒滅活時(shí)間確定

用終濃度為0.002 mol/L的BEI對(duì)3個(gè)批次的病毒液進(jìn)行滅活、取樣，每次取樣后加終止液終止反應(yīng)。表2結(jié)果顯示，3批次抗原在滅活5 h后TCID50均為0，即病毒液不再感染細(xì)胞。為確保對(duì)阿卡斑病毒的滅活完全徹底，在BEI滅活劑用量和滅活條件不變的前提下，選擇最優(yōu)的滅活時(shí)間即8 h，其中第5小時(shí)后更換滅活用容器(瓶)1次。

表2 不同滅活時(shí)間TCID50檢測(cè)結(jié)果-lg TCID50

2.3 免疫效果評(píng)估

中和試驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)表3)，1～4組均不同程度出現(xiàn)中和抗體，對(duì)照組(5組)未出現(xiàn)中和抗體。其中第3組免疫效果最好，平均中和抗體滴度為18.0，極顯著高于第1組(P<0.01)，顯著高于第2組和第4組(P<0.05)。表明阿卡斑病毒滅活后需添加蔗糖、海藻糖、左旋咪唑穩(wěn)定抗原并提高機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。

表3 阿卡斑病毒滅活疫苗不同添加劑免疫效果比較

3 討論

隨著赤羽病在世界許多地區(qū)的廣泛流行，病毒基因組和致病性也在不斷演化，在韓國(guó)、日本和臺(tái)灣已發(fā)現(xiàn)變異株，其對(duì)犢牛和成年牛的致病性增強(qiáng)，并可引起新生犢牛腦炎癥狀[9]。2016年在廣西發(fā)現(xiàn)可以感染竹鼠的致病性毒株[10]，2021年9月至2022年1月，我國(guó)東北地區(qū)多地發(fā)生疑似阿卡斑病毒致病的疫情[11]。云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院應(yīng)用cELISA方法對(duì)2019—2020 年采自云南省邊境地區(qū)10個(gè)縣市的牛群血清樣品進(jìn)行AKAV 抗體檢測(cè)與分析，結(jié)果在采集的4 437份牛血清樣品中檢出抗體陽(yáng)性樣品1 367 份，平均抗體陽(yáng)性率為30.81%[12]。

本研究選用的毒株為2019年分離自山羊血液的CX-01毒株，通過(guò)對(duì)S和M基因片段的比較，該毒株屬于基因群Ia，與所有中國(guó)已報(bào)道毒株序列屬同一遺傳譜系，并且該毒株易持續(xù)性擴(kuò)繁，因此該毒株作為中國(guó)疫苗用毒株具有一定的優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)外已有阿卡斑病毒滅活疫苗制備的報(bào)道[13-15]，Yang等[15]用BEI和甲醛分別對(duì)阿卡斑病毒滅活，制備疫苗后接種豚鼠和懷孕母牛，發(fā)現(xiàn)2種滅活方法對(duì)免疫效果無(wú)顯著差異，一次免疫后抗體效價(jià)高于8，二次免疫后最高中和抗體效價(jià)均可達(dá)64 。由于甲醛主要是通過(guò)病毒衣殼蛋白的交聯(lián)反應(yīng)使蛋白質(zhì)變性阻止核酸的釋放，BEI則直接破壞病毒核酸，避免了破壞衣殼表面抗原和病毒返強(qiáng)，選擇適當(dāng)?shù)挠昧靠稍? h內(nèi)滅活病毒，保證了病毒衣殼蛋白的穩(wěn)定性。同樣規(guī)格的BEI滅活劑，不同廠家或不同批次不可避免的存在純度、活性方面的細(xì)微差異，在滅活劑配制過(guò)程當(dāng)中由不同人員操作也會(huì)有差異。本研究中使用的溫箱與其他研究人員使用的溫箱或溫室可能會(huì)存在溫度上的差異，并且病毒液用量不同時(shí)，特別是大容量培養(yǎng)時(shí)溫度傳導(dǎo)較慢，影響滅活效果。作者曾長(zhǎng)期開(kāi)展口蹄疫等重大動(dòng)物疫病滅活疫苗研究，比如口蹄疫病毒一般37 ℃ 6 h可完全滅活，但實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中均需要12 h以上來(lái)確保安全。因此，適當(dāng)延長(zhǎng)病毒的滅活時(shí)間是滅活疫苗制備常識(shí)，雖然阿卡斑病非重大動(dòng)物疫病，但適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)病毒滅活時(shí)間也是必要的，綜合考慮滅活效果與病毒穩(wěn)定性的關(guān)系，確定滅活8 h比較合理。本研究選擇了該種滅活方法進(jìn)行研究，為阿卡斑病毒滅活疫苗制備提供了一種新的滅活方案。由于受研究條件限制，選擇了BALB/c小鼠作為動(dòng)物模型進(jìn)行試驗(yàn)，雖然不能完全體現(xiàn)大動(dòng)物的實(shí)際免疫效果，但是在一定程度上可展示出滅活疫苗和添加劑的作用，為后續(xù)試驗(yàn)提供參考。研究中，蔗糖和海藻糖作為抗原保護(hù)劑已得到了共識(shí)，左旋咪唑作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能[16]，本研究是對(duì)其增強(qiáng)抗體分泌功能的一種嘗試性使用，至少證明在阿卡斑病毒滅活疫苗中配合使用是有突出效果的。

阿卡斑病毒在我國(guó)多地特別是熱帶亞熱帶地區(qū)呈現(xiàn)流行性分布，目前已有毒株致病力普遍較弱，多數(shù)動(dòng)物在感染6 d后轉(zhuǎn)歸良好，但隨著病毒基因組的不斷變異和重組，不排除未來(lái)高致病性毒株的出現(xiàn)，因此對(duì)毒株和滅活疫苗制備技術(shù)的研究具有重要意義。