張妍,郭凱悅,關小米,劉麗雅,韓麗萍

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是一種雌激素依賴的良性婦科疾病,是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)在子宮內(nèi)膜外不同部位的生長,卵巢、輸卵管、膀胱、乙狀結(jié)腸和子宮肌層是最常見的發(fā)病部位[1]。EMs臨床多有月經(jīng)異常、痛經(jīng)、性交痛等表現(xiàn),若不及時干預,可導致患者不孕,嚴重影響其身心健康及生活質(zhì)量[2]。關于EMs的病因中最被廣泛接受的是Sampson的經(jīng)血逆流學說[3]:子宮內(nèi)膜組織隨經(jīng)血逆流至盆、腹腔,進而形成EMs病灶。目前,臨床上主要采用手術對EMs患者進行治療,但臨床研究中發(fā)現(xiàn),腹腔鏡手術治療的患者復發(fā)率較高,兩年復發(fā)率在35%左右[4]。

外泌體是大小為 30～150 nm 的胞外囊泡,不同于直接從膜上分離出來的胞外囊泡,外泌體主要通過核內(nèi)體途徑形成,并可由多種類型的活細胞分泌,在血液、腹水、尿液、卵泡液、精液、羊水等體液中均可發(fā)現(xiàn)[5]。外泌體內(nèi)包裹攜帶著miRNA、lncRNA和蛋白質(zhì)等多種生物分子,能夠保護其免受降解,在細胞間信息傳遞過程中發(fā)揮著重要作用。已有報道指出,外泌體與卵巢癌、宮頸癌等多種癌癥相關[6-7]。本綜述旨在總結(jié)目前EMs外泌體研究領域的最新進展,指出目前研究存在的局限性并分析進一步研究可能的方向,以期為EMs外泌體的相關研究及臨床應用提供新的思路。

1 外泌體內(nèi)容物與EMs

外泌體具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),其內(nèi)包裹攜帶著多種生物分子,幾乎所有哺乳動物的細胞都能分泌外泌體,外泌體內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)、mRNAs、微小 RNA(microRNAs,miR)等,它們可以反映來源細胞的生物學特點[8-9]。外泌體發(fā)揮作用常常需要依賴其內(nèi)攜帶的蛋白質(zhì)和RNAs,影響靶細胞的功能,從而起到信息傳遞的作用。外泌體脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性,在體液中廣泛分布,分泌后可被受體細胞快速吸收,且易獲得、具有良好的生物相容性[10]。外泌體可通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌等方式調(diào)控受體細胞的表型以及功能[11],其可從血管中擴散至組織間的特性也為EMs患者出現(xiàn)盆腹腔以外的病灶提供了新的研究思路。同時,外泌體的納米尺寸允許它們從血管中滲出并在組織中擴散發(fā)揮作用,因此其可以作為潛在的納米載體用于臨床相關疾病的治療,也具有作為生物學標志物的潛能。近來,越來越多的研究者將關注點放在了外泌體在EMs發(fā)生發(fā)展中的作用機制及其臨床應用的研究上。

1.1 外泌體蛋白質(zhì)與EMs

EMs的發(fā)生發(fā)展與蛋白質(zhì)的作用存在關聯(lián),研究發(fā)現(xiàn)EMs病灶中高表達的蛋白質(zhì)可促進EMs的進展[12-13]。外泌體可包裹攜帶蛋白質(zhì),保護其不被血液或組織中的蛋白酶降解,因此能保留蛋白質(zhì)的生物學功能,將其攜帶至受體細胞并發(fā)揮其作用。Nazri等[14]的研究在EMs患者的腹腔液外泌體中檢測出對照組患者缺乏的五類蛋白質(zhì):PRDX1、2-C H2A型、ANXA2、ITIH4和微管蛋白a鏈,開創(chuàng)性地提出了“腹腔液外泌體可作為EMs潛在生物標志物”的理論。該研究還發(fā)現(xiàn),ASRM I/II期EMs患者體內(nèi)的外泌體濃度增加,而ASRM III/IV期EMs患者體內(nèi)的外泌體濃度減少,提示腹腔液外泌體有可能作為鑒別I/II和III/IV期EMs患者的生物標志物。Wyciszkiewicz等[15]的研究對比了EMs、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌患者血清和腹腔液中外泌體攜帶的熱休克蛋白含量,得出EMs患者血清和腹腔液中外泌體所含熱休克蛋白高于正常組的結(jié)論。目前,關于EMs中外泌體蛋白質(zhì)的研究較少,當發(fā)現(xiàn)一些基于外泌體的新型診斷和預后生物標志物時,基于外泌體蛋白組學的研究可能為EMs相關研究提供更全面的基礎。

1.2 外泌體RNA與EMs

miRNA參與了EMs的發(fā)病機理,包括孕酮抵抗,凋亡抑制和遷移。miRNA在外泌體中能夠穩(wěn)定表達,不被體液中RNase降解。王禮賢等[16]的研究得出:與對照組相比,EMs患者在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(eutopic endometrial stromal cells,EuESCs)外泌體中的miRNA存在差異表達。同時,Chen等[17]通過MicroRNA測序發(fā)現(xiàn)13種外泌體miRNA(miRNA-1908、-130b、-451a、-486-5p、-4488、-432、-342、-425、-505、-6508、-145、-365a和-365b)參與免疫改變和細胞增殖,并在EMs患者中差異表達。此外,Zhang等[18]的研究得出結(jié)論:EMs患者血清中的外泌體miR-22-3p和 miR-320a明顯高于正常對照組,提示這兩個外泌體miRNA可能具有作為診斷EMs生物學標志物的潛力,進一步研究發(fā)現(xiàn)腹膜巨噬細胞中的外泌體miR-22-3p通過調(diào)節(jié)SIRT1 /NF-κB途徑促進異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(ectopic endometrial stromal cells,EcESCs)的增殖、遷移和侵襲[19]。在動物研究方面,Wu等[20]研究結(jié)果表明,在小鼠體內(nèi),外泌體攜帶的miR-214通過直接影響結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表達來影響EcESCs中的纖維生成途徑。

目前,關于外泌體攜帶lncRNA在EMs中的研究較少。Wu等[21]發(fā)現(xiàn)外泌體lncRNA H19可充當競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA),通過增加miRNA Let-7的活性在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控一型胰島素樣生長因子受體(type i insulin-like growth factor receptor,IGF1R)表達,從而降低子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(endometrial stromal cells,ESCs)的增殖能力,提示外泌體攜帶的lncRNA可能與EMs存在相關性。Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn),EMs病灶產(chǎn)生lncRNA-反義缺氧誘導因子(antisense hypoxia-inducible factor,aHIF)的外泌體可以將lncRNA-aHIF轉(zhuǎn)移至受體人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical cord vein endothelial cells,HUVECs),隨后調(diào)節(jié)HUVECs的生長,從而促進EMs發(fā)病過程中的血管生成。

雖然已報道了許多失調(diào)的miRNA在EMs相關發(fā)生發(fā)展中的研究,但是由于所取樣本的異質(zhì)性,周圍組織細胞的干擾掩蓋了子宮內(nèi)膜細胞的分子標記等,導致這些研究的結(jié)果并不一致。Saare等[23]認為,為了減小所取樣本的異質(zhì)性,應更改實驗設計,針對特定細胞群體(如上皮細胞、間質(zhì)細胞等)進行研究,也可以選擇細胞培養(yǎng)的方法來獲取目標細胞以降低異質(zhì)性。

2 外泌體在EMs中的作用

2.1 外泌體與EMs神經(jīng)血管生成

EMs的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)血管生成密切相關。Sampson的經(jīng)血逆流學說[3]認為,子宮內(nèi)膜組織逆行通過輸卵管,沉積到腹膜腔中,在腹膜腔中建立血液供應并增殖,形成臨床上的EMs病灶。血管生成在子宮內(nèi)膜異位病變的建立和生長中起著不可或缺的作用,而血管需要神經(jīng)支配來控制舒張或收縮,神經(jīng)纖維產(chǎn)生信號(如血管內(nèi)皮生長因子)引導血管生成,反過來,血管內(nèi)皮細胞也發(fā)出信號(如神經(jīng)營養(yǎng)素)來吸引軸突分布到血管。

2.1.1 外泌體與EMs血管生成 Harp等[10]將來自EMs患者EuESCs及EcESCs的外泌體與HUVECs共培養(yǎng),得出外泌體可以通過旁分泌的方式促進體外血管生成的結(jié)論。該研究還通過MicroRNA測序發(fā)現(xiàn),EMs患者EuESCs外泌體中的miR-21與對照組存在差異表達,而miR-21曾被報道與血管生成有關,從而提出EMs外泌體的致血管生成作用,一部分可能歸因于miR-21的過度表達,并且從另一方面提示了外泌體可能作為細胞間通訊調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用,進一步證實Sampson的經(jīng)血逆流學說。Qiu等[22]將HUVECs與攜帶高表達lncRNA aHIF外泌體的EcESCs共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)與對照組相較,HUVEC的促血管生成行為顯著增加,提示外泌體lncRNA aHIF可以從EcESCs轉(zhuǎn)移到HUVECs,從而引發(fā)EMs異位微環(huán)境中HUVECs的促血管生成行為。此外,該研究還進一步探索了外泌體lncRNA aHIF轉(zhuǎn)移至HUVECs后的下游事件-對照組的血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、血管內(nèi)皮生長因子-D(vascular endothelial growth factor-D,VEGF-D)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)水平顯著低于實驗組,表明EcESCs來源的外泌體lncRNA aHIF通過影響HUVECs中VEGF-A、VEGF-D和b-FGF的表達來發(fā)揮對HUVECs的調(diào)節(jié)作用。

2.1.2 外泌體與EMs神經(jīng)生成 Sun等[24]研究發(fā)現(xiàn),EMs患者EuESCs分泌的外泌體可以被背根神經(jīng)節(jié)吸收,促進神經(jīng)的生長,從而促進EMs的血管生成。由此可見,外泌體可作為信號傳導的“中介”,通過其攜帶的“貨物”引導神經(jīng)生成,促進異位病灶的生存與生長,從而在EMs的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前,關于外泌體與EMs神經(jīng)血管生成相關的研究報道較少,有待進一步深入。

2.2 外泌體與EMs免疫失衡及慢性炎癥

Sampson的經(jīng)血逆流學說[3]認為,經(jīng)血通過子宮收縮經(jīng)輸卵管逆流至腹膜腔,一旦進入腹膜,這種子宮內(nèi)膜組織可以粘附在腹膜結(jié)構(gòu)上,形成血液供應并發(fā)展成子宮內(nèi)膜異位病變。然而,約90%的育齡期婦女存在經(jīng)血逆流,而EMs發(fā)病率僅約為10%[25],這提示患有EMs的婦女可能對逆流的子宮內(nèi)膜碎片存在功能失調(diào)的免疫反應,阻止了它們被免疫系統(tǒng)清除,并最終促進成了異位病變處的炎癥、血管生成和病理環(huán)境[26]。近來的研究發(fā)現(xiàn),EMs的發(fā)生發(fā)展與免疫機制的失衡和慢性炎癥密切相關,而外泌體與免疫系統(tǒng)的失衡及慢性炎癥存在一定的關聯(lián)。Wyciszkiewicz等[15]發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,EMs患者外泌體中熱休克蛋白-22水平升高,而熱休克蛋白表達水平與細胞毒性免疫反應的標志物,即穿孔素和顆粒酶B表達呈正相關,提示外泌體與EMs免疫失衡之間存在一定的聯(lián)系。與免疫失衡有關疾病進展的最重要因素是免疫抑制微環(huán)境的過度激活,來源于骨髓的抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)已被鑒定為最強的免疫抑制細胞之一,Chen等[17]的研究認為MDSCs衍生的外泌體miRNA可能通過抑制機體的免疫功能促進EMs的發(fā)生發(fā)展,提示外泌體在EMs免疫失衡過程中發(fā)揮重要作用。外泌體可將攜帶的“貨物”運送到盆、腹腔并將其傳遞至受體細胞(如:腹腔內(nèi)的巨噬細胞)后,影響受體細胞的功能活動從而發(fā)揮作用。Sun等[27]通過研究得出:在小鼠EMs模型中,外泌體從ESCs轉(zhuǎn)移到巨噬細胞,促使巨噬細胞轉(zhuǎn)化為M2樣表型并減弱其吞噬能力,從而導致免疫功能障礙,同時,ESCs來源的外泌體還可促進M2型巨噬細胞的浸潤,增加小鼠異位病灶的體積和重量。

3 外泌體與EMs現(xiàn)有研究的局限性

雖然目前存在越來越多的研究致力于闡明外泌體與EMs發(fā)生發(fā)展之間的關系,但是現(xiàn)有研究仍存在以下局限性。

3.1 現(xiàn)存研究所取樣本數(shù)量小、特異性差

在多個研究結(jié)果中均提到,關于外泌體及其攜帶的RNA的研究所采用的樣本量小,得到的研究結(jié)果需要進行大樣本量數(shù)據(jù)的檢測。Nazri等[14]的研究是具有開創(chuàng)性,但是其所納入的樣本量少,代表性有限,故可在該研究的基礎上增加樣本量進一步驗證其所得結(jié)果。

外泌體及其攜帶的某些RNA、蛋白質(zhì)等不只在EMs中升高。Wyciszkiewicz等[15]研究結(jié)果顯示來自卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和EMs的外泌體中均存在小的熱休克蛋白水平升高的情況,提示在選擇研究目標時,應注意其是否在EMs患者中特異,如選擇研究外泌體內(nèi)的熱休克蛋白作為生物標志物時,可增加患有其他婦科疾病患者的試驗組,同時比較不同分組內(nèi)研究目標的差異,從而確保結(jié)果的特異性。

3.2 EMs外泌體研究的準確性

外泌體易在體液中檢測及其攜帶并保護其內(nèi)分子不被降解的特性使其具有作為生物學標志物的潛能。值得注意的是,Vanhie等[28]提出了應提高對所得EMs生物標志物準確性的重視。應該考慮到:即使尋找到了有診斷意義的標志物,若未能核實其準確性,并轉(zhuǎn)化為臨床上真正有用的檢測物,那么所做的研究與付出的努力將會付諸東流。加強對所研究外泌體標志物準確性的判斷,并尋找將其應用于臨床的方法,對EMs外泌體相關的研究至關重要。

3.2.1 排除內(nèi)膜所處月經(jīng)周期干擾 Nazri等[14]發(fā)現(xiàn)EMs患者的腹腔液中外泌體數(shù)量增加,尤其是在月經(jīng)周期的增生期,提示在研究EMs與外泌體的關系時應考慮到不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的影響。在EMs時,月經(jīng)周期對外泌體濃度的影響會導致實驗結(jié)果的差異[27]。因此,在設計研究方案時,應考慮到月經(jīng)周期對外泌體濃度、體內(nèi)激素及體液中其它細胞因子或蛋白質(zhì)等的影響,從而排除干擾因素,提高研究結(jié)果的準確性。

3.2.2 增加ASRM分期 Zhang等[18]的研究中,與ASRM I/II期EMs患者相比,miR-22-3p在EMs III/IV期的患者中升高更明顯,而miR-320a在不同階段EMs患者中無明顯差異,提示其升高的水平與EMs的分期無關。這一研究結(jié)果提示,未來的研究應考慮到EMs不同ASRM分期的樣本也會對研究結(jié)果造成影響,因此,設計實驗時,應注意在進行樣本選擇和分組方面考慮所選EMs患者的ASRM分期。

4 EMs外泌體的進一步研究方向

4.1 無創(chuàng)EMs外泌體生物學標志物的開發(fā)

Nazri等[14]研究提出了可將腹腔液外泌體作為EMs的生物學標志物,然而,在確定了腹腔液外泌體可以作為EMs患者的診斷標志物后,如何將其應用于臨床?例如,通過何種非侵入的方式獲得腹腔液外泌體及設定怎樣的外泌體界限值以診斷EMs。針對這一問題,Zhang等[18]的研究提出在血清中檢測外泌體miR-22-3p和 miR-320a。Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn),外泌體lncRNA-aHIF在EMs患者血清中的水平高于正常女性,提示血清外泌體RNA有作為EMs生物學標志物的潛能。從無創(chuàng)性的角度來看,后者的研究結(jié)果更值得深入探索。然而,Ahn等[29]指出,來自血液、尿液的外泌體可能被其中存在的影響因子干擾而使檢測結(jié)果產(chǎn)生差異,并提出通過子宮內(nèi)膜活檢這一方式來檢測EMs的生物學標志物。值得注意的是,EMs主要發(fā)生在育齡期女性,而子宮內(nèi)膜活檢有可能損傷子宮內(nèi)膜基底細胞,進而影響受孕,權(quán)衡該取材方式的利弊將作為進一步研究過程中的重要步驟。此外,Harp等[10]的理論提示月經(jīng)血中可能存在外泌體,外泌體伴隨月經(jīng)血逆流入腹腔而對EMs的發(fā)生發(fā)展過程產(chǎn)生影響,月經(jīng)血中外泌體是否有望成為EMs新的無創(chuàng)診斷標志物?Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn)EMs患者血清中外泌體lncRNA aHIF較正常組升高,并與異位子宮內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNA aHIF的表達水平顯著相關,然而,血清外泌體lncRNA aHIF與臨床病理特征之間的相關性以及循環(huán)外泌體lncRNA aHIF在EMs中的診斷價值需要在多中心大規(guī)模臨床研究中進一步探索。未來的研究需要在檢測手段可行性的基礎上,排除不同樣本來源外泌體周圍的因子影響,同時,可增加循環(huán)外泌體與組織外泌體的相關性研究,以期將循環(huán)外泌體作為EMs的無創(chuàng)生物學標志物。

4.2 EMs外泌體RNA下游事件的闡明

有研究證實miRNA通過信號通路如PI3K/Akt和STAT3途徑參與EMs的發(fā)病機制[18]。另外,王禮賢等[16]研究提示miRNA靶基因主要集中在Wnt信號通路和MAPK 信號通路上,這兩個信號通路均與EMs的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。外泌體對EMs作用的研究已深入到miRNA水平,但對其參與EMs相關信號通路方面的研究還較少,在繼續(xù)研究miRNA的同時,可深入研究其發(fā)揮作用的信號通路,有助于更好地了解外泌體發(fā)揮作用的信號途徑,進一步提高對外泌體作用的認識。

5 結(jié)語

外泌體在EMs的發(fā)生發(fā)展過程中起到一定的作用,其發(fā)揮作用主要涉及細胞水平、分子生物學水平、信號通路途徑和基因水平。外泌體攜帶的蛋白質(zhì)和RNA是其發(fā)揮生物學作用的主要因素,深入探索外泌體內(nèi)攜帶“貨物”所起的作用將有助于闡明外泌體的作用機制。然而,雖然越來越多的研究涉及外泌體內(nèi)容物對EMs發(fā)生發(fā)展過程的影響,但是不同研究的結(jié)果間缺乏一致性。取樣時選擇特定的細胞類型和外泌體分離方法有助于減少異質(zhì)性,得出準確的結(jié)論。此外,由于缺乏大樣本數(shù)據(jù),部分研究結(jié)論缺乏可信性。在動物實驗中獲得的結(jié)論也應重新設計取樣,探索該結(jié)論在EMs患病女性中是否同樣成立。因此,未來的研究應注意幾點:① 取樣時選擇特定的細胞類型如EuESCs或EcESCs;② 樣本的數(shù)量可較前適當增加;③ 取樣時考慮患者所處的月經(jīng)周期;④ 研究的目標可進一步深入到分子生物或基因水平。以期為EMs的進一步研究和臨床應用提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。