王 華，傅海平*，周品謙，莫澤東，王沅江*

1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125；2.安化縣土壤肥料工作站，湖南 安化 413500

土壤微生物是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)和能量流動的重要驅(qū)動因子[1]，是“植物-土壤微生物-土壤養(yǎng)分”系統(tǒng)的聯(lián)系紐帶[2]，是衡量土壤質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)[3]，因此微生物多樣性對土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。大量研究表明，不同種植模式和作物均會不同程度地影響土壤微生物群落[4]，合適的農(nóng)藝措施對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的調(diào)控起積極作用[5]。間作是茶園特別是幼齡茶園的一種栽培模式，其利用生態(tài)位的分離將光、熱、水、養(yǎng)分等資源實現(xiàn)最大化利用。目前，關(guān)于茶園間作模式的研究主要集中在茶樹生長[6]、茶園生態(tài)環(huán)境[7]、土壤養(yǎng)分[8]、土壤酶活性[9]等方面，對間作模式茶園土壤微生物群落的研究相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，間作生態(tài)系統(tǒng)中的作物對土壤中微生物的多樣性產(chǎn)生影響，而土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能對系統(tǒng)養(yǎng)分的利用產(chǎn)生影響[10]。

目前，研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多采用高通量測序（High-throughput sequencing）、末端限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（T-RFLP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、磷脂脂肪酸法（PLFA）等分子生物學(xué)方法，其能夠體現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)信息，但不能獲取微生物代謝功能。Biolog-ECO技術(shù)是解析微生物對不同種類碳源利用多樣性及評價微生物群落功能多樣性與代謝活性的方法[11]，在土壤微生物多樣性研究中廣泛應(yīng)用[12-13]。而在茶園間作綠肥對土壤微生物代謝功能的影響方面，鮮見研究報道。本試驗以間作綠肥茶園為研究對象，采用Biolog-ECO技術(shù)探討土壤微生物群落代謝功能的差異性，旨在揭示間作綠肥茶園土壤微生物群落特征，探明綠肥對茶園土壤微生物群落的影響，為綠肥在茶園的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗設(shè)在湖南省茶葉研究所長沙縣高橋鎮(zhèn)試驗基地（N 28°28′40.9′′、E 113°20′23.8′′）。茶樹品種為‘黃金茶2號’，種植規(guī)格雙行雙株（行距160 cm），種植時間2017年。土壤類型為黃壤，土壤肥力（0～20 cm）：pH 4.84，有機(jī)質(zhì)含量為19.0 g/kg，全氮含量為1.27 g/kg，堿解氮含量為89.0 mg/kg，有效磷含量為4.07 mg/kg，速效鉀含量為143.0 mg/kg。

試驗設(shè)2個處理：間作綠肥（GM）與未間作綠肥（CK）。間作綠肥處理：每年10—11月種植毛葉苕子，4月種植田菁，每個處理均3次重復(fù)，每個小區(qū)面積50 m2。分別采用刈割開溝翻壓還田的方式。其他田間管理措施一致。

1.2 土壤樣品采集

采用S形布點法。選5個點，用土鉆取0～20 cm土層土樣，剔除石塊、植物殘根等雜物后將土壤樣品混勻后分成2份，一份4℃保存，用于Biolog碳源利用、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的測定；另一份風(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性狀測定

pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀等分別采用電位法（水浸）、電熱板加熱-重鉻酸鉀容量法、凱氏蒸餾法、堿解擴(kuò)散法、NH4F-HCl浸提-鉬銻抗比色法、NH4OAc浸提-火焰光度法測定[16]。硝態(tài)氮與銨態(tài)氮的測定采用LY/T 1228—2015方法進(jìn)行。

1.3.2 Biolog-ECO檢測

稱取10.0 g新鮮土樣置于裝有90 mL已滅菌生理鹽水（0.85%NaCl）的三角瓶內(nèi)，在轉(zhuǎn)速200 r/min下振蕩30 min，靜置10 min后用生理鹽水（0.85%NaCl）稀釋到10-3，將稀釋好的土壤懸濁液150 μL接種到Biolog-Eco板（BIOLOG，Hayward，USA）的每個微孔中，接種后的ECO板在25℃下培養(yǎng)。每隔24 h用Biolog Reader儀（BIOLOG，Hayward，USA）測定波長590 nm和750 nm的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

土壤微生物碳源利用率平均吸光值：AWCD =∑(Ci-R)/n。

Shannon多樣性指數(shù)（H）：H= -∑PilnPi。

碳源利用豐富度指數(shù)（S）= 被利用碳源的總數(shù)。碳源利用豐富度指數(shù)即顏色變化的孔數(shù)，吸光值小于0.25視為顏色沒有變化。

Pielou均勻度指數(shù)（E）：E=H/lnS。

Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）：D=1-∑P2i。

McIntosh指數(shù)（U）：

豐富度指數(shù)S＝被利用碳源的總數(shù)目（C-R＞0.2的孔數(shù)）。

其中：Ci為第i孔的相對吸光值；R為對照孔的吸光值；n為碳源種類數(shù)；S為被利用的碳源總數(shù)；Pi為第i孔與對照孔的相對吸光值差與整個平板相對吸光值總和的比值。

采用SPSS 22.0進(jìn)行方差（LSD檢驗法）和主成分分析，Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 間作綠肥處理土壤微生物對碳源的利用

由圖1可知，土壤微生物群落隨培養(yǎng)時間的推移AWSD呈上升趨勢，其中48 h內(nèi)其值均較低，碳源的利用較弱，處理間沒有差異。48～120 h，不同處理AWSD值均呈快速增長，且間作綠肥處理增長速度高于對照。120～240 h，AWSD值增長速度趨緩，但間作綠肥處理AWSD仍高于對照。AWSD的總體變化為間作綠肥處理比對照大，表明間作綠肥處理土壤微生物群落代謝快，提高了土壤微生物群落對碳源的利用能力，活性最強(qiáng)。

圖1 茶園土壤微生物平均顏色變化率隨培養(yǎng)時間的變化Figure 1 Changes in the average color change rate of soil microorganisms in tea garden with cultivation time

2.2 土壤微生物群落利用不同碳源的特征

31種碳源根據(jù)碳源底物的官能團(tuán)、微生物的代謝途徑以及生態(tài)功能分為6類，分別為糖類、氨基酸、胺類、酚酸類、聚合物和羧酸類。由圖2可知，土壤微生物對6類碳源的利用率隨培養(yǎng)時間的推移而增加，表明茶園間作綠肥提高了土壤微生物群落對碳源的利用率。

圖2 茶園土壤微生物不同碳源利用強(qiáng)度Figure 2 Different carbon source utilization intensities of tea garden soil microorganisms

試驗結(jié)果還表明，不同處理土壤微生物利用6類碳源的能力上具有差異。對照土壤微生物對不同碳源的利用水平由高到低依次為羧酸類、氨基酸類、聚合物、糖類、酚酸類和胺類，而間作綠肥處理對不同類碳源的利用水平中酚酸類高于糖類，其他與對照無差異。間作綠肥處理對聚合物的利用強(qiáng)度顯著高于對照（p＜0.05）,同時提高了羧酸類、氨基酸類、酚酸類、糖類和胺類的利用強(qiáng)度，但差異不顯著（p＞ 0.05）（圖3）。

圖3 培養(yǎng)168 h微生物對碳源的利用強(qiáng)度（AWSD）Figure 3 Utilization intensity of carbon sources by microorganisms cultured for 168 h

圖 4 茶園間作綠肥對土壤微生物群落碳源利用主成分分析Figure 4 Principal component analysis of carbon source utilization by soil microbial communities under intercropping green manure in tea gardens

2.3 土壤微生物群落功能的多樣性

間作綠肥處理茶園土壤微生物Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)稍低于對照，但是兩者間差異不顯著（表1）。

表1 間作綠肥處理茶園土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indexes of soil microbial communities in tea gardens treated with intercropping green manure

2.4 土壤微生物群落功能多樣性主成分分析

以培養(yǎng)168 h處理測定數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，提取了3個主成分，第一主成分（PC1）為48.08%，第二主成分（PC2）為19.08%，第三主成分（PC3）為15.72%，3個主成分累計貢獻(xiàn)率為82.88%，可解釋變量的大部分信息（表2）。

表2 方差分解的主成分提取分析Table 2 Analysis of principal component extraction of variance decomposition

選前兩個主成分PC1和PC2來表征間作綠肥處理對土壤微生物碳源代謝影響（圖4）。GM處理主要分布PC1正端，CK則分布在負(fù)端，PC1可以區(qū)分不同處理茶園土壤微生物群落碳源代謝差異。

載荷值越大，表明該碳源對主成分的影響越大。由表3可知，除β-甲基-D-葡萄糖苷和1-磷酸葡萄糖外，其他29種碳源與PC1、PC2或PC3有高的相關(guān)性（載荷絕對值 ＞ 0.6）。PC1中影響較大的碳源有20種，主要包括7種糖類（D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、I-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙?；?D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、α-D-乳糖、D,L- α-磷酸甘油）、3種氨基酸（L-天門冬酰胺、L-苯基丙氨酸和L-蘇氨酸）、1種胺類（苯乙胺）、2種酚酸類（2-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲酸）、2種聚合物（吐溫40、吐溫80）和5種羧酸類（丙酮酸甲脂、D-半乳糖醛酸、γ-羥基丁酸、D-葡萄糖胺酸和衣康酸），其中L-蘇氨酸的貢獻(xiàn)值最大。PC2中影響較大的碳源有5種，分別為糖類1種（D -木糖）、氨基酸1種（L-絲氨酸）、聚合物2種（α-環(huán)式糊精和肝糖）與羧酸類1種（D-蘋果酸），其中L-絲氨酸的貢獻(xiàn)值最大。PC3中影響較大的碳源有5種，包括糖類1種（I-赤蘚糖醇）、氨基酸2種（L-精氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸）、胺類1種（腐胺）及羧酸類1種（α-丁酮酸），其中α-丁酮酸的貢獻(xiàn)值最大。

表3 31種碳源的主成分載荷因子Table 3 Principal component load factors of 31 carbon sources

2.5 土壤微生物與土壤理化性狀的關(guān)系

由表4可知，糖類與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），胺類與有機(jī)質(zhì)顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），聚合物與土壤全氮極顯著正相關(guān)（p＜ 0.01）、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），羧酸類與有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），酚酸類與有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），6類碳源與堿解氮、速效磷和速效鉀的相關(guān)性均不顯著（p＞ 0.05）。

表4 6類碳源與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between 6 types of carbon sources and soil physicochemical properties

3 結(jié)論

以新建茶園土壤為試驗對象，采用Biolog-ECO微平板法探討了茶園間作綠肥土壤微生物功能多樣性的變化。得到如下結(jié)論：（1）AWCD值變化表現(xiàn)為間作綠肥處理比未間作綠肥處理變化大；（2）茶園土壤微生物對羧酸類、氨基酸類和聚合物類的利用高于其他類碳源的利用，間作綠肥處理對碳源的利用強(qiáng)度均高于對照（未間作綠肥處理），兩者在聚合物的利用強(qiáng)度差異達(dá)顯著（p＜ 0.05）,同時間作綠肥處理對酚酸類化合物的利用強(qiáng)度高于糖類，而對照糖類的利用強(qiáng)度高于酚酸類。