王 華，傅海平*，周品謙，莫澤東，王沅江*

1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.安化縣土壤肥料工作站，湖南 安化 413500

土壤微生物是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)的重要驅(qū)動(dòng)因子[1]，是“植物-土壤微生物-土壤養(yǎng)分”系統(tǒng)的聯(lián)系紐帶[2]，是衡量土壤質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)[3]，因此微生物多樣性對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。大量研究表明，不同種植模式和作物均會(huì)不同程度地影響土壤微生物群落[4]，合適的農(nóng)藝措施對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的調(diào)控起積極作用[5]。間作是茶園特別是幼齡茶園的一種栽培模式，其利用生態(tài)位的分離將光、熱、水、養(yǎng)分等資源實(shí)現(xiàn)最大化利用。目前，關(guān)于茶園間作模式的研究主要集中在茶樹(shù)生長(zhǎng)[6]、茶園生態(tài)環(huán)境[7]、土壤養(yǎng)分[8]、土壤酶活性[9]等方面，對(duì)間作模式茶園土壤微生物群落的研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，間作生態(tài)系統(tǒng)中的作物對(duì)土壤中微生物的多樣性產(chǎn)生影響，而土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能對(duì)系統(tǒng)養(yǎng)分的利用產(chǎn)生影響[10]。

目前，研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多采用高通量測(cè)序（High-throughput sequencing）、末端限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、磷脂脂肪酸法（PLFA）等分子生物學(xué)方法，其能夠體現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)信息，但不能獲取微生物代謝功能。Biolog-ECO技術(shù)是解析微生物對(duì)不同種類(lèi)碳源利用多樣性及評(píng)價(jià)微生物群落功能多樣性與代謝活性的方法[11]，在土壤微生物多樣性研究中廣泛應(yīng)用[12-13]。而在茶園間作綠肥對(duì)土壤微生物代謝功能的影響方面，鮮見(jiàn)研究報(bào)道。本試驗(yàn)以間作綠肥茶園為研究對(duì)象，采用Biolog-ECO技術(shù)探討土壤微生物群落代謝功能的差異性，旨在揭示間作綠肥茶園土壤微生物群落特征，探明綠肥對(duì)茶園土壤微生物群落的影響，為綠肥在茶園的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)在湖南省茶葉研究所長(zhǎng)沙縣高橋鎮(zhèn)試驗(yàn)基地（N 28°28′40.9′′、E 113°20′23.8′′）。茶樹(shù)品種為‘黃金茶2號(hào)’，種植規(guī)格雙行雙株（行距160 cm），種植時(shí)間2017年。土壤類(lèi)型為黃壤，土壤肥力（0～20 cm）：pH 4.84，有機(jī)質(zhì)含量為19.0 g/kg，全氮含量為1.27 g/kg，堿解氮含量為89.0 mg/kg，有效磷含量為4.07 mg/kg，速效鉀含量為143.0 mg/kg。

試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理：間作綠肥（GM）與未間作綠肥（CK）。間作綠肥處理：每年10—11月種植毛葉苕子，4月種植田菁，每個(gè)處理均3次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)面積50 m2。分別采用刈割開(kāi)溝翻壓還田的方式。其他田間管理措施一致。

1.2 土壤樣品采集

采用S形布點(diǎn)法。選5個(gè)點(diǎn)，用土鉆取0～20 cm土層土樣，剔除石塊、植物殘根等雜物后將土壤樣品混勻后分成2份，一份4℃保存，用于Biolog碳源利用、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的測(cè)定；另一份風(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤理化性狀測(cè)定

pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀等分別采用電位法（水浸）、電熱板加熱-重鉻酸鉀容量法、凱氏蒸餾法、堿解擴(kuò)散法、NH4F-HCl浸提-鉬銻抗比色法、NH4OAc浸提-火焰光度法測(cè)定[16]。硝態(tài)氮與銨態(tài)氮的測(cè)定采用LY/T 1228—2015方法進(jìn)行。

1.3.2 Biolog-ECO檢測(cè)

稱(chēng)取10.0 g新鮮土樣置于裝有90 mL已滅菌生理鹽水（0.85%NaCl）的三角瓶?jī)?nèi)，在轉(zhuǎn)速200 r/min下振蕩30 min，靜置10 min后用生理鹽水（0.85%NaCl）稀釋到10-3，將稀釋好的土壤懸濁液150 μL接種到Biolog-Eco板（BIOLOG，Hayward，USA）的每個(gè)微孔中，接種后的ECO板在25℃下培養(yǎng)。每隔24 h用Biolog Reader儀（BIOLOG，Hayward，USA）測(cè)定波長(zhǎng)590 nm和750 nm的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

土壤微生物碳源利用率平均吸光值：AWCD =∑(Ci-R)/n。

Shannon多樣性指數(shù)（H）：H= -∑PilnPi。

碳源利用豐富度指數(shù)（S）= 被利用碳源的總數(shù)。碳源利用豐富度指數(shù)即顏色變化的孔數(shù)，吸光值小于0.25視為顏色沒(méi)有變化。

Pielou均勻度指數(shù)（E）：E=H/lnS。

Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）：D=1-∑P2i。

McIntosh指數(shù)（U）：

豐富度指數(shù)S＝被利用碳源的總數(shù)目（C-R＞0.2的孔數(shù)）。

其中：Ci為第i孔的相對(duì)吸光值；R為對(duì)照孔的吸光值；n為碳源種類(lèi)數(shù)；S為被利用的碳源總數(shù)；Pi為第i孔與對(duì)照孔的相對(duì)吸光值差與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比值。

采用SPSS 22.0進(jìn)行方差（LSD檢驗(yàn)法）和主成分分析，Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 間作綠肥處理土壤微生物對(duì)碳源的利用

由圖1可知，土壤微生物群落隨培養(yǎng)時(shí)間的推移AWSD呈上升趨勢(shì)，其中48 h內(nèi)其值均較低，碳源的利用較弱，處理間沒(méi)有差異。48～120 h，不同處理AWSD值均呈快速增長(zhǎng)，且間作綠肥處理增長(zhǎng)速度高于對(duì)照。120～240 h，AWSD值增長(zhǎng)速度趨緩，但間作綠肥處理AWSD仍高于對(duì)照。AWSD的總體變化為間作綠肥處理比對(duì)照大，表明間作綠肥處理土壤微生物群落代謝快，提高了土壤微生物群落對(duì)碳源的利用能力，活性最強(qiáng)。

圖1 茶園土壤微生物平均顏色變化率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Figure 1 Changes in the average color change rate of soil microorganisms in tea garden with cultivation time

2.2 土壤微生物群落利用不同碳源的特征

31種碳源根據(jù)碳源底物的官能團(tuán)、微生物的代謝途徑以及生態(tài)功能分為6類(lèi)，分別為糖類(lèi)、氨基酸、胺類(lèi)、酚酸類(lèi)、聚合物和羧酸類(lèi)。由圖2可知，土壤微生物對(duì)6類(lèi)碳源的利用率隨培養(yǎng)時(shí)間的推移而增加，表明茶園間作綠肥提高了土壤微生物群落對(duì)碳源的利用率。

圖2 茶園土壤微生物不同碳源利用強(qiáng)度Figure 2 Different carbon source utilization intensities of tea garden soil microorganisms

試驗(yàn)結(jié)果還表明，不同處理土壤微生物利用6類(lèi)碳源的能力上具有差異。對(duì)照土壤微生物對(duì)不同碳源的利用水平由高到低依次為羧酸類(lèi)、氨基酸類(lèi)、聚合物、糖類(lèi)、酚酸類(lèi)和胺類(lèi)，而間作綠肥處理對(duì)不同類(lèi)碳源的利用水平中酚酸類(lèi)高于糖類(lèi)，其他與對(duì)照無(wú)差異。間作綠肥處理對(duì)聚合物的利用強(qiáng)度顯著高于對(duì)照（p＜0.05）,同時(shí)提高了羧酸類(lèi)、氨基酸類(lèi)、酚酸類(lèi)、糖類(lèi)和胺類(lèi)的利用強(qiáng)度，但差異不顯著（p＞ 0.05）（圖3）。

圖3 培養(yǎng)168 h微生物對(duì)碳源的利用強(qiáng)度（AWSD）Figure 3 Utilization intensity of carbon sources by microorganisms cultured for 168 h

圖 4 茶園間作綠肥對(duì)土壤微生物群落碳源利用主成分分析Figure 4 Principal component analysis of carbon source utilization by soil microbial communities under intercropping green manure in tea gardens

2.3 土壤微生物群落功能的多樣性

間作綠肥處理茶園土壤微生物Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)稍低于對(duì)照，但是兩者間差異不顯著（表1）。

表1 間作綠肥處理茶園土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indexes of soil microbial communities in tea gardens treated with intercropping green manure

2.4 土壤微生物群落功能多樣性主成分分析

以培養(yǎng)168 h處理測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，提取了3個(gè)主成分，第一主成分（PC1）為48.08%，第二主成分（PC2）為19.08%，第三主成分（PC3）為15.72%，3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為82.88%，可解釋變量的大部分信息（表2）。

表2 方差分解的主成分提取分析Table 2 Analysis of principal component extraction of variance decomposition

選前兩個(gè)主成分PC1和PC2來(lái)表征間作綠肥處理對(duì)土壤微生物碳源代謝影響（圖4）。GM處理主要分布PC1正端，CK則分布在負(fù)端，PC1可以區(qū)分不同處理茶園土壤微生物群落碳源代謝差異。

載荷值越大，表明該碳源對(duì)主成分的影響越大。由表3可知，除β-甲基-D-葡萄糖苷和1-磷酸葡萄糖外，其他29種碳源與PC1、PC2或PC3有高的相關(guān)性（載荷絕對(duì)值 ＞ 0.6）。PC1中影響較大的碳源有20種，主要包括7種糖類(lèi)（D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、I-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙?；?D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、α-D-乳糖、D,L- α-磷酸甘油）、3種氨基酸（L-天門(mén)冬酰胺、L-苯基丙氨酸和L-蘇氨酸）、1種胺類(lèi)（苯乙胺）、2種酚酸類(lèi)（2-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲酸）、2種聚合物（吐溫40、吐溫80）和5種羧酸類(lèi)（丙酮酸甲脂、D-半乳糖醛酸、γ-羥基丁酸、D-葡萄糖胺酸和衣康酸），其中L-蘇氨酸的貢獻(xiàn)值最大。PC2中影響較大的碳源有5種，分別為糖類(lèi)1種（D -木糖）、氨基酸1種（L-絲氨酸）、聚合物2種（α-環(huán)式糊精和肝糖）與羧酸類(lèi)1種（D-蘋(píng)果酸），其中L-絲氨酸的貢獻(xiàn)值最大。PC3中影響較大的碳源有5種，包括糖類(lèi)1種（I-赤蘚糖醇）、氨基酸2種（L-精氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸）、胺類(lèi)1種（腐胺）及羧酸類(lèi)1種（α-丁酮酸），其中α-丁酮酸的貢獻(xiàn)值最大。

表3 31種碳源的主成分載荷因子Table 3 Principal component load factors of 31 carbon sources

2.5 土壤微生物與土壤理化性狀的關(guān)系

由表4可知，糖類(lèi)與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），胺類(lèi)與有機(jī)質(zhì)顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），聚合物與土壤全氮極顯著正相關(guān)（p＜ 0.01）、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），羧酸類(lèi)與有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），酚酸類(lèi)與有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮顯著正相關(guān)（p＜ 0.05），6類(lèi)碳源與堿解氮、速效磷和速效鉀的相關(guān)性均不顯著（p＞ 0.05）。

表4 6類(lèi)碳源與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between 6 types of carbon sources and soil physicochemical properties

3 結(jié)論

以新建茶園土壤為試驗(yàn)對(duì)象，采用Biolog-ECO微平板法探討了茶園間作綠肥土壤微生物功能多樣性的變化。得到如下結(jié)論：（1）AWCD值變化表現(xiàn)為間作綠肥處理比未間作綠肥處理變化大；（2）茶園土壤微生物對(duì)羧酸類(lèi)、氨基酸類(lèi)和聚合物類(lèi)的利用高于其他類(lèi)碳源的利用，間作綠肥處理對(duì)碳源的利用強(qiáng)度均高于對(duì)照（未間作綠肥處理），兩者在聚合物的利用強(qiáng)度差異達(dá)顯著（p＜ 0.05）,同時(shí)間作綠肥處理對(duì)酚酸類(lèi)化合物的利用強(qiáng)度高于糖類(lèi)，而對(duì)照糖類(lèi)的利用強(qiáng)度高于酚酸類(lèi)。