田海瑞,汪晶晶,李曉曉,張丹琛,鄒康

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)干細(xì)胞研究與轉(zhuǎn)化中心/動(dòng)物科技學(xué)院生殖干細(xì)胞與微環(huán)境實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

豬因在解剖學(xué)和生理學(xué)與人類高度相似,如飲食、肥胖傾向、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和有氧運(yùn)動(dòng)的血液循環(huán)系統(tǒng)[1],經(jīng)常被用作動(dòng)物模型進(jìn)行生理和藥理學(xué)研究。因公豬連續(xù)產(chǎn)生大量配子的必要性,人們對(duì)精子發(fā)生提出了更高的要求:在整個(gè)生命周期,需要一個(gè)活躍的干細(xì)胞群,以高水平的組織協(xié)調(diào)來(lái)確保精子的持續(xù)供應(yīng)。這個(gè)干細(xì)胞群為精原干細(xì)胞群(spermatogonial stem cells,SSC):通過(guò)自我更新維持自身細(xì)胞數(shù)目的平衡,以及分化產(chǎn)生不同等級(jí)的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精細(xì)胞。一般認(rèn)為分化程度最低的精原細(xì)胞即 Asingle(As)型精原細(xì)胞為SSC,在曲細(xì)精管的基底膜上以單個(gè)細(xì)胞的形式存在。SSC在轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)和建立豬再生醫(yī)學(xué)模型方面具有重要價(jià)值,然而由于其數(shù)量少及體外無(wú)法長(zhǎng)期培養(yǎng),導(dǎo)致豬精原干細(xì)胞(pSSC)的研究和應(yīng)用受到了極大阻礙。pSSC在不同飼養(yǎng)層上培養(yǎng),生長(zhǎng)狀態(tài)不同,大多研究將支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物體內(nèi),支持細(xì)胞是SSC微環(huán)境的重要組成部分,在維持SSC自我更新和分化平衡及睪丸穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。支持細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glia cell-derived neurotrophic factor,GDNF)和成纖維細(xì)胞因子2(fibroblast growth factor,FGF2),對(duì)維持SSC的存活和自我更新至關(guān)重要[2-3];此外,支持細(xì)胞產(chǎn)生的干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)、維甲酸(retinoic acid,RA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)也可以誘導(dǎo)精原細(xì)胞分化。因此,支持細(xì)胞分泌的調(diào)控因子是影響精原干細(xì)胞命運(yùn)的一種重要物質(zhì)。

外泌體是直徑為30～150 nm的細(xì)胞外囊泡,被脂質(zhì)雙分子層包裹各種生物分子,包括蛋白質(zhì)、聚糖、脂質(zhì)、代謝物以及核酸。隨著對(duì)外泌體的深入研究,其在細(xì)胞間的通訊作用受到廣泛關(guān)注,包括免疫應(yīng)答、蛋白核酸轉(zhuǎn)移[4]、衰老[5]、增殖分化[6]等。例如:外泌體攜帶的miRNA能夠協(xié)調(diào)腫瘤代謝微環(huán)境,可作為腫瘤診斷的標(biāo)記物,甚至外泌體“物質(zhì)傳遞”的特性可以用于腫瘤治療[7];癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以將信息傳遞給基質(zhì)成纖維細(xì)胞,促使其分化為肌成纖維細(xì)胞[8];前列腺癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體在局部腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可顯著減少正常細(xì)胞凋亡、增加癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞遷移[9]。外泌體在雄性生殖系統(tǒng)也發(fā)揮生物學(xué)功能,前列腺體將膜成分以及遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到精子,增加精子活力,同時(shí)避免過(guò)早獲能和自發(fā)的頂體反應(yīng),保護(hù)精子免受女性生殖道的免疫反應(yīng)[10]。附睪小體在精漿和精子間的通訊中發(fā)揮作用,能夠改變精子膜的脂質(zhì)組成,從而有助于精子獲得運(yùn)動(dòng)潛力和穿透透明帶的能力[11]。此外,外泌體成為治療不孕癥的新嘗試,在受損精子和治療弱精子癥方面發(fā)揮作用。例如:無(wú)精癥大鼠注射羊水來(lái)源外泌體后,精子發(fā)生改善,恢復(fù)精子參數(shù)(如,運(yùn)動(dòng)性、濃度以及精原細(xì)胞與精母細(xì)胞的數(shù)量),并最終恢復(fù)雄性生育能力[12];犬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)犬精子冷凍損傷以及對(duì)解凍后精子參數(shù)的改善發(fā)揮積極作用[13]。然而,有關(guān)外泌體在雄性生殖的研究更多側(cè)重于生殖細(xì)胞發(fā)育、精子功能和附睪成熟,對(duì)SSC命運(yùn)的調(diào)控關(guān)注甚少,尤其是外泌體是否能夠調(diào)控豬精原干細(xì)胞命運(yùn)這一問(wèn)題亟待解答。

為了優(yōu)化豬精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件,進(jìn)一步探究影響精原干細(xì)胞命運(yùn)的因素,了解支持細(xì)胞對(duì)精原干細(xì)胞調(diào)控的分子機(jī)制,本試驗(yàn)擬分離豬支持細(xì)胞并提取豬支持細(xì)胞外泌體,用外泌體抑制劑(GW4869)處理支持細(xì)胞,再與pSSC共培養(yǎng),探究支持細(xì)胞外泌體對(duì)豬精原干細(xì)胞命運(yùn)的影響因素,為優(yōu)化豬精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法及體內(nèi)調(diào)控精子發(fā)生提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所用的豬睪丸來(lái)自7日齡的雄性長(zhǎng)白豬。由豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)人員采集睪丸組織,浸泡于含雙抗的PBS中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。所有動(dòng)物試驗(yàn)和程序均經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

倒置顯微鏡購(gòu)于OLYMPUS公司,超凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇凈安泰公司,高速冷凍離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司,超速離心機(jī)為貝克曼庫(kù)爾特Optima系列;GW4869購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司,維生素、胎牛血清、膠原酶、非必需氨基酸、胎牛血清、F12/DMEM培養(yǎng)基、胰酶均購(gòu)于Gibco公司,紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司,巰基乙醇、L-谷氨酰胺和FGF2、GDNF、GFRA1等生長(zhǎng)因子購(gòu)于Sigma公司,青霉素購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,TRNzol Universal試劑購(gòu)于天根生化科技有限公司。

pSSC培養(yǎng)液:F12/DMEM培養(yǎng)基、10 g·L-1維生素、5×10-5mol·L-1巰基乙醇、10%胎牛血清、5 g·L-1青霉素、10 ng·mL-1FGF2、10 ng·mL-1GDNF、10 ng·mL-1GFRA1。

支持細(xì)胞培養(yǎng)液:F12/DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、0.5%青霉素、1%非必需氨基酸、5×10-5mol·L-1巰基乙醇。

1.3 豬精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞的分離

在不破壞睪丸表面膜結(jié)構(gòu)的情況下,將睪丸外周附睪、脂肪等組織剝離,去除表面白膜和中心白色結(jié)締組織后用眼科剪將組織剪碎,加入膠原酶吹散后放入CO2培養(yǎng)箱中37 ℃消化。每隔10 min取出重新吹散,消化至無(wú)組織團(tuán)塊,總時(shí)間約30 min。加入紅細(xì)胞裂解液,4 ℃處理15 min。離心后加入胰酶消化5 min,用10% FBS終止消化,離心,得到睪丸總細(xì)胞。

分離精原干細(xì)胞:將睪丸總細(xì)胞用支持細(xì)胞培養(yǎng)液重懸,分別在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)15 min、30 min、2 h進(jìn)行差異貼壁,離心,將培養(yǎng)液換成pSSC培養(yǎng)液后培養(yǎng)過(guò)夜。次日鋪到絲裂霉素處理好的支持細(xì)胞上繼續(xù)培養(yǎng)。

分離支持細(xì)胞:將睪丸總細(xì)胞用支持細(xì)胞培養(yǎng)液重懸,在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4 h后吸去上清液并去除未貼壁的雜細(xì)胞,換培養(yǎng)液過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行低滲處理,得到純化的支持細(xì)胞。

1.4 外泌體的提取

體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞在培養(yǎng)密度接近60%～70%時(shí),將支持細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無(wú)血清培養(yǎng)液,培養(yǎng) 48 h 后收集細(xì)胞上清液,采用差速離心法提取外泌體。具體方法:300g離心10 min,去除細(xì)胞;2 000g離心10 min,去除死細(xì)胞;10 000g離心30 min,去除細(xì)胞碎片;120 000g離心90 min,得到沉淀即為外泌體,再用PBS重懸、漂洗,120 000g再離心90 min,得到外泌體沉淀。

1.5 支持細(xì)胞外泌體分泌的抑制

GW4869母液的配制:將5 mg GW4869加入158 μL二甲基亞砜(DMSO),配制成100 mmol·L-1GW4869母液,避光-80 ℃保存。

支持細(xì)胞外泌體的分泌抑制:用無(wú)血清培養(yǎng)液分別配制5、10、20、50和100 μmol·L-1GW4869。將支持細(xì)胞接種到60 mm或者100 mm培養(yǎng)皿中,放入CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度大概鋪滿培養(yǎng)皿底部約60%時(shí),去除培養(yǎng)液后用D-Hanks洗3次。分別加入5、10、20、50和100 μmol·L-1GW4869,CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。

比較2組患者治療前治療后3月及6月時(shí)腫瘤體積;比較2組患者治療前、治療后12月時(shí)的甲胎蛋白(AFP)水平，2組患者術(shù)后并發(fā)癥、治療后3月時(shí)的腫瘤完全壞死率及治療后1、2及3年生存率。腫瘤體積以CT測(cè)量為準(zhǔn)，V=πabc/6 cm3(V為體積，a、b、c 為腫瘤的長(zhǎng)、寬、高)，于治療前、治療后12月時(shí)，采集患者空腹靜脈血，分離血清，采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定AFP水平。

1.6 RNA 提取、cDNA合成和逆轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)

采用 Trizol法提取睪丸組織及細(xì)胞樣品總RNA。采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme)合成 cDNA。參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),以GAPDH為內(nèi)參,用ddH2O作陰性對(duì)照。本試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 The primer sequences used in the experiment

1.7 睪丸組織、外泌體和細(xì)胞蛋白的提取及Western Blot 分析

將睪丸組織、細(xì)胞或外泌體加入配制好的 Ripa 裂解液(含 5 g·L-1的 PMSF 和 DTT),置于搖床上,冰浴裂解15 min。用無(wú)菌1.5 mL EP管收集樣品并加入蛋白變性緩沖液進(jìn)行蛋白變性。取出配制好的蛋白免疫印跡凝膠,上樣后80 V 電泳20 min后調(diào)整電壓為120 V,根據(jù)試驗(yàn)所需進(jìn)行電泳時(shí)間的控制。電泳結(jié)束后根據(jù)試驗(yàn)需要切膠,裁剪適當(dāng)大小的PVDF膜和濾紙,按照負(fù)極-纖維墊-濾紙-膠-膜-濾紙-纖維墊-正極的組裝方式組裝,然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜用TBST 洗滌1 min,轉(zhuǎn)入5%脫脂奶粉,室溫封閉1～2 h。加一抗(根據(jù)試驗(yàn)需要選擇稀釋比例)孵育,4 ℃冰箱過(guò)夜。TBST洗膜3次后加二抗(1∶5 000 稀釋)并室溫孵育1 h,TBST 洗膜3次,暗室中加入 ECL 顯示免疫條帶,用膠片按壓曝光條帶?？贵w信息見(jiàn)表2。

表2 所用抗體信息Table 2 Detail of antibodies

1.8 免疫熒光檢測(cè)支持細(xì)胞、pSSC及外泌體

將支持細(xì)胞或pSSC鋪到96孔板,在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng),免疫熒光檢測(cè)時(shí)將培養(yǎng)液去除,用PBS清洗2～3次。用卡諾固定液-20 ℃固定20 min;免疫熒光檢測(cè)外泌體存在時(shí)用4%中性福爾馬林對(duì)支持細(xì)胞進(jìn)行固定,室溫條件放置15 min;去除固定液,用PBS洗2～3次。用10% 的山羊血清37 ℃封閉 30 min;一抗(支持細(xì)胞特異性標(biāo)記物WT1和ITGB1,SSC特異性標(biāo)記物PLZF和DDX4,外泌體特異性標(biāo)記物HSP70)用含1%山羊血清的PBS按1∶200進(jìn)行配制,隨后用其孵育細(xì)胞,并將96孔板放入濕盒中,4 ℃冰箱中過(guò)夜。PBS洗3 次后避光加入二抗(用含1%山羊血清的PBS按1∶500進(jìn)行配制)37 ℃孵育 60 min;PBS洗3次后避光加入hoechst33342(1∶500),37 ℃孵育15 min,PBS洗3次后加入抗淬滅劑,置于濕盒中,使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 豬支持細(xì)胞的分離與鑒定

如圖1-A所示,7日齡仔豬睪丸經(jīng)過(guò)兩步酶消化以及低滲純化處理后得到支持細(xì)胞。低滲處理時(shí),細(xì)胞并未完全伸展開(kāi),呈現(xiàn)不規(guī)則狀,再培養(yǎng)1 d后,細(xì)胞完全伸展,形態(tài)多為規(guī)則的梭形。

圖1 豬支持細(xì)胞的分離純化培養(yǎng)以及鑒定Fig.1 Isolation,purification,culture and identification of porcine Sertoli cells(SC)A.支持細(xì)胞分離純化與培養(yǎng)Isolation,purification and culture of Sertoli cells(SC);B. 免疫熒光檢測(cè)支持細(xì)胞特異性標(biāo)記物WT1、ITGB1(100×)Immunofluorescence detection of Sertoli cells markers WT1,ITGB1(100×);C. 細(xì)胞WT1和ITGB1陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)Analysis of the positive rate of WT1 and ITGB1,respectively;D.RT-PCR檢測(cè)支持細(xì)胞特異性標(biāo)記物WT1、AR、ITGB1、SOX9 RT-PCR detection of Sertoli cells markers WT1,AR,ITGB1,SOX9.

通過(guò)IF對(duì)分離得到的支持細(xì)胞進(jìn)行了純度分析,如圖1-B。用支持細(xì)胞特異性標(biāo)記物WT1和ITGB1進(jìn)行標(biāo)記,WT1陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)到(87.1±0.02)%,ITGB1陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)到(94.2±0.01)%(圖1-C);同時(shí),RT-PCR結(jié)果顯示分離的細(xì)胞表達(dá)支持細(xì)胞特異性標(biāo)記物WT1、AR、ITBG1、SOX9基因(圖1-D)。以上結(jié)果表明高效分離并純化了豬的支持細(xì)胞。

2.2 豬支持細(xì)胞外泌體的鑒定

研究表明,如果細(xì)胞具有質(zhì)膜的離散區(qū)域,這些區(qū)域富含外泌體和內(nèi)體蛋白,可以作為外泌體生物發(fā)生位點(diǎn)[14],這個(gè)位點(diǎn)可以通過(guò)免疫熒光檢測(cè)。因此,我們將分離得到的支持細(xì)胞經(jīng)過(guò)中性福爾馬林固定,不進(jìn)行透膜處理,用外泌體標(biāo)記蛋白TSG101標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞膜表面有明顯的 TSG101信號(hào)堆積(圖2-A)。

圖2 豬支持細(xì)胞外泌體免疫熒光(A)和Western blot(B)檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Immunofluorescence(A)and Western blot(B)detection of exosomes secreted by porcine Sertoli cells(SC)黃色箭頭標(biāo)識(shí)TSG101陽(yáng)性信號(hào)。Yellow arrows identify positive signals for TSG101.

為進(jìn)一步驗(yàn)證支持細(xì)胞分泌外泌體,利用Western blot技術(shù)檢測(cè)到了外泌體標(biāo)記蛋白TSG101、ALIX、HSP70的表達(dá)(圖2-B)。以上結(jié)果均證明豬支持細(xì)胞分泌外泌體。

2.3 精原干細(xì)胞的分離與鑒定

如圖3-A所示,pSSC在培養(yǎng)前期以單細(xì)胞為主,細(xì)胞邊界明顯,呈規(guī)則的圓形。在培養(yǎng)5～6 d后,pSSC會(huì)形成葡萄狀的細(xì)胞克隆,但單個(gè)細(xì)胞仍保持清晰的邊界,且為規(guī)則的圓形。如圖3-B所示,免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),pSSC表達(dá)豬精原干細(xì)胞特異性蛋白DDX4和PLZF。統(tǒng)計(jì)顯示PLZF陽(yáng)性細(xì)胞率為(80.6±0.02)%(圖3-C)。另外RT-PCR結(jié)果也表明pSSC有表達(dá)豬精原干細(xì)胞特異性標(biāo)記物THY1、PLZF、DDX4、KIT基因mRNA(圖3-D)。以上均證明分離得到的細(xì)胞為純度較高的豬精原干細(xì)胞。

2.4 GW4869抑制支持細(xì)胞外泌體分泌

GW4869是膜中性鞘磷脂酶(N-SMase2)的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,可保護(hù)細(xì)胞免受神經(jīng)酰胺積累介導(dǎo)的凋亡。由于N-SMase2對(duì)外泌體的分泌至關(guān)重要,GW4869可作為外泌體的抑制劑。為確定GW4869合適濃度,防止GW4869濃度過(guò)大導(dǎo)致細(xì)胞死亡而影響外泌體的分泌,根據(jù)之前報(bào)道[15-17],本試驗(yàn)分別選用了5、10、20、50和100 μmol·L-1GW4869處理豬支持細(xì)胞,結(jié)果如圖4-A所示。5、10、20 μmol·L-1GW4869處理細(xì)胞后,細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)生明顯變化,但50和100 μmol·L-1GW4869處理細(xì)胞后,細(xì)胞表面出現(xiàn)很多點(diǎn)狀斑點(diǎn),細(xì)胞狀態(tài)出現(xiàn)明顯損傷現(xiàn)象,且細(xì)胞死亡量增多,最終選擇了20 μmol·L-1GW4869。

另外,為檢測(cè)20 μmol·L-1GW4869對(duì)豬支持細(xì)胞外泌體的抑制情況,將20 μmol·L-1GW4869處理的支持細(xì)胞作為試驗(yàn)組,無(wú)處理的支持細(xì)胞為對(duì)照組,處理48 h后提取外泌體,通過(guò)Western blot檢測(cè)分析 2組細(xì)胞外泌體的分泌情況,結(jié)果如圖4-B所示。與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組的外泌體TSG101、HSP70、ALIX表達(dá)量均下降。以上結(jié)果表明20 μmol·L-1GW4869可以有效抑制支持細(xì)胞外泌體的分泌。

2.5 支持細(xì)胞外泌體影響pSSC自我更新及分化

用20 μmol·L-1GW4869處理支持細(xì)胞48 h,去除 GW4869后作為飼養(yǎng)層與pSSC進(jìn)行共培養(yǎng)。如圖5-A 所示:與對(duì)照組相比,處理組的pSSC在共培養(yǎng)1 d時(shí)部分細(xì)胞呈現(xiàn)不透亮狀態(tài);共培養(yǎng)3 d后試驗(yàn)組pSSC狀態(tài)變差,大多細(xì)胞呈現(xiàn)不透亮狀態(tài),且較對(duì)照組不貼壁的細(xì)胞克隆變多。收集共培養(yǎng)3 d的細(xì)胞,提取RNA,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)pSSC的標(biāo)志基因表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),pSSC中PLZF基因表達(dá)顯著升高;KIT、THY1、DDX4基因表達(dá)水平顯著降低(圖5-B、C)。此外,收集細(xì)胞蛋白,利用Western blot技術(shù)檢測(cè)了豬精原干細(xì)胞PGP9.5和DDX4蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在處理組支持細(xì)胞上共培養(yǎng)的pSSC,PGP9.5蛋白表達(dá)水平顯著升高,DDX4蛋白表達(dá)顯著下降,與RT-PCR結(jié)果一致(圖5-D、E)。上述結(jié)果表明,體外培養(yǎng)抑制支持細(xì)胞外泌體的分泌,pSSC分化能力受到抑制,細(xì)胞趨向自我更新方向發(fā)展,支持細(xì)胞分泌的外泌體傾向于促進(jìn)pSSC的分化。

圖5 利用支持細(xì)胞-pSSC共培養(yǎng)模型檢測(cè)外泌體對(duì)pSSC的影響Fig.5 Detection of the function of exosomes on pSSC using Sertoli cells-pSSC co-culture modelA. pSSC與支持細(xì)胞共培養(yǎng)(黃色箭頭標(biāo)識(shí)不貼壁的細(xì)胞)pSSC co-culture with Sertoli cells(yellow arrows identify non-adherent cells);B、C. RT-PCR檢測(cè)pSSC標(biāo)志基因的表達(dá)RT-PCR detection of the expression of pSSC marker gene;D、E. Western blot檢測(cè)pSSC標(biāo)志蛋白的表達(dá)Western blot detection of the expression of pSSC marker protein. *P<0.05,**P<0.01.

3 討論

與嚙齒動(dòng)物相比,對(duì)畜禽的精原干細(xì)胞研究較少,未分化的豬精原細(xì)胞或pSSC的特異性標(biāo)記物尚不明確。目前關(guān)于嚙齒動(dòng)物精原細(xì)胞不同階段的分子標(biāo)志物研究較為清晰,如:PLZF蛋白在 Asingle(As)、Apaired(Apr)和 Aaligned(Aal)精原細(xì)胞中表達(dá),缺乏PLZF的小鼠精原細(xì)胞會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)逐漸喪失,但不會(huì)有明顯分化缺陷或支持細(xì)胞的喪失[18];KIT蛋白在 As、Apr和早期 Aal精原細(xì)胞中表達(dá)量較低或者并不表達(dá),而在Aal和進(jìn)一步分化的精原細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)[19];THY1蛋白已被確定為嚙齒動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的保守精原干細(xì)胞標(biāo)志物,幾乎所有THY1+細(xì)胞都是PLZF+和KIT-[20]。pSSC的一些特定生物標(biāo)志物已被鑒定,例如PGP9.5、PLZF、同源結(jié)構(gòu)蛋白(nanog homeobox,NANOG)和階段特異性胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen 1,SSEA1)。DDX4是包括豬[21]在內(nèi)的多個(gè)物種生殖細(xì)胞的特異性蛋白標(biāo)志物,被廣泛用于生殖細(xì)胞的鑒定。本試驗(yàn)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果證明當(dāng)豬支持細(xì)胞外泌體受到抑制時(shí),pSSC表現(xiàn)為THY1、KIT表達(dá)水平降低,PLZF表達(dá)水平升高;Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示PGP9.5蛋白表達(dá)水平升高,表明支持細(xì)胞外泌體受到抑制時(shí),pSSC狀態(tài)發(fā)生變化,其分化能力受到抑制,細(xì)胞向自我更新方向發(fā)展。抑制豬支持細(xì)胞的外泌體分泌導(dǎo)致pSSC的狀態(tài)變差,部分細(xì)胞呈現(xiàn)不透亮狀態(tài),并伴隨DDX4基因的表達(dá)水平降低。這一現(xiàn)象可能是GW4869破壞了外泌體對(duì)pSSC分化狀態(tài)的調(diào)控作用造成的,即已啟動(dòng)分化的精原細(xì)胞在外泌體被抑制后無(wú)法繼續(xù)分化,導(dǎo)致這些細(xì)胞失去了自我更新的能力,因此發(fā)生了凋亡,但這還需更多的試驗(yàn)驗(yàn)證。另外,是否可以利用支持細(xì)胞外泌體優(yōu)化pSSC體外培養(yǎng)條件以實(shí)現(xiàn)pSSC的長(zhǎng)期培養(yǎng),值得進(jìn)一步探究。

我們推測(cè)外泌體受到抑制引起pSSC變化與豬支持細(xì)胞有關(guān)。豬支持細(xì)胞和鼠支持細(xì)胞一樣也可以產(chǎn)生一些可溶性因子,在出生前維持性原細(xì)胞和出生后調(diào)控精原干細(xì)胞命運(yùn)至關(guān)重要。如支持細(xì)胞會(huì)分泌膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glia cell-derived neurotrophic factor,GDNF),過(guò)度表達(dá) GDNF 小鼠會(huì)導(dǎo)致未分化精原細(xì)胞的積累,即GDNF 有助于精原細(xì)胞自我更新和分化的旁分泌調(diào)節(jié)[22]。此外,有研究表明pSSC體外培養(yǎng)需要 GDNF 以外的外在因素來(lái)促進(jìn)增殖[23],如在新生大鼠睪丸細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)對(duì)生殖細(xì)胞增殖具有積極作用。對(duì)在體外培養(yǎng)pSSC的研究中發(fā)現(xiàn),在pSSC培養(yǎng)液中加入表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)對(duì) pSSC細(xì)胞克隆的形成有很大影響。在EGF存在的情況下,細(xì)胞克隆數(shù)量和覆蓋總面積增加[24]。由于目前對(duì)支持細(xì)胞外泌體成分以及外泌體如何影響pSSC命運(yùn)尚未可知,因此需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行成分分析,確定其中發(fā)揮生物功能的成分并進(jìn)一步探究其分子機(jī)制。

外泌體在調(diào)節(jié)正常生命活動(dòng)和疾病診斷治療方面具有獨(dú)特的生物學(xué)功能。首先體外注射外泌體抑制劑有利于疾病的治療,例如腹腔注射GW4869減少了小鼠敗血癥引起的心臟炎癥[25],GW4869通過(guò)阻止外泌體分泌可以減少體內(nèi)淀粉樣蛋白斑塊的形成,這有利于阿爾茨海默病的治療[26]。此外,通過(guò)外泌體靶向藥物遞送系統(tǒng)也有助于疾病的治療,例如通過(guò)基因工程改造的外泌體可用于治療乳腺癌[27],通過(guò)siRNA電穿孔改造的外泌體可用于治療胰腺癌[28]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示豬支持細(xì)胞影響pSSC自我更新及分化,這為改善種公豬生殖力研究提供了新思路,未來(lái)可以利用GW4869或外泌體靶向注射,維持pSSC自我更新及分化,保證精子發(fā)生的有序進(jìn)行,這對(duì)治療公豬無(wú)精癥、提高種公豬生殖力以及延長(zhǎng)種公豬繁殖周期有重要作用。

綜上,豬支持細(xì)胞分泌外泌體且受20 μmol·L-1GW4869的抑制,pSSC分化能力也受到抑制,細(xì)胞趨向自我更新方向發(fā)展;暗示外泌體是支持細(xì)胞調(diào)控精原干細(xì)胞狀態(tài)的一種重要方式。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探索豬支持細(xì)胞對(duì)精原干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制提供了新思路,為改善種公豬繁育力提供了新方式,也為治療雄性動(dòng)物以及人類生殖疾病提供重要參考。