張昕樂(lè),王智博,陳培勇,王遠(yuǎn)孝,張艷麗,王鋒,尤佩華,樊懿萱*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院羊業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 南京 210095;2.柏斯托化工控股集團(tuán),瑞典 馬爾默 20125;3.江蘇波杜農(nóng)牧股份有限公司,江蘇 南京 211800)

在圍產(chǎn)期,母體泌乳和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)母羊攝取營(yíng)養(yǎng)提出了巨大的挑戰(zhàn),胎兒在產(chǎn)前3周對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求達(dá)到最高水平,而這一時(shí)期,母羊的干物質(zhì)采食量卻顯著降低10%～30%[1],導(dǎo)致體內(nèi)多種營(yíng)養(yǎng)素嚴(yán)重缺乏,而能量負(fù)平衡則是這其中最為嚴(yán)重的一種營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激狀態(tài)[2]。因干物質(zhì)采食量不足引發(fā)的能量負(fù)平衡,除了采取改善日糧適口性等措施增加采食量外,還可通過(guò)增加消化系統(tǒng)對(duì)飼料的吸收利用率來(lái)緩解。瘤胃在反芻動(dòng)物的消化系統(tǒng)中扮演著最為重要的角色,其內(nèi)部的微生物菌群結(jié)構(gòu)的相對(duì)豐度將直接影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[3-4]。研究表明,通過(guò)改變母羊妊娠至斷奶的飼糧可以使羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]。Jami等[6]研究表明,出生至斷奶是犢牛瘤胃微生物菌群建立并定型的時(shí)期,在斷奶之后其多樣性逐漸趨于穩(wěn)定。瘤胃微生物不同菌群結(jié)構(gòu)會(huì)造成羔羊在營(yíng)養(yǎng)和能量代謝方面的差異,例如在揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)的合成表現(xiàn)上[7]。

三丁酸甘油酯(TB),化學(xué)式為C15H26O6,在脂肪酶的作用下可以分解為丁酸根和甘油。甘油可以被瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,其中大部分是丙酸,而丙酸又是草酰乙酸和葡萄糖的前體[8]。Guo等[9]研究表明,每頭奶牛飼糧中添加37.5 g·d-1三丁酸甘油酯不僅可以提高奶牛的生產(chǎn)性能,還對(duì)奶牛的乳房產(chǎn)生積極影響,提升圍產(chǎn)期母畜生產(chǎn)性能將直接對(duì)羔羊瘤胃功能產(chǎn)生影響。額外的營(yíng)養(yǎng)成分可以影響瘤胃核心群落結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生更多的VFA,對(duì)促進(jìn)瘤胃發(fā)育及其功能的優(yōu)化具有積極意義[10]。瘤胃在完全依賴(lài)富含纖維的食物之前會(huì)發(fā)生復(fù)雜的生理變化[11],早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)可改變幼齡動(dòng)物的微生物定殖模式[12-13],即在羔羊斷奶前通過(guò)改善母羊營(yíng)養(yǎng)狀況可以使羔羊瘤胃向積極方向改變。羔羊日糧不同的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)對(duì)其瘤胃微生物有影響,母乳補(bǔ)充TB可能會(huì)影響羔羊的瘤胃微生物[14]。本試驗(yàn)通過(guò)在能量負(fù)平衡下圍產(chǎn)期湖羊的日糧中添加三丁酸甘油酯,間接改善羔羊營(yíng)養(yǎng)攝入,探索該途徑下羔羊瘤胃發(fā)酵指標(biāo)及微生物多樣性的變化,為三丁酸甘油酯在湖羊生產(chǎn)方面的進(jìn)一步應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)在啟東瑞鵬牧業(yè)有限公司開(kāi)展。依據(jù)生產(chǎn)記錄選取20只體況相似、體重為(45±5)kg健康且懷雙羔的產(chǎn)前50 d湖羊,隨機(jī)分為2組,分別為能量負(fù)平衡(NEB)組和添加三丁酸甘油酯(TB)組。生產(chǎn)的羔羊采用人工定量飼喂對(duì)應(yīng)組別母乳,分組為L(zhǎng)-NEB和L-TB。正式試驗(yàn)期從母羊產(chǎn)前40 d至產(chǎn)后42 d,預(yù)期10 d。當(dāng)羔羊42日齡時(shí),分別從每組隨機(jī)挑選5只屠宰,采集瘤胃內(nèi)容物,測(cè)量其瘤胃發(fā)酵指標(biāo),并采用高通量測(cè)序技術(shù)分析其瘤胃微生物。試驗(yàn)羊采用分欄飼養(yǎng),分別飼喂各組對(duì)應(yīng)日糧。三丁酸甘油酯樣品由柏斯托化工控股集團(tuán)提供(福樂(lè)酸SR130,水解丁酸含量≥51.4%)。日糧配方如表1所示。TB組按照NRC標(biāo)準(zhǔn)飼喂(2.8 kg·d-1),NEB組母羊的每天飼料量為T(mén)B組的75%(2.1 kg·d-1),自由飲水。試驗(yàn)前對(duì)羊舍進(jìn)行檢疫消毒驅(qū)蟲(chóng)防疫,保持羊舍通風(fēng)良好,自然光照,提前對(duì)羊群進(jìn)行健康檢查、驅(qū)蟲(chóng)和健胃。

表1 全價(jià)飼料配方及主要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)(以干物質(zhì)計(jì))Table 1 Full-price feed formula and main nutritional indexes %

1.2 樣品采集

屠宰前對(duì)試驗(yàn)羊禁食24 h,不禁水。從胴體采集瘤胃內(nèi)容物,測(cè)量其瘤胃發(fā)酵指標(biāo),并采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其瘤胃微生物進(jìn)行分析。

1.3 pH值與VFA的測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定瘤胃液pH值;參照Liu等[15]的方法測(cè)定VFA,其中氣相色譜柱測(cè)定改為毛細(xì)管色譜柱,柱溫120 ℃,汽化溫度180 ℃,采用氫火焰離子化檢測(cè)器,檢測(cè)溫度180 ℃,載氣為氦氣,壓力為 60 kPa,氫氣壓力為50 kPa。

1.4 生物信息學(xué)分析

將樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司,采用Omicsmart平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。利用雙末端測(cè)序的方法構(gòu)建小片段文庫(kù)后進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)對(duì)reads拼接過(guò)濾,進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OTU)聚類(lèi)和物種分類(lèi)分析,將序列相似度大于97%的聚類(lèi)為同一OTU。同時(shí)使用Mothur v.1.30軟件,對(duì)樣品α多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估,得到稀釋度曲線,Shannon、CHAO、ACE和Simpon指數(shù)用來(lái)評(píng)估樣品的測(cè)序深度、菌群多樣性。使用QIIME軟件進(jìn)行β多樣性分析,得到β距離箱線圖,再進(jìn)行UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean)分析和主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis,PCoA)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

VFA含量及測(cè)序數(shù)據(jù)用Excel 2019進(jìn)行初步整理,采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果中平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)分欄顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對(duì)羔羊瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

如表2所示,圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯后,42日齡羔羊瘤胃pH值無(wú)顯著變化,乙酸含量顯著升高(P<0.05),丙酸含量呈上升趨勢(shì)。

表2 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對(duì)42日齡羔羊瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響Table 2 Effects of adding tributyrin on rumen fermentation indexes of 42 d lambs during perinatal period

2.2 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對(duì)瘤胃微生物α多樣性的影響

如圖1所示:本次測(cè)序共獲得OTU 927條,其中,L-TB組與L-NEB組菌種差異較大,L-TB組有641條OTU,L-NEB組有745條OTU,L-TB組與L-NEB組共享的OTU共有459條,L-TB組特有182條,L-NEB組特有286條。L-TB組與L-NEB組OTU條數(shù)差異明顯,說(shuō)明圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對(duì)羔羊瘤胃菌群有影響。微生物α多樣性分析顯示各組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均逐漸趨于平緩,說(shuō)明樣品的測(cè)序深度已滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。通過(guò)計(jì)算Shannon、CHAO、Simpson和ACE指數(shù),發(fā)現(xiàn)L-NEB組的Shannon指數(shù)顯著高于L-TB組(P<0.05),表明L-TB組羔羊的瘤胃微生物物種多樣性顯著低于L-NEB組。

圖1 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對(duì)羔羊瘤胃微生物菌群多樣性指數(shù)的影響Fig.1 Effects of tributyrin supplementation on microbial diversity index in rumen of lambs during perinatal period

2.3 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對(duì)瘤胃微生物β多樣性的影響

與L-NEB組相比,L-TB組羔羊瘤胃的微生物群落構(gòu)成存在一定差異卻不顯著(圖2-A)?；赪eighted UnFrac距離的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)(圖2-B)顯示,樣品菌群結(jié)構(gòu)基于母代是否飼喂三丁酸甘油酯大致聚集成2類(lèi),說(shuō)明添加三丁酸甘油酯對(duì)羔羊的瘤胃菌群產(chǎn)生一定影響。通過(guò)PCoA分析(圖2-C)可知,L-TB組和L-NEB組在瘤胃微生物群落組成上存在一定差異,且解釋度好(橫縱坐標(biāo)軸標(biāo)題括號(hào)里的百分比表示的是橫縱坐標(biāo)軸對(duì)菌群結(jié)構(gòu)總體差異的解釋度,一般認(rèn)為PCoA1和PCoA2兩者之和在50%以上為好)。

2.4 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯后羔羊瘤胃微生物物種注釋及差異分析

如表3所示:在門(mén)水平上,瘤胃微生物中主要菌群構(gòu)成為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)。L-TB組羔羊瘤胃中厚壁菌門(mén)的豐度相較L-NEB組顯著上升(P<0.05),而藍(lán)藻菌門(mén)豐度相較L-NEB組顯著下降(P<0.05)。在屬水平上,L-TB組羔羊瘤胃中厚壁菌門(mén)的Succiniclasticum和RuminococcaceaeUCG014豐度相較L-NEB組均顯著上升(P<0.05)。

3 討論

3.1 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對(duì)羔羊瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

瘤胃作為反芻動(dòng)物的第一胃,對(duì)反芻動(dòng)物的健康和正常生長(zhǎng)影響深遠(yuǎn)[16-17]。瘤胃pH值受唾液、食糜等多方面因素的影響,能夠在一定程度上反映反芻動(dòng)物的健康狀況,通常認(rèn)為羊瘤胃的正常pH值為5.0～7.5[18-19],L-TB與L-NEB的pH值均處于正常水平。有研究報(bào)道稱(chēng),在瘤胃發(fā)酵中,丙酸含量的提高與羔羊的高生長(zhǎng)性能有關(guān)[20]。從能量轉(zhuǎn)化效率角度來(lái)看,瘤胃VFA中丙酸的能量轉(zhuǎn)化效率最佳,丁酸次之,乙酸最差[21]。結(jié)合本試驗(yàn)測(cè)得VFA數(shù)據(jù)來(lái)看,圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯后,L-TB組乙酸含量顯著升高,意味著有更多的脂質(zhì)被合成,丙酸含量呈上升趨勢(shì),可以產(chǎn)生較多的葡萄糖用以供能。這說(shuō)明在母羊圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯可在一定程度上改善羔羊?qū)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用率。

3.2 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對(duì)瘤胃微生物α多樣性和β多樣性的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在OTU水平上,L-NEB組特有OTU數(shù)較L-TB組多104條,而L-NEB組的Shannon指數(shù)又顯著高于L-TB組,表明L-TB組羔羊的瘤胃微生物物種多樣性顯著低于L-NEB組,提示添加三丁酸甘油酯顯著降低了微生物多樣性。有研究表明,三丁酸甘油酯可能通過(guò)抑制有害菌的生長(zhǎng),極顯著降低了犢?？漳c以及結(jié)腸的微生物多樣性[22],本試驗(yàn)結(jié)果與其一致?；赨PGMA聚類(lèi)樹(shù)和PCoA結(jié)果可以看出,L-NEB組和L-TB組羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異卻不顯著,提示添加三丁酸甘油酯對(duì)羔羊的瘤胃菌群產(chǎn)生一定影響。

3.3 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對(duì)瘤胃微生物物種注釋及差異的影響

門(mén)水平上的分析表明,相比L-NEB組,L-TB組羔羊瘤胃微生物中厚壁菌門(mén)的豐度顯著提高,藍(lán)藻菌門(mén)豐度顯著下降。厚壁菌門(mén)中存在如乳酸菌、瘤胃球菌等多種有益菌[22],而藍(lán)藻菌門(mén)中某些屬的菌種易產(chǎn)各種各樣的生物毒素,例如神經(jīng)毒素、肝毒素、細(xì)胞毒素及內(nèi)毒素等,對(duì)動(dòng)物的健康構(gòu)成嚴(yán)重危害[23]。Cox等[24]的研究結(jié)果表明,嬰兒期的微生物群相互作用可能是長(zhǎng)期宿主代謝效應(yīng)的關(guān)鍵決定因素,厚壁菌門(mén)豐度的提升將可能長(zhǎng)期有利于L-TB組羔羊瘤胃有益菌的定殖,為其營(yíng)造健康瘤胃環(huán)境,而L-NEB組藍(lán)藻菌門(mén)的豐度顯著提升對(duì)該組的負(fù)面影響可能將長(zhǎng)期存在。本試驗(yàn)中,門(mén)水平上豐度最高的微生物分別是厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén),這與反芻動(dòng)物瘤胃微生物的其他研究結(jié)果相一致[25]。屬水平上的分析表明,相比L-NEB組,L-TB組羔羊瘤胃微生物中Succiniclasticum和RuminococcaceaeUCG014豐度顯著提高,而這兩者又屬于厚壁菌門(mén),進(jìn)一步印證添加三丁酸甘油酯有利于提升羔羊瘤胃厚壁菌門(mén)豐度,對(duì)有益菌的定殖提供有利條件。反芻動(dòng)物圍產(chǎn)期母體的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境對(duì)初乳的形成發(fā)揮著關(guān)鍵作用[26],而初乳又影響著羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu),這可能與本試驗(yàn)所產(chǎn)生的影響相關(guān)。