張芳平，劉曉霞，位翠杰，馮涌微，何民友，夏天睿，陳向東，孫冬梅，李振雨

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitia grosvenorii（Swingle）C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang的干燥果實，有清熱潤肺、利咽開音、滑腸通便功效[1]，是原衛(wèi)生部于2002年公布的我國首批藥食同源中藥（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕51號）。羅漢果是廣西道地藥材之一，多分布于廣西壯族自治區(qū)桂林市、柳州市等地[2]。研究表明，羅漢果含有黃酮類、皂苷類、多糖類、多酚類等活性成分，有抗菌、抗炎、抗氧化等作用[3-4]，可用于治療腫瘤、肝臟疾病，具有豐富的營養(yǎng)價值與藥用價值[5-7]。目前，羅漢果應用廣泛，2020年版《中華人民共和國藥典》僅以單一成分羅漢果苷Ⅴ作為羅漢果的質量標志物（Q-Marker），無法全面評價羅漢果的內在質量，因此，亟需建立完整的羅漢果質量評價體系。同時，相關研究表明，除羅漢果皂苷Ⅴ外，葫蘆烷型四環(huán)三萜類羅漢果苷Ⅱe、羅漢果苷Ⅲe、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ等，黃酮苷類山柰苷等，小分子醛類5-羥甲基糠醛等是羅漢果的重要化學成分[8]，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用。因此，本研究通過建立羅漢果藥材UPLC指紋圖譜并對其多指標成分進行含量測定，結合化學計量學分析，全面評價羅漢果藥材的質量，為完善羅漢果藥材質量標準提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

U3000超高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ME204E萬分之一天平、XP26百萬分之一天平，梅特勒-托利多公司；HWS28電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司。

15批羅漢果藥材，經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定，均為葫蘆科植物羅漢果Siraitia grosvenorii（Swingle）C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y.Zhang的干燥果實，批號LHG01～LHG05樣品（編號L1～L5）產地為廣西壯族自治區(qū)柳州市（廣西柳州），批號LHG06～LHG15樣品（編號L6～L15）產地為廣西壯族自治區(qū)桂林市（廣西桂林）。對照品羅漢果皂苷Ⅴ（批號111754-201703，含量94.0%，中國食品藥品檢定研究院），山柰苷（批號20110503，含量99.63%，成都普菲德生物有限公司），11-O-羅漢果皂苷Ⅴ（批號DST200903-032，含量99.39%，成都樂美天生物技術有限公司），5-羥甲基糠醛（批號111626-202215，含量99.5%，中國食品藥品檢定研究院）。甲醇（分析純，西隴科學股份有限公司），乙腈（色譜純，默克股份有限公司），磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），超純水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件

采用Waters Cortecs T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，2%～7%A；6～17 min，7%～15%A；17～19 min，15%～19%A；19～28 min，19%～22%A；28～35 min，22%～27%A；35～40 min，27%～90%A），流速0.30 mL/min，檢測波長0～25 min為300 nm、25.1～40 min為203 nm，柱溫43 ℃，進樣量1 μL。

2.1.2 對照品溶液制備

取5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ對照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含5-羥甲基糠醛51.614 μg、山柰苷22.914 μg、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ 31.656 μg、羅漢果皂苷Ⅴ 52.230 μg的溶液，即得混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

取羅漢果藥材粉末（過四號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗

取羅漢果藥材（編號L2）供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以峰15羅漢果皂苷Ⅴ為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間RSD為0.32%～1.53%，相對峰面積RSD為0.65%～1.59%，均小于3.00%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復性試驗

取羅漢果藥材粉末（過四號篩，編號L2）約1.0 g，平行6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，以峰15羅漢果皂苷Ⅴ為參照峰S，計算共有指紋峰與S峰的相對保留時間RSD為0.52%～1.75%，相對峰面積RSD為0.75%～1.85%，均小于3.00%，表明該方法重復性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗

取“2.1.4.2”項下羅漢果藥材供試品溶液，分別于制備后0、3、6、10、16、24 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，以峰15羅漢果皂苷Ⅴ為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間RSD為0.01%～0.05%，相對峰面積RSD為0.18%～1.94%，均小于3.00%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.4.4 共有指紋峰確定及相似度評價

按上述方法對15批羅漢果藥材進行測定，并將指紋圖譜CDF格式導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行處理。以L1樣品指紋圖譜為參照，進行多點校正和峰匹配，并生成對照指紋圖譜，15批樣品指紋圖譜疊加圖見圖1，對照指紋圖譜見圖2。15批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度計算結果見表1。采用對照品比對結合紫外-可見光3D光譜分析對共有峰進行指認，結果見圖3。15批樣品共呈現(xiàn)16個共有色譜峰，峰2為5-羥甲基糠醛，峰12為山柰苷，峰14為11-O-羅漢果皂苷Ⅴ，峰15為羅漢果皂苷Ⅴ。除L9樣品指紋圖譜相似度為0.894，其余14批樣品指紋圖譜的相似度均大于0.900，表明指紋圖譜能夠作為共性特征用于羅漢果藥材的質量控制。

表1 15批羅漢果藥材指紋圖譜相似度評價

圖2 羅漢果藥材對照指紋圖譜

圖3 羅漢果藥材指紋圖譜共有色譜峰指認

2.2 化學計量學分析

2.2.1 聚類分析

為進一步分析不同產地羅漢果藥材是否存在差異，采用SPSS25.0軟件對15批羅漢果藥材的16個共有峰進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖4。當組間聯(lián)接距離為17～25時，15批羅漢果藥材聚為2類：編號L1～L5樣品為一類，編號L6～L15樣品為另一類。聚類結果顯示出明顯的產地相關性，廣西柳州樣品和廣西桂林樣品分別聚為一類。

圖4 15批羅漢果藥材聚類樹狀圖

2.2.2 主成分分析

采用SIMCA14.1軟件，以16個共有峰的峰面積為變量進行主成分分析（PCA），15批羅漢果藥材PCA得分圖見圖5。15批樣品基本分為2類，其中廣西柳州樣品為一類（L1～L5），廣西桂林樣品（L6～L8、L10～L15）為另一類，與聚類分析結果基本一致。

圖5 15批羅漢果藥材PCA得分圖

2.2.3 正交偏最小二乘-判別分析

采用SIMCA14.1軟件，以16個共有峰的峰面積為變量進行正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA），結果模型R2X=0.998，Q2=0.694，其中Q2＞0.5表明模型有效。15批羅漢果藥材OPLS-DA得分圖見圖6。以變量重要性投影（VIP）＞1.0為條件對差異成分進行篩選，共得到6個差異標志物，按VIP值排序為：峰13＞峰9＞峰5＞峰7＞峰15（羅漢果皂苷Ⅴ）＞峰2（5-羥甲基糠醛），見圖7。

圖6 15批羅漢果藥材OPLS-DA得分圖

圖7 羅漢果藥材指紋圖譜共有峰VIP圖

2.3 含量測定

2.3.1 線性關系考察

取5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷V和羅漢果皂苷Ⅴ對照品適量，加甲醇制成每1 mL含5-羥甲基糠醛101.56 μg、山柰苷56.23 μg、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ 1 011.90 μg、羅漢果皂苷Ⅴ 2 204.50 μg的混合對照品母液。分別精密量取混合對照品母液3、2、1.5、0.5、0.3 mL，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。分別取上述對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標、對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表2。5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ和羅漢果皂苷Ⅴ的相關系數(shù)均大于0.999 0，表明峰面積與對照品濃度在相應范圍內線性關系良好。

表2 羅漢果中4種成分線性關系考察結果

2.3.2 精密度試驗

取“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ和羅漢果皂苷Ⅴ對照品峰面積，并計算RSD為0.15%～0.20%，均小于3.00%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗

取羅漢果藥材粉末（過四號篩，編號L2）1.0 g，按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣。結果羅漢果藥材中5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ和羅漢果皂苷Ⅴ平均含量分別為1.339、0.241、2.785、11.745 mg/g，且RSD為0.04%～1.31%，均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取羅漢果藥材粉末（過四號篩，編號L2）1.0 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、3、6、10、16、24 h，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結果表明，羅漢果藥材中5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ和羅漢果皂苷Ⅴ的峰面積RSD為0.15%～1.23%，均小于3.00%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的羅漢果藥材粉末（過四號篩，編號L2）0.5 g，共9份，分為3組，每組平行3份，按對照品與樣品中待測成分含量為0.5∶1、1∶1、1.5∶1比例分別加入5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ和羅漢果皂苷Ⅴ對照品，按“2.1.3”項下方法制備9份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，結果5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ和羅漢果皂苷Ⅴ平均加樣回收率分別為96.36%、98.13%、99.51%、96.37%，RSD為1.84%～2.43%，均小于3.00%，表明加樣回收率良好，見表3。

表3 羅漢果藥材中4種成分加樣回收率試驗結果

2.3.6 樣品測定

分別取15批羅漢果藥材粉末1.0 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，平行2份，并按“2.1.1”項下色譜條件測定，采用外標法計算5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ和羅漢果皂苷Ⅴ含量，結果見表4。15批羅漢果藥材5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ和羅漢果皂苷Ⅴ平均含量分別為0.402、0.195、3.543、15.339 mg/g。其中廣西柳州和廣西桂林樣品山柰苷和11-O-羅漢果皂苷Ⅴ含量無明顯差異，廣西柳州樣品5-羥甲基糠醛含量（1.009 mg/g）高于廣西桂林樣品（0.235 mg/g），廣西柳州樣品羅漢果皂苷Ⅴ含量（13.224 mg/g）低于廣西桂林樣品（16.397 mg/g），可知，廣西柳州和廣西桂林產地的羅漢果藥材質量存在一定差異。2020年版《中華人民共和國藥典》羅漢果項下規(guī)定羅漢果皂苷Ⅴ含量不得少于0.5%。15批羅漢果藥材羅漢果皂苷Ⅴ含量均符合規(guī)定，藥材質量較好。

表4 15批羅漢果藥材中4種成分含量測定結果（mg/g）

3 討論

PDA檢測器全波長掃描結果顯示，羅漢果藥材中極性較大的酚酸類和黃酮類成分在25 min內被洗脫，且在波長300 nm處有較高的紫外吸收；25 min后，極性較小的葫蘆烷型萜類成分被洗脫，該類物質在波長203 nm處有較弱的紫外吸收。因此，本研究采用波長切換方式建立羅漢果藥材指紋圖譜，從而獲得更多的指紋峰信息，即檢測波長0～25 min為300 nm、25.1～40 min為203 nm。

本研究以總峰面積/稱樣量值和分離度為評價指標，考察不同溶劑（甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇）及提取方式（超聲、加熱回流）對羅漢果藥材提取效果的影響。結果表明，當提取溶劑為甲醇時，其總峰面積/稱樣量值最大且分離度好，即提取效果最佳。采用加熱回流提取方式，各指紋峰的總峰面積/稱樣量值大于超聲提取且分離度最佳。

本研究利用超高效液相色譜儀建立15批羅漢果藥材指紋圖譜，結果表明，15批樣品指紋圖譜呈現(xiàn)16個共有峰；除L9以外，其余14批樣品指紋圖譜相似度大于0.900，可能由于樣品均采自廣西，故相似度較高，質量較為一致。

本研究應用化學計量學方法評價羅漢果藥材質量，聚類分析及PCA表明，除L9以外，廣西柳州樣品基本聚為一類，廣西桂林樣品聚為一類，表現(xiàn)出明顯的產地相關性。L9分布顯示異常，與其他批次差異較大，可能是由于藥材的生長年限、產地加工或者采收后的貯藏環(huán)境不同導致。通過VIP＞1篩選出峰2（5-羥甲基糠醛）、峰5、峰7、峰9、峰13、峰15（羅漢果皂苷Ⅴ）為羅漢果藥材質量控制的差異標志物，表明本研究可能為羅漢果整體質量評價系統(tǒng)的建立提供依據(jù)。

羅漢果所含黃酮苷類成分山柰苷具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗糖尿病、抗腫瘤等作用[4]；葫蘆烷型萜類成分羅漢果苷Ⅲe、11-O-羅漢果苷Ⅴ等具有利咽開嗓等功效[5]；羅漢果皂苷V具有抗氧化、抗腫瘤、止咳潤肺、降血糖等作用[5]，是2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的含量測定指標；5-羥甲基糠醛是小分子醛類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、延緩記憶功能衰退等作用，但也有一定的細胞毒性，過量食用可能造成中毒，致內臟損害[9]。當5-羥甲基糠醛含量高于0.02%時，中藥材會出現(xiàn)嚴重的變質現(xiàn)象[10]。羅漢果中5-羥甲基糠醛含量與色澤、貯藏年份之間未見明顯相關性[11]。羅漢果經(jīng)高溫加工，其內部糖分發(fā)生Maillard反應生成較多的5-羥甲基糠醛，常溫貯藏其含量不會發(fā)生明顯變化[9]，5-羥甲基糠醛含量是影響羅漢果藥材質量的重要因素之一。

由于羅漢果富含多種有效化學成分，單一指標成分難以對羅漢果藥材質量進行整體評價，多指標含量測定對羅漢果質量評價具有重要作用。基于此，本研究選擇5-羥甲基糠醛、山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ作為羅漢果藥材的含量測定指標。結果表明，廣西柳州和廣西桂林羅漢果藥材中山柰苷、11-O-羅漢果皂苷Ⅴ含量相差不大，表明廣西羅漢果藥材質量較為一致；廣西柳州樣品5-羥甲基糠醛含量高于廣西桂林樣品，這可能與產地加工方式相關，具體原因有待進一步研究；廣西柳州樣品羅漢果皂苷Ⅴ含量略低于廣西桂林樣品，表明廣西桂林羅漢果藥材質量可能優(yōu)于廣西柳州。廣西不同產地羅漢果藥材質量存在一定差異，表明除羅漢果皂苷Ⅴ以外，5-羥甲基糠醛很可能成為羅漢果的Q-maker，進而為羅漢果整體質量評價系統(tǒng)的建立提供依據(jù)。

綜上，羅漢果作為廣西的道地藥材之一，其質量評價體系有待進一步完善，本研究可為全面評價羅漢果藥材質量提供依據(jù)。同時，本研究存在一定不足，如樣品批次較少、未考慮加工處理對藥材質量的影響等，有待進一步深入研究。