陳凱，朱瑩，周牧之

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）主要臨床特征包括大便帶血、腹部疼痛，以及大便形狀、質地等改變。腸黏膜損傷和潰瘍形成是UC常見病理表現(xiàn)，好發(fā)于直腸與乙狀結腸，也可延伸至降結腸甚至整個結腸[1]。UC在我國發(fā)病率逐年升高[2-3]，常用藥物有5-氨基水楊酸、激素、生物制劑及免疫調節(jié)劑，約一半患者服藥后癥狀有效緩解，但可能導致嚴重不良反應，如嘔吐、貧血和全身水腫等。由于UC病因復雜、復發(fā)風險高，易伴發(fā)其他并發(fā)癥，已成為臨床亟需解決的難題。UC發(fā)病機制復雜，具體原因尚未完全明確。IL-6/miR-155軸在UC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，白細胞介素（IL）-6通過作用于下游信號因子促進信號傳導與轉錄激活因子（STAT）3磷酸化，STAT3磷酸化入核后能誘導miR-155表達，進一步調控UC炎癥反應及Th17/Threg平衡[4-6]。潰結寧膏是朱瑩教授根據(jù)多年臨床經驗所創(chuàng)，課題組運用潰結寧膏穴位敷貼治療脾腎陽虛型UC臨床療效顯著[7]。前期實驗研究表明，潰結寧膏能減輕UC大鼠及細胞模型炎癥反應，降低腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1等促炎因子分泌[8-9]。本實驗在前期研究基礎上，觀察潰結寧膏穴位敷貼對UC大鼠炎癥反應及Th17/Threg平衡的影響，進一步闡明其治療UC的分子機制，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質量180～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗有限公司。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物房，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，12 h光暗循環(huán)，自由攝食飲水。本實驗經湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（ZYFY20190814-1）。

1.2 藥物、試劑及儀器

潰結寧膏（由炮附子、延胡索、丁香、芥子、赤芍、細辛、生姜按1∶1∶1∶1∶1∶1∶2組成）、無藥物巴布劑基質（由聚丙烯酸鈉、高嶺土、明膠、甘羥鋁、聚乙烯醇、蓖麻油、甘油組成），湖南省中醫(yī)院藥劑科提供。柳氮磺嘧啶（SASP）片，批號09190501，上海信誼天平藥業(yè)有限公司。番瀉葉，湖南然潤堂中藥有限公司。

2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，批號2297，美國Sigma公司），腺嘌呤（批號A8626-25G，美國Sigma公司），大便隱血試劑（批號C027-1-1，珠海貝索生物技術有限公司），IL-8、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒（批號分別為I03050436、I0303471、I040347110，武漢華美生物工程有限公司），mRNA反轉錄試劑盒（批號CW2569，北京康為世紀），miRNA反轉錄試劑盒（批號CW2141，北京康為世紀），p-STAT3一抗（批號ab76315，英國Abcam），IL-6一抗（批號ab233706，英國Abcam），CD4-FITC抗體（批號11-0040-82，美國Invitrogen公司），IL-17A-PE抗體（批號12-7177-81，美國Invitrogen公司），Cell Stimulation Cocktail（Plus protein transport inhibitors）500×（批號00-4975-93，美國eBiosciences公司），人外周血淋巴細胞分離液（批號P8610，北京索萊寶公司），紅細胞裂解液（批號C3702，北京索萊寶公司），CD25-PE抗體（批號17-0390-82，美國eBiosciences公司），F(xiàn)oxp3-APC抗體（批號12-5773-80，美國eBiosciences公司），β-actin抗體（批號66009-1-Ig，美國Proteintech），HRP標記山羊抗小鼠IgG（批號SA00001-1，美國Proteintech），HRP標記山羊抗兔IgG（批號SA00001-2，美國Proteintech）。

臺式高速冷凍離心機（型號H1650R，湖南湘儀），多功能酶標分析儀（型號MB-530，深圳匯松科技發(fā)展有限公司），全自動酶標洗板機（型號PW-812，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號DHP-500，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），熒光定量RCP儀（型號PIKOREAL96，美國Thermo），熒光PCR板（型號SPL0960，美國Thermo），搖床（型號TS-1，江蘇其林貝爾），電泳儀（型號DYY-6C，北京六一），電泳槽（型號DYCZ-24DN，北京六一），轉膜儀（型號DYCZ-40D，北京六一），-80 ℃冰箱（型號DW-HW438，中國美菱）。

1.3 造模

大鼠適應性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法選取12只大鼠正常喂養(yǎng)，剩余48只參照課題組前期方法[10]制備脾腎陽虛型UC大鼠模型，先予腺嘌呤10 mL/kg灌胃2周，第3周起用冰番瀉葉溶液10 mL/kg灌胃，連續(xù)2周，期間自由攝食飲水，每日灌胃30 min后將冰水噴至大鼠毛發(fā)，使肌肉等全身各處濕透，再用風扇吹干。第29日大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉10 mL/kg麻醉，用石蠟油潤滑聚乙烯管后插入大鼠直腸，深度約8 cm，緩慢注入5%TNBS（100 mg/kg，加50%乙醇0.25 mL），提起大鼠尾巴倒置2 min。次日開始觀察大鼠一般狀況，隨機取模型組4只、空白組1只過量麻醉處死，驗證造模效果。造模后大鼠精神萎靡，毛發(fā)枯槁，體質量降低，進食減少，明顯黏液膿血便，肉眼可見結腸組織局部潰瘍、充血、糜爛，顯微鏡下可見中性粒細胞聚集，腺體排列紊亂，結合黏膜組織缺損提示造模成功。

1.4 分組及給藥

將正常喂養(yǎng)的11只大鼠作為空白組，44只成模大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、非穴位敷貼組、穴位敷貼組和SASP組，每組11只。取穴參考《實驗針灸學》[11]，選擇“脾俞”“膈俞”“足三里”“大腸俞”“天樞”“腎俞”，模型組用無藥物巴布劑基質敷貼穴位+生理鹽水灌胃，穴位敷貼組用潰結寧膏敷貼穴位+生理鹽水灌胃，非穴位敷貼組用潰結寧膏敷貼臀部肌肉豐厚處+生理鹽水灌胃，SASP組用無藥物巴布劑基質敷貼穴位+SASP灌胃，兩側穴位交替進行，1.5 h/次，1次/d，連續(xù)14 d。

1.5 取材

末次干預后大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉10 mL/kg麻醉，腹主動脈取血，3 500 r/min離心10 min，血清保存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｈ⊙竺擃i處死大鼠，取距肛門6～10 cm結腸組織于多聚甲醛中固定，用于病理檢測，另取部分結腸組織于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標檢測

1.6.1 一般狀況及疾病活動指數(shù)評分

觀察大鼠一般狀況（精神狀態(tài)、毛發(fā)、大小便等），干預結束后對大鼠進行疾病活動指數(shù)（DAI）評分，DAI=（體質量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便隱血分數(shù)）÷3。具體評分標準見表1。

1.6.2 結腸組織病理形態(tài)觀察及結腸黏膜損傷評分

取病變部位結腸組織，于多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，60 ℃烤片12 h，切片脫蠟至水，蘇木精染色1～10 min，伊紅染色1～5 min，脫水，烤干，封片。顯微鏡下觀察結腸組織病理變化，并進行結腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分。評分標準見表2[12]。

表2 CMDI評分標準

1.6.3 ELISA檢測

按試劑盒說明書配制標準品、洗液工作液、生物素標記抗體工作液及辣根過氧化物酶標記親和素工作液。將試劑在室溫平衡30 min，設置標準孔與待測樣品孔，加樣，棄液，加生物素標記抗體工作液，棄液，加辣根過氧化物酶標記親和素工作液，棄液，甩干，加底物，避光顯色，加終止液終止反應。用酶標儀測定波長450 nm處光密度（OD值），根據(jù)樣品OD值計算血清IL-8、IL-17、IL-23含量。

1.6.4 RT-PCR檢測

用Trizol、異丙醇、三氯甲烷、乙醇提取結腸組織總RNA，紫光分光光度計測定波長260 nm與280 nm吸光度，計算RNA濃度和純度。配制反轉錄體系，將總RNA反轉錄為cDNA。PCR條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共40個循環(huán)。引物序列見表3。以β-actin為內參，2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。

表3 各基因PCR引物序列

1.6.5 Western blot檢測

取結腸組織剪碎，加入RIRA裂解液，生物勻質儀勻漿，冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，BCA法測定蛋白濃度。制備15%分離膠及4.8%濃縮膠，蛋白樣品中加入loading buffer，煮沸，置于冰盒中備用。上樣，75 V電泳130 min，300 mA恒流轉膜，用脫脂奶粉室溫封閉90 min。將膜與IL-6一抗（1∶750）、p-STAT3一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶5 000）于低溫孵育過夜。次日室溫放置30 min，加HRP-山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）、HRP-山羊抗兔IgG（1∶6 000）孵育60 min，ECL發(fā)光液進行顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件分析蛋白相對灰度值。

1.6.6 流式細胞術檢測

取抗凝全血，加入淋巴細胞分離液，800×g離心30 min，吸取白膜細胞層，400×g離心5 min，用1640完全培養(yǎng)基重懸細胞備用。按1∶500稀釋Cell Stimulation Cocktail（Plus protein transport inhibitors）后加入細胞懸液中，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。收集細胞，用1×Fixation/Permeabilization concentrate重懸細胞沉淀，避光固定破膜30 min，加入1×工作液，反復離心，PBS重懸細胞沉淀，加入CD4、IL-17A、CD25和Foxp3抗體孵育，流式細胞儀上機檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以-表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 潰結寧膏對模型大鼠一般狀況及疾病活動指數(shù)評分的影響

干預過程中除空白組外，其余各組均有大鼠死亡，分別為模型組3只、穴位敷貼組1只、非穴位敷貼組2只、SASP組1只，死亡時間主要集中在造模后1個星期內，考慮可能為結腸穿孔所致。

大鼠造模后精神狀態(tài)變差，攝食量減少，毛發(fā)逐漸稀薄、干枯，體質量下降，形體消瘦，弓背蜷縮，喜扎堆，大便質地稀薄，部分夾雜黏液膿血，小便清長。與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠精神狀態(tài)好轉，毛發(fā)潤澤，攝食量增加，體質量上升，大便逐漸成形，黏液膿血便程度減輕。

與空白組比較，模型組大鼠DAI評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠DAI評分明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠DAI評分比較（-，分）

表4 各組大鼠DAI評分比較（-，分）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

DAI評分組別只數(shù)0 2.67±0.33*2.50±0.22 1.00±0.26#△0.83±0.31#△空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組6 6 6 6 6

2.2 潰結寧膏對模型大鼠結腸組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠結腸組織表面光滑，呈淡粉白色，局部未見膨隆，結腸內壁未見潰瘍、充血、水腫等表現(xiàn)；顯微鏡下腺體排列整齊，無炎性細胞浸潤，未見細胞變性及壞死。模型組和非穴位敷貼組大鼠結腸長度不同程度縮短、結腸周徑不一，局部可見紅腫膨脹，部分腸段質地變硬，可見深淺不一的潰瘍，黏膜局部紅腫充血；顯微鏡下腺體排列紊亂，可見炎性細胞浸潤及細胞變性、壞死。穴位敷貼組和SASP組大鼠結腸長度有所增加，結腸黏膜充血、水腫、潰瘍明顯好轉，顯微鏡下腺體排列較前規(guī)則，細胞變性、壞死明顯好轉。見圖1。

與空白組比較，模型組大鼠CMDI評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠CMDI評分明顯降低（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠CMDI評分比較（-，分）

表5 各組大鼠CMDI評分比較（-，分）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

CDMI評分0 2.83±0.31*2.67±0.21 1.33±0.22#△1.17±0.17#△組別空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組只數(shù)6 6 6 6 6

2.3 潰結寧膏對模型大鼠血清白細胞介素-8、白細胞介素-17、白細胞介素-23含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量明顯增加（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量明顯減少（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量比較（-，pg/mL）

表6 各組大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量比較（-，pg/mL）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

只數(shù)IL-23組別IL-8IL-17 0.88±0.02 3.93±0.08*3.74±0.26 1.39±0.12#△1.21±0.09#△空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組4 4 4 4 4 24.50±0.58 63.09±2.02*58.35±1.06 31.21±0.42#△28.43±2.43#△605.62±3.65 997.14±14.60*979.33±6.73 656.92±19.22#△645.71±16.22#△

2.4 潰結寧膏對模型大鼠結腸組織白細胞介素-6、白細胞介素-17、白細胞介素-23、miR-155、信號傳導與轉錄激活因子3 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠結腸組織IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表達明顯降低（P＜0.05）。見表7。

表7 各組大鼠結腸組織IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表達比較（-）

表7 各組大鼠結腸組織IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表達比較（-）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

STAT3 0.99±0.15 4.73±0.52*4.08±0.33 1.45±0.12#△1.32±0.31#△組別空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組只數(shù)5 5 5 5 5 IL-6 0.47±0.08 2.45±0.15*2.00±0.14 0.88±0.18#△0.88±0.16#△IL-17 0.76±0.06 3.25±0.28*2.85±0.21 1.09±0.11#△1.11±0.07#△IL-23 0.66±0.10 3.85±0.18*3.65±0.19 1.15±0.15#△1.17±0.06#△miR-155 0.48±0.06 2.50±0.18*2.23±0.22 0.88±0.09#△0.93±0.12#△

2.5 潰結寧膏對模型大鼠結腸組織白細胞介素-6、磷酸化信號傳導與轉錄激活因子3蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸組織IL-6、p-STAT3蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠結腸組織IL-6、p-STAT3蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖2、表8。

圖2 各組大鼠結腸組織IL-6、p-STAT3蛋白免疫印跡

表8 各組大鼠結腸組織IL-6、p-STAT3蛋白表達比較（-）

表8 各組大鼠結腸組織IL-6、p-STAT3蛋白表達比較（-）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

p-STAT3組別只數(shù)IL-6 0.15±0.02 0.55±0.04*0.53±0.03 0.25±0.03#△0.25±0.02#△空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組5 5 5 5 5 0.17±0.02 0.56±0.04*0.53±0.03 0.24±0.03#△0.25±0.01#△

2.6 潰結寧膏對模型大鼠血液Th17、Treg細胞比例的影響

與空白組比較，模型組大鼠血液Th17細胞比例升高，Treg細胞比例降低（P＜0.05），Th17/Treg細胞比例明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠血液Th17細胞比例降低，Treg細胞比例升高（P＜0.05），Th17/Treg細胞比例降低（P＜0.05）。見表9。

表9 各組大鼠血液Th17、Treg細胞比例比較（-）

表9 各組大鼠血液Th17、Treg細胞比例比較（-）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

組別空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組Th17/Treg 0.11±0.02 7.82±1.01*4.42±0.40#0.18±0.04#△0.22±0.03#△只數(shù)5 5 5 5 5 Th17/%1.79±0.31 13.85±1.01*12.37±0.67 2.27±0.37#△2.65±0.33#△Treg/%15.58±0.73 1.87±0.21*2.86±0.22 12.93±0.90#△12.58±1.02#△

3 討論

根據(jù)UC臨床癥狀，可將其歸屬于中醫(yī)學“泄瀉”“痢疾”等范疇，主要有濕熱下注、脾腎陽虛、肝郁脾虛等類型[13]。本研究用SD大鼠制備動物模型，腺嘌呤灌胃2周后改為番瀉葉灌胃。腺嘌呤具有腎毒性，常作為腎陽虛證的造模藥物。番瀉葉苦寒，傷脾腎之陽氣，在灌胃同時進行環(huán)境干預，進一步損傷機體脾腎陽氣，最后以TNBS和乙醇復合物灌腸制備脾腎陽虛型UC模型。該病證結合模型經前期研究證實可靠[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠造模后出現(xiàn)活動遲緩、毛發(fā)枯槁、大便溏瀉、便中帶血等表現(xiàn)，結合腸道黏膜情況，提示造模成功。通過潰結寧膏穴位敷貼干預，能夠有效改善模型大鼠一般狀況。

UC發(fā)病機制復雜，主要與遺傳、環(huán)境、菌群失調和免疫功能障礙相關。腸道炎癥嚴重程度與促炎因子表達密切相關[14-15]。IL-6是由活化的免疫細胞產生的重要促炎因子，越來越多證據(jù)表明，IL-6水平能影響UC病情發(fā)展，改變疾病結局與預后。采用IL-6拮抗劑托珠單抗能減輕患者癥狀，緩解機體炎癥反應[16-17]。IL-6能與其受體結合形成復合物，激活信號轉導β受體gp130和細胞內信號級聯(lián)通路，其中最重要的是JAK/STAT通路。gp130相關的Janus激酶（JAK）特別是JAK1在配體結合后被激活，從而使STAT3磷酸化入核，靶向miR-155轉錄。目前染色質免疫共沉淀已證實STAT3能夠直接與miR-155位點結合，從而調節(jié)IL-6、IL-17、IL-23等炎癥因子分泌。相反，miR-155通過JAK/STAT通路調節(jié)UC Th17/Treg平衡與炎癥反應[5，18-19]。研究表明，IL-6/STAT3信號通路具有調節(jié)T細胞分化、免疫、腸道炎癥的作用，阻斷STAT3可調節(jié)機體免疫反應，緩解腸道炎癥[20-21]。miR-155是具有不同功能的微小RNA，參與造血、炎癥和免疫反應。炎癥因子及Toll樣受體能誘導miR-155表達，UC病變結腸組織miR-155表達升高，采用miR-155拮抗劑能降低其表達，減少炎癥因子分泌，改善UC癥狀及體征[22-23]。以上研究表明，IL-6/miR-155軸在UC發(fā)展中扮演重要角色。本實驗中模型大鼠血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量增加，結腸組織IL-6/miR-155軸關鍵因子IL-6、STAT3、miR-155表達升高，潰結寧膏干預能減少模型大鼠血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量，抑制IL-6/miR-155軸相關因子表達，調節(jié)Th17/Treg平衡。

穴位敷貼是常用醫(yī)外治法，具有療效顯著、不良反應少、使用方便等特點，在臨床廣泛應用。在中西藥內服基礎上加用穴位敷貼能提高UC治療效果，減輕藥物不良反應，臨床取穴主要為脾俞、腎俞、大腸俞、神闕等[24-25]。潰結寧膏依據(jù)臟腑經絡理論選擇穴位，采用藥物外用刺激穴位，進一步通過經絡將藥效輸送至相應部位，從而溫補脾腎、調節(jié)氣血。

綜上，潰結寧膏可降低脾腎陽虛型UC大鼠DAI評分和CMDI評分，修復結腸組織損傷，其機制與減少炎癥因子分泌，抑制IL-6/miR-155軸相關因子IL-6、p-STAT3、miR-155表達，調節(jié)Th17/Treg平衡有關。