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        益氣解毒化瘀方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響

        2023-10-17 03:46:08查瑞瑤李明汪悅
        中國中醫(yī)藥信息雜志 2023年10期
        關(guān)鍵詞:化瘀益氣結(jié)腸

        查瑞瑤,李明,汪悅

        安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230031

        潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是消化系統(tǒng)難治性疾病,好發(fā)于腸道黏膜層及黏膜下層,屬于炎癥性腸病范疇[1-2],臨床癥狀主要有腹痛、腹瀉及黏液膿血便。研究發(fā)現(xiàn),UC發(fā)病機(jī)制可能與免疫紊亂、凝血功能異常、腸黏膜屏障受損、腸道微生態(tài)改變等有關(guān)[3]。JAK2/STAT3信號通路是重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4],與UC發(fā)病密切相關(guān)。研究顯示,UC細(xì)胞因子可能通過介導(dǎo)JAK/STAT信號通路調(diào)控T細(xì)胞分化,導(dǎo)致下游炎性因子“瀑布樣釋放”,進(jìn)而損傷腸黏膜[5]。

        益氣解毒化瘀方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科在多年臨床經(jīng)驗基礎(chǔ)上總結(jié)出的治療UC有效方,認(rèn)為UC發(fā)病以脾氣虛弱為本,濕熱內(nèi)蘊為標(biāo),局部可能呈現(xiàn)血瘀的臨床證變,故應(yīng)用益氣解毒化瘀為主要治法治療UC,療效顯著[6]。前期動物實驗顯示,益氣解毒化瘀方對UC大鼠免疫機(jī)制有調(diào)節(jié)作用,可降低UC大鼠炎癥因子水平,修復(fù)腸黏膜屏障[7]。本研究從JAK2/STAT3信號通路出發(fā),進(jìn)一步研究益氣解毒化瘀方調(diào)節(jié)UC大鼠免疫機(jī)制的作用機(jī)制,為中醫(yī)藥治療UC提供新思路。

        1 實驗材料

        1.1 動物

        SPF級雄性大鼠60只,5~6月齡,體質(zhì)量180~220 g,安徽省實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(皖)2017-001。飼養(yǎng)于溫度22~28 ℃、相對濕度50%~60%環(huán)境,自由攝食飲水。本實驗經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批(AHUCM-2022066)。

        1.2 藥物及制備

        益氣解毒化瘀方由黨參10 g、赤芍10 g、白芍10 g、煨木香10 g、薏苡仁30 g、白及10 g、麩炒白術(shù)10 g、三七粉5 g、馬齒莧15 g、炒谷芽15 g、黃連2 g、黃柏10 g組成。飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供,除三七粉外,所有飲片常規(guī)浸泡、煎煮、過濾,藥液加入三七粉混勻,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成每毫升含3 g原藥材藥液,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩A沁拎て?.25 g/片,批號20160702,上海三維制藥有限公司。使用時去除外層包衣,研為細(xì)粉,用蒸餾水配制成40 mg/mL混懸液,置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 主要試劑與儀器

        5% 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS,批號P5632),德國Sigma公司;95%乙醇(批號100603),上海彤最化工科技有限公司;BSA(批號A602440-0050),生工生物工程(上海)股份有限公司;白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-23、IL-17 ELISA試劑盒(批號均為20170312),安徽巧伊生物科技有限公司;維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt(RORγt)抗體(貨號bs-10647R)、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)抗體(貨號bsm-33218M)、IL-6抗體(bs-0782R)、p-STAT3抗體(bs-1658R)、JAK2抗體(bs-23003R),北京博奧森;RIPA細(xì)胞裂解液(貨號P0013B),上海碧云天;PVDF膜(貨號IPVH00010),美國Millipore;PAGE膠促凝劑(貨號T8090),北京Solarbio。自動曝光儀(型號JS-1070P,上海培清科技有限公司),轉(zhuǎn)膜儀(型號VE-186,上海天能科技有限公司),常溫微量離心機(jī)(型號LX 300,海門市其林貝爾儀器制造有限公司),倒置顯微鏡(型號TS100-F,日本Nikon),酶標(biāo)儀(型號iMark Microplate Reader,美國Bio-Rad)。

        2 方法

        2.1 分組、造模及給藥

        60只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組和益氣解毒化瘀方低、中、高劑量組,每組10只。造模前大鼠禁食不禁水24 h,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,將直徑約1.5 mm的聚丙烯管插入肛門上端約8 cm,將TNBS原液0.2 mL/100 g加50%乙醇0.25 mL[8-9],緩慢注入腸腔,提起大鼠尾部,倒置約30 s使造模劑充分接觸腸腔??瞻捉M予等體積生理鹽水。造模第3日大鼠出現(xiàn)進(jìn)食量減少、豎毛、懶動、黏液血便等表現(xiàn),表明造模成功,剖腹摘取直腸和結(jié)腸,清洗后肉眼觀察結(jié)腸水腫情況。

        造模第4日開始給藥,根據(jù)人與動物等效劑量換算法及前期經(jīng)驗[9-10],益氣解毒化瘀方低、中、高劑量組分別按人等效劑量的0.5、1、2倍灌胃益氣解毒化瘀方藥液(6.85、13.7、27.4 g/kg),柳氮磺吡啶組按0.4 g/kg灌胃,體積1 mL/100 g,正常組及模型組予等體積生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)2周。

        2.2 標(biāo)本采集

        末次給藥24 h后,脫頸椎法處死大鼠,腹主動脈采血,用于ELISA檢測。取肛門至盲腸部結(jié)腸(約8 cm),沿腸系膜縱軸剪開,用冷生理鹽水沖洗干凈后平展于濾紙上,一部分用10%甲醛溶液固定,進(jìn)行HE染色;剩余組織迅速置于離心管中,置于-80 ℃冰箱保存,用于Western blot檢測。

        2.3 結(jié)腸組織形態(tài)觀察

        結(jié)腸組織用10%甲醛溶液固定后,常規(guī)脫水,浸蠟,透明,包埋,4 μm厚度切片,進(jìn)行HE染色后觀察結(jié)腸組織病理變化。

        2.4 ELISA檢測

        取血后靜置2 h,3 000 r/min離心10 min,取上清液,采用ELISA試劑盒測定IL-6、IL-23、IL-17含量,嚴(yán)格按說明書步驟操作。

        2.5 Western blot檢測

        結(jié)腸組織用勻漿機(jī)破碎,加入裂解液提取總蛋白,使用10%分離膠進(jìn)行蛋白電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶封閉,加入IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt一抗(均為1∶1 000),4 ℃孵育過夜,洗膜5次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液,37 ℃孵育1~2 h,加入ECL發(fā)光液,化學(xué)發(fā)光檢測器中曝光,以GAPDH為內(nèi)參,Image J軟件測量蛋白相對灰度值。

        3 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以表示,組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        4 結(jié)果

        4.1 益氣解毒化瘀方對模型大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

        空白組大鼠腸黏膜形態(tài)正常,無充血、水腫、糜爛、潰瘍;模型組大鼠結(jié)腸黏膜可見潰瘍形成,有大量炎性細(xì)胞和壞死細(xì)胞碎片,并伴有出血,累及黏膜下層,局部黏膜壞死,腺體結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂;與模型組比較,各給藥組炎性細(xì)胞浸潤程度有所減輕,隱窩結(jié)構(gòu)改變有所緩解,益氣解毒化瘀方中、高劑量組和柳氮磺吡啶組改善效果更為明顯。見圖1。

        圖1 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)(HE染色,×200)

        4.2 益氣解毒化瘀方對模型大鼠血清白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-17、白細(xì)胞介素-23含量的影響

        與空白組比較,模型組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23含量均顯著增加(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,益氣解毒化瘀方中、高劑量組和柳氮磺吡啶組IL-6、IL-17含量顯著減少(P<0.05,P<0.01),IL-23含量有所減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

        圖2 各組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23含量比較(,每組6只)

        4.3 益氣解毒化瘀方對模型大鼠結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-6、Janus激酶2、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3、維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt蛋白表達(dá)的影響

        與空白組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,益氣解毒化瘀方中、高劑量組和柳氮磺吡啶組大鼠結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

        圖3 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)比較(,每組6只)

        5 討論

        JAK/STAT是一條由細(xì)胞因子刺激的多效級聯(lián)反應(yīng)信號通路,不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡,且在免疫系統(tǒng)發(fā)育和應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Janus激酶(JAK)是一種酪氨酸蛋白激酶,目前發(fā)現(xiàn)JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2(Tyk2)共4個成員。STAT是一類能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的胞質(zhì)蛋白家族,是JAK家族的直接下游底物[11-13]。STAT3位于IL-6通路下游,對Th17細(xì)胞的生成、分化至關(guān)重要。Th17細(xì)胞是CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的新亞型,可介導(dǎo)慢性炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生,主要分泌IL-17、IL-21和IL-22等炎癥因子[14-16]。Th17細(xì)胞的早期分化主要受轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和IL-6的協(xié)同誘導(dǎo),而已分化的Th17細(xì)胞存活及增殖則需IL-23刺激來維持,IL-23主要通過介導(dǎo)JAK/STAT信號通路上調(diào)IL-6等炎癥因子表達(dá),參與維持Th17細(xì)胞存活及增殖[17-19]。RORγt是控制Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)編碼IL-17細(xì)胞因子基因表達(dá)[20]。

        JAK/STAT信號通路除在細(xì)胞活動中發(fā)揮重要作用外,還與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[21-23]。當(dāng)腸道上皮細(xì)胞受到外界因子刺激時,前炎癥因子刺激樹突狀細(xì)胞成熟并產(chǎn)生炎癥因子如IL-6、IL-23等,炎癥因子進(jìn)一步與相應(yīng)受體結(jié)合,導(dǎo)致受體發(fā)生二聚化或多聚化,使JAK1、JAK2磷酸化并激活STAT3,p-STAT3可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)Th17細(xì)胞分化,產(chǎn)生IL-17、IL-21、IL-22等,從而上調(diào)炎癥因子水平,誘導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致UC[24-26]。

        益氣解毒化瘀方由白頭翁湯和芍藥湯化裁而來,對UC具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。方中黨參、麩炒白術(shù)、薏苡仁健脾益氣,赤芍、白芍養(yǎng)血調(diào)血、柔肝止痛,三七、白及活血化瘀、止血去瘀,促進(jìn)潰瘍面愈合,馬齒莧為治痢之良藥,兼具清熱解毒涼血之功,煨木香、黃連、黃芩共奏清熱解毒、理氣調(diào)中之功,炒谷芽調(diào)和諸藥。全方具有益氣健脾、活血化瘀、清熱涼血解毒功效。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23水平升高,結(jié)腸黏膜可見潰瘍、出血及壞死,益氣解毒化瘀方可降低UC大鼠血清IL-6、IL-17水平,改善結(jié)腸黏膜損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)顯著升高,表明Th17細(xì)胞分化增多,產(chǎn)生大量炎癥因子。經(jīng)益氣解毒化瘀方干預(yù)后,模型大鼠結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)降低,說明JAK2/STAT3信號通路被抑制,炎癥因子生成減少,炎癥反應(yīng)減輕,從而發(fā)揮治療UC的作用。

        綜上,益氣解毒化瘀方可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路,降低炎癥因子水平,減輕免疫炎癥反應(yīng),發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究可為中醫(yī)藥治療UC提供實驗依據(jù)。

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