倪鈺瑩，范淑月，崔穎，高婧，羅再奕，劉敏

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由IgE介導(dǎo)、Th2細胞驅(qū)動、針對吸入性變應(yīng)原反應(yīng)引起的鼻黏膜炎癥性疾病[1]。誘發(fā)AR的因素主要有塵螨、花粉、霉菌等[2]。鼻黏膜上皮細胞是抵御病原體入侵和過敏原滲透的第一道生理屏障。緊密連接位于上皮細胞頂端，參與細胞旁運輸?shù)恼{(diào)節(jié)，對維持上皮屏障功能具有關(guān)鍵作用[3]。上皮屏障受損可以促進上皮細胞的旁轉(zhuǎn)運，增加變應(yīng)原滲入，誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生，觸發(fā)肥大細胞脫顆粒，從而導(dǎo)致AR發(fā)生發(fā)展[4]。RhoA/ROCK信號通路參與調(diào)節(jié)多種細胞功能，如細胞收縮、黏附、遷移等[5]。RhoA/ROCK通路激活可以誘導(dǎo)細胞周圍F-肌動蛋白（F-actin）細胞骨架的動態(tài)重組和收縮，改變緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能，增加細胞旁通透性[6]。因此，保護上皮細胞屏障功能以減少變應(yīng)原滲入可能是防治AR的重要策略。

AR屬中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”“鼽嚏”等范疇，病機多為肺經(jīng)感寒、腎陽虛衰。麻黃細辛附子湯出自《傷寒論》，由麻黃、細辛、附子組成，有散寒通竅、溫陽固表之效，對防治AR效果顯著[7-8]。麻黃輕揚發(fā)散，善宣肺氣、開腠理、透毛竅，是治療AR常用藥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，麻黃細辛附子湯在AR適應(yīng)性免疫方面，可以調(diào)控T細胞細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子表達，逆轉(zhuǎn)Th2偏移，恢復(fù)Th1/Th2動態(tài)平衡[9-10]；在固有免疫方面，可以下調(diào)樹突狀細胞抗原提呈能力[11-12]，抑制2型固有淋巴細胞功能發(fā)揮[13]。此外，在麻黃細辛附子湯及其拆方干預(yù)T細胞研究中發(fā)現(xiàn)，麻黃單用也具有顯著免疫調(diào)節(jié)作用[9]。本實驗通過塵螨變應(yīng)原Der p1誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細胞屏障損傷，進一步探討麻黃細辛附子湯及麻黃的屏障保護作用及其潛在機制，為臨床治療AR提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞

人鼻黏膜上皮細胞（HNEpC）由北納生物提供，貨號356247。

1.2 藥物及制備

麻黃細辛附子湯由麻黃、細辛、附子按6∶3∶9比例組成，飲片購于北京仟草中藥飲片有限公司。常規(guī)方法煎煮，濃縮，制成1 g/mL水煎液，4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液，0.22 μm濾器過濾后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩７Q取適量麻黃，同法制成1 g/mL麻黃水煎液，離心，過濾后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器

MEM培養(yǎng)基（上海逍鵬生物公司，貨號C3050），胎牛血清（美國HyClone公司，貨號SH30406.05），不含酚紅MEM培養(yǎng)基（武漢普諾賽公司，貨號PM150418），塵螨變應(yīng)原Der p1（美國Greer Lab，貨號XPB91D3A2.5），ROCK抑制劑Y-27632（美國Selleck公司，貨號S1049），F(xiàn)ITC-Dextran（上海源葉生物，貨號S28503），CCK-8試劑盒（北京蘭博利德公司，貨號CK001），BCA蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物，貨號KGP902），咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白1（Claudin-1）抗體（北京博奧森生物公司，貨號bs-10011R、bsm-52037M），RhoA、ROCK1抗體（武漢三鷹生物，貨號10749-1-AP、21850-1-AP），抗熒光衰減封片劑（北京索萊寶，貨號S2110）。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，型號3111），Millicell電阻測量儀（美國Millipore公司，型號ESR-2），酶標儀（美國Thermo公司，型號Varioskan LUX），熒光顯微鏡（美國Echo公司，型號Revolve），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能公司，型號5200）。

2 實驗方法

2.1 造模濃度及時間篩選

HNEpC以MEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞，接種于Transwell板，將細胞分為對照組和Der p1組，待細胞融合至單層后，PBS清洗2遍，換不含血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，對照組正常培養(yǎng)，Der p1組加入終濃度為1、5、10 μg/mL Der p1（基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制）培養(yǎng)1、6、12、24 h，檢測細胞標準化跨膜電阻（TER）及FITCDextran通透性，確定造模濃度及造模時間。

2.2 CCK-8法篩選最佳干預(yù)濃度

將HNEpC以5×104個/孔接種于96孔板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?？瞻捉M只加培養(yǎng)基不含細胞，對照組加入培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，麻黃細辛附子湯組和麻黃組分別加入0.5、1、2、5、10 mg/mL麻黃細辛附子湯或麻黃水煎液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制）培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min，酶標儀波長450 nm處測定各孔吸光度（A），計算細胞存活率。存活率（%）=（A給藥組-A空白組）÷（A對照組-A空白組）×100%。

2.3 細胞分組及處理

將細胞分為對照組、模型組、麻黃組、抑制劑組和麻黃細辛附子湯低、中、高劑量組，每組3個復(fù)孔。對照組正常培養(yǎng)，其余各組加入10 μg/mL Der p1造模，麻黃組同時加入0.5 mg/mL麻黃水煎液，抑制劑組造模前加入10 μmol/L Y-27632預(yù)處理4 h，麻黃細辛附子湯低、中、高劑量組造模同時加入0.5、1、2 mg/mL麻黃細辛附子湯水煎液，分別置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

2.4 細胞跨膜電阻測定

HNEpC以1.5×105個/孔接種于12孔Transwell上室，每孔500 μL，下室加入1 mL完全培養(yǎng)基，待細胞融合成單層后，饑餓培養(yǎng)12 h，再按“2.3”項下方法處理，另設(shè)2個空白孔（只含培養(yǎng)基、不含細胞）。干預(yù)結(jié)束后，細胞電阻儀檢測電阻值，計算TER。TER=（測定電阻值-空白電阻值）×有效濾膜面積（1.12 cm2）。實驗結(jié)果以標準化TER（實驗組TER÷對照組TER×100%）表示。

2.5 FITC-Dextran通透性測定

HNEpC以5×104個/孔接種于24孔Transwell上室，每孔200 μL，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，待細胞融合成單層后，饑餓培養(yǎng)12 h，再按“2.3”項下方法處理，上室加入200 μL 0.5 mg/mL FITC-Dextran（不含酚紅MEM培養(yǎng)基配制），下室加入500 μL不含酚紅MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。分別從每孔上、下室取100 μL液體加入黑色96孔板內(nèi)，酶標儀激發(fā)波長495 nm、發(fā)射波長520 nm檢測熒光值，計算FITCDextran通透性[14]（實驗組熒光值÷對照組熒光值×100%）。

2.6 Western blot檢測

HNEpC以1×106個/孔接種于6孔板，待細胞融合成單層后，饑餓培養(yǎng)12 h，再按“2.3”項下方法處理。PBS清洗2次，每孔加入150 μL裂解液，冰上裂解5 min，14 000×g離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加Occludin（1∶2 000）、Claudin-1（1∶1 000）、RhoA（1∶1 000）、ROCK1（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯影液顯影，Image J軟件分析目的蛋白灰度值。

2.7 免疫熒光檢測F-actin表達

HNEpC以2×105個/孔接種于24孔板，待細胞融合成單層后，饑餓培養(yǎng)12 h，再按“2.3”項下方法處理。PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%Triton X-100通透10 min，每孔加入300 μL羅丹明標記鬼筆環(huán)肽，室溫避光孵育30 min，滴加抗熒光衰減封片劑，熒光顯微鏡下觀察并拍照，Image J軟件分析F-actin熒光強度。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 造模條件確定

與對照組比較，5、10 μg/mL Der p1處理HNEpC 6、12、24 h后標準化TER顯著降低，以10 μg/mL Der p1處理24 h標準化TER降低最顯著（P＜0.01）。見表1。與對照組比較，5、10 μg/mL Der p1處理HNEpC 24 h后FITC-Dextran通透性顯著增加，以10 μg/mL Der p1增加最顯著（P＜0.01），見表2。綜合TER及FITC-Dextran通透性結(jié)果，后續(xù)選用10 μg/mL Der p1處理24 h作為造模條件。

表1 不同濃度Der p1處理不同時點的HNEpC標準化TER比較（，%，n=3）

表1 不同濃度Der p1處理不同時點的HNEpC標準化TER比較（，%，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01

組別對照組Der p1組24 h 100.00±12.00 90.67±10.07 70.67± 6.11**48.00± 4.00**濃度/（μg/mL）1 5 1 0 1 h 100.00±9.44 97.50±7.81 97.50±5.73 98.75±3.75 6 h 100.00±3.85 93.59±8.01 78.21±5.88**62.82±9.68**12 h 100.00±5.95 93.51±9.80 75.32±3.90**58.44±8.11**

表2 不同濃度Der p1對HNEpC FITC-Dextran通透性的影響（，%）

表2 不同濃度Der p1對HNEpC FITC-Dextran通透性的影響（，%）

注：與對照組比較，**P＜0.01

FITC-Dextran通透性100.00±2.19 106.82±5.43 123.18±7.75**136.04±5.43**組別對照組Der p1組濃度/（μg/mL）1 5 1 0 n3 3 3 3

4.2 麻黃細辛附子湯及麻黃最佳干預(yù)濃度篩選

CCK-8結(jié)果表明，與對照組比較，麻黃細辛附子湯濃度在0～2 mg/mL時對細胞存活率無影響，濃度為5、10 mg/mL時細胞存活率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。因此后續(xù)采用0.5、1、2 mg/mL作為麻黃細辛附子湯低、中、高劑量進行干預(yù)。與對照組比較，1 mg/mL麻黃組細胞存活率有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），2 mg/mL麻黃組細胞存活率顯著降低（P＜0.01），因此后續(xù)采用0.5 mg/mL麻黃進行干預(yù)。見表3。

表3 不同濃度麻黃細辛附子湯及麻黃對HNEpC存活率的影響（，%）

表3 不同濃度麻黃細辛附子湯及麻黃對HNEpC存活率的影響（，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

細胞存活率100.00±2.65 103.47±6.43 106.18±2.61 101.39±3.41 91.90±4.38*83.15±8.78**100.00±3.87 100.45±4.66 93.95±4.72 87.37±4.76**80.31±2.39**64.06±4.37**組別對照組麻黃細辛附子湯組濃度/（mg/mL）0.5 1 2 5 1 0對照組麻黃組0.5 1 2 5 1 0 n4 4 4 4 4 44 4 4 4 4 4

4.3 麻黃細辛附子湯對人鼻黏膜上皮細胞形態(tài)的影響

對照組HNEpC排列緊密，模型組HNEpC排列疏松，間隙增大，上皮完整性破壞，出現(xiàn)環(huán)形損傷；麻黃組、抑制劑組和麻黃細辛附子湯低、中、高劑量組HNEpC排列較緊密，上皮損傷明顯修復(fù)。見圖1。

圖1 各組HNEpC形態(tài)（標尺=100 μm）

4.4 麻黃細辛附子湯對人鼻黏膜上皮細胞跨膜電阻的影響

與對照組比較，模型組HNEpC標準化TER顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃組、抑制劑組和麻黃細辛附子湯低、中、高劑量組HNEpC標準化TER顯著升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組HNEpC標準化TER比較（，%）

表4 各組HNEpC標準化TER比較（，%）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

標準化TER組別n 100.00± 9.45 50.00± 7.14**79.76± 8.99△△86.90± 7.43△△91.67±10.91△△83.33± 5.46△△88.10± 5.46△△對照組模型組麻黃細辛附子湯低劑量組麻黃細辛附子湯中劑量組麻黃細辛附子湯高劑量組麻黃組抑制劑組3 3 3 3 3 3 3

4.5 麻黃細辛附子湯對人鼻黏膜上皮細胞通透性的影響

與對照組比較，模型組HNEpC FITC-Dextran通透性顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃組、抑制劑組和麻黃細辛附子湯低、中、高劑量組HNEpC FITCDextran通透性顯著降低（P＜0.01），以麻黃細辛附子湯高劑量組效果最顯著（P＜0.05，P＜0.01）。見表5。

表5 各組HNEpC FITC-Dextran通透性比較（，%）

表5 各組HNEpC FITC-Dextran通透性比較（，%）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與麻黃細辛附子湯高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

FITC-Dextran通透性100.00±5.19 138.28±6.07**120.23±9.56△△##118.92±9.79△△##101.50±3.86△△110.21±7.15△△115.04±6.59△△#組別對照組模型組麻黃細辛附子湯低劑量組麻黃細辛附子湯中劑量組麻黃細辛附子湯高劑量組麻黃組抑制劑組n3 3 3 3 3 3 3

4.6 麻黃細辛附子湯對人鼻黏膜上皮細胞咬合蛋白、閉合蛋白-1、RhoA、ROCK1蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞Occludin、Claudin-1蛋白表達顯著降低，RhoA、ROCK1蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃組、抑制劑組和麻黃細辛附子湯低、中、高劑量組細胞Occludin、Claudin-1蛋白表達顯著升高，RhoA、ROCK1蛋白表達顯著降低（P＜0.01），以麻黃細辛附子湯高劑量組效果最顯著（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表6。

圖2 各組HNEpC Occludin、Claudin-1、RhoA、ROCK1蛋白免疫印跡

表6 各組HNEpC Occludin、Claudin-1、RhoA、ROCK1蛋白表達比較（）

表6 各組HNEpC Occludin、Claudin-1、RhoA、ROCK1蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與麻黃細辛附子湯高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

ROCK1 1.00±0.01 1.28±0.06**1.13±0.03△△##0.96±0.03△△##0.76±0.02△△0.80±0.02△△0.82±0.03△△#組別對照組模型組麻黃細辛附子湯低劑量組麻黃細辛附子湯中劑量組麻黃細辛附子湯高劑量組麻黃組抑制劑組n3 3 3 3 3 3 3 Occludin 1.00±0.09 0.38±0.03**0.98±0.03△△##0.98±0.09△△##1.39±0.04△△1.21±0.06△△##0.69±0.08△△##Claudin-1 1.00±0.10 0.31±0.02**0.80±0.08△△##0.90±0.04△△##1.95±0.11△△1.66±0.05△△##0.95±0.12△△##RhoA 1.00±0.02 1.95±0.04**1.68±0.09△△##1.14±0.07△△1.05±0.06△△0.98±0.08△△1.05±0.12△△

4.7 麻黃細辛附子湯對人鼻黏膜上皮細胞F-肌動蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞F-actin表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃細辛附子湯低、中、高劑量組和抑制劑組細胞F-actin表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、表7。

圖3 各組HNEpC F-actin陽性表達（免疫熒光染色，標尺=130 μm）

表7 各組HNEpC F-actin表達比較（）

表7 各組HNEpC F-actin表達比較（）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與麻黃細辛附子湯高劑量組比較，##P＜0.01

平均熒光強度15.56±0.75 19.64±0.52**17.78±0.68△17.44±0.99△17.25±1.52△△19.68±0.18##17.29±1.22△△組別對照組模型組麻黃細辛附子湯低劑量組麻黃細辛附子湯中劑量組麻黃細辛附子湯高劑量組麻黃組抑制劑組n3 3 3 3 3 3 3

5 討論

AR是發(fā)生在鼻黏膜的2型炎癥反應(yīng)。鼻黏膜上皮細胞作為鼻腔的免疫屏障，參與先天免疫及適應(yīng)性免疫，發(fā)揮重要的防御作用[15]。接觸變應(yīng)原后，上皮屏障損傷，通透性增加，促進上皮源性細胞因子及趨化因子釋放，啟動適應(yīng)性免疫，激活多種效應(yīng)細胞，釋放炎癥介質(zhì)，進一步造成屏障損傷[16]。屏障損傷與2型炎癥反應(yīng)相互促進，在AR過程中形成惡性循環(huán)[17-18]。麻黃細辛附子湯中麻黃散寒邪而發(fā)表，附子溫腎陽而補虛，細辛通徹表里，為麻附之臂助。三藥合用，補散兼施，對于AR標本兼治，療效持久。鼻黏膜上皮細胞處于機體淺表位置，是整個變態(tài)反應(yīng)的始動環(huán)節(jié)，麻黃氣味俱薄，輕清而浮，能行周身肌表，是否對屏障功能有干預(yù)作用需通過實驗確證。

細胞間連接完整性是維持黏膜屏障的關(guān)鍵因素，緊密連接位于細胞間連接頂部，介導(dǎo)細胞黏附，封閉細胞間隙，嚴格調(diào)控離子、水和各種分子的細胞旁運輸[3]。Occludin、Claudin-1是緊密連接的關(guān)鍵蛋白。Occludin調(diào)節(jié)緊密連接滲漏途徑，允許較大分子通過，Claudin-1調(diào)節(jié)緊密連接孔道途徑，負責小分子和離子的通透性[19]。研究表明，AR患者鼻黏膜上皮部分緊密連接蛋白表達水平降低，黏膜通透性增加[20]。TER可反映跨上皮細胞離子流量大小，TER增加表明離子滲透性降低[21]。不同右旋糖酐（Dextran）可用于檢測溶質(zhì)和大分子的通透性[22]。TER及FITC-Dextran通透性常用于評價上皮屏障功能。F-actin是細胞骨架的關(guān)鍵組分，參與調(diào)節(jié)多種細胞的高通透性[23-24]。F-actin細胞骨架與Occludin、Claudin-1等蛋白相連，共同維持屏障穩(wěn)定性[25]。RhoA/ROCK信號通路在調(diào)控肌動蛋白動力學(xué)及其他生物過程中發(fā)揮核心作用[26]。RhoA-GTP能激活ROCK，促進F-actin表達及重新排布，增加細胞張力，導(dǎo)致細胞收縮及細胞旁間隙的形成[27-28]。此外，F(xiàn)-actin重排可使緊密連接復(fù)合物穩(wěn)定性破壞，細胞間連接受損，屏障結(jié)構(gòu)及功能異常[29]。RhoA/ROCK除調(diào)控F-actin引起屏障損傷外，還可直接磷酸化緊密連接蛋白，并在連接結(jié)構(gòu)基本保持不變的情況下增加溶質(zhì)滲透性[30]。Y-27632是一種選擇性Rho激酶抑制劑，通過與ATP競爭Rho激酶催化結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點抑制Rho激酶活化[31]。

本實驗選用常見過敏原Der p1構(gòu)建HNEpC屏障損傷模型，經(jīng)麻黃細辛附子湯、麻黃、抑制劑干預(yù)后，TER升高，F(xiàn)ITC-Dextran通透性降低，細胞排列緊密，環(huán)形損傷修復(fù)，緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1表達升高，表明麻黃細辛附子湯、麻黃、抑制劑對Der p1引起的屏障損傷均具有修復(fù)作用，以高劑量麻黃細辛附子湯效果最為顯著。為探索麻黃細辛附子湯及麻黃發(fā)揮屏障保護作用的機制，進一步以RhoA/ROCK信號通路為切入點，檢測通路關(guān)鍵蛋白RhoA、ROCK1及下游蛋白F-actin表達。結(jié)果顯示，麻黃細辛附子湯能降低RhoA、ROCK1、F-actin表達，而麻黃可降低RhoA、ROCK1表達，結(jié)合全方對緊密連接蛋白的優(yōu)勢調(diào)節(jié)作用，一定程度上可以反映方藥配伍的科學(xué)性。但該結(jié)果也可能與實驗中所設(shè)麻黃藥物濃度有關(guān)，今后可設(shè)置不同濃度的麻黃組，進一步對比全方與麻黃單味藥的作用差異。

綜上所述，麻黃細辛附子湯及麻黃能有效修復(fù)Der p1誘導(dǎo)的鼻黏膜上皮細胞屏障損傷，其作用可能是通過抑制RhoA/ROCK信號通路，減少F-actin聚集、收縮、重排，上調(diào)緊密連接蛋白表達，降低上皮通透性實現(xiàn)的。本實驗中麻黃細辛附子湯及麻黃屏障保護作用顯著，可深入探索其配伍機制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，鼻黏膜上皮細胞與其他免疫細胞的關(guān)系也具有潛在研究價值。