張尚龍 ，閆瀟 ，楊秀娟 ，楊志軍 ，連小龍 ，張楠 ，葉禮巧 ，楊必乾 ，殷亭湄 ，付曉艷 ，馬趣環(huán) ，鄧毅，

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、分子靶向治療等。由于肺癌早期癥狀不明顯，惡性程度較高，很多患者在確診時(shí)已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，無(wú)法接受手術(shù)治療，故化療的作用不可替代。然而大劑量或重復(fù)低劑量化療藥物會(huì)引起較強(qiáng)的不良反應(yīng)，且導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥性。甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效[1]。藥理研究表明，甘草具有抗腫瘤、抗炎殺菌、抗病毒、保肝、抗心力衰竭、調(diào)節(jié)免疫及抗纖維化等作用[2]。近年來(lái)，甘草有效成分如甘草次酸、甘草苷、異甘草素等在抗肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤的研究取得了一定進(jìn)展[3-7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)甘草抗肺癌作用進(jìn)行靶點(diǎn)與通路篩選，并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為后續(xù)深入研究及新藥開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 甘草活性成分及靶點(diǎn)收集

通過(guò)TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%且類(lèi)藥性（DL）≥0.18為條件篩選甘草的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)；通過(guò)R語(yǔ)言軟件獲得靶點(diǎn)的縮寫(xiě)名稱(chēng)，構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.1.2 肺癌靶點(diǎn)收集

以“l(fā)ung cancer”為關(guān)鍵詞，通過(guò)GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（http://https://omim.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病靶點(diǎn)，檢索結(jié)果合并后去重，得到肺癌相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.3 甘草治療肺癌靶點(diǎn)收集

將甘草靶點(diǎn)與肺癌相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)微生信在線(xiàn)平臺(tái)（https://www.bioinformatics.com.cn/）可視化得到甘草-肺癌共有靶點(diǎn)，即為甘草治療肺癌的靶點(diǎn)。

1.1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，在“organism”中選擇“Homo Sapiens”進(jìn)行搜索，獲得蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出TSV格式文件，將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.0（http://www.cytoscape.org/）軟件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.1.5 GO和KEGG通路富集分析

通過(guò)Metascape（http://metascape.org/）在線(xiàn)軟件對(duì)獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）。將分析結(jié)果前10條進(jìn)行可視化。

1.1.6 共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共有靶點(diǎn)及化合物通過(guò)Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 藥物與細(xì)胞

甘草采自甘肅省金塔縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。甘草提取物制備方法：稱(chēng)取甘草粉末100 g，加50%乙醇（1∶10，W/V）浸提30 min，超聲提?。üβ?00 W，頻率60 kHz）30 min，真空抽濾后，減壓回收溶劑至50 mL，水浴加熱至干浸膏，快速研磨成細(xì)粉[8]，4 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM高糖培養(yǎng)基配制成50 mg/mL母液。

人肺腺癌A549細(xì)胞，甘肅省腫瘤醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.2.2 試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（Cytiva公司，批號(hào)AH29027412），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)21030707），噻唑藍(lán)（MTT，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)917Q051），胰蛋白酶、青鏈霉素（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)GP2211017、GA22020011094），二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)1121E0331），兔抗β-actin、羊抗兔二抗（Abbkine公司，批號(hào)分別為ATVMA0302、ATVE16011），兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗HIF-1α及兔抗GLUT1（Abmart公司，批號(hào)分別為T(mén)40051、T40056、TA1009、T55360），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20211213）。

CO2恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)HF151，力康發(fā)展有限公司），酶標(biāo)儀（型號(hào)RT-6100，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司），電泳儀（型號(hào)DYY-6D，北京六一生物科技有限公司），超凈工作臺(tái)（型號(hào)B2HFsafe，上海力申科學(xué)有限公司），低溫冷凍離心機(jī)（型號(hào)H1650R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），熒光倒置顯微鏡（型號(hào)MoticamPro2058，上海捷辰儀器有限公司）。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的A549細(xì)胞迅速解凍，加入完全培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，加入5 mL配制好的完全培養(yǎng)液（10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液、89%高糖DEME培養(yǎng)基），輕輕吹打使細(xì)胞懸浮，轉(zhuǎn)移懸浮液至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，用胰酶消化并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將細(xì)胞消化懸浮后以5×104個(gè)/mL接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，分為調(diào)零組（不加細(xì)胞和藥物）、對(duì)照組（不加藥物）及給藥組，每組3個(gè)復(fù)孔，給藥組用不同濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）甘草提取物處理24 h，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），4 h后加入150 μL DMSO，混勻，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率（%）=（OD給藥組-OD調(diào)零組）÷（OD對(duì)照組-OD調(diào)零組）×100%。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、HIF-1α、GLUT1蛋白表達(dá)

將A549細(xì)胞分為對(duì)照組和甘草低、中、高劑量組，以1×105個(gè)/mL接種于6孔板中，待其貼壁后，甘草低、中、高劑量組加入不同濃度（3、4、5 mg/mL）甘草提取物處理24 h，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，于冰上加入細(xì)胞裂解液，分別提取總蛋白，加入上樣緩沖液，100 ℃金屬浴變性。根據(jù)分子量不同進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入Bax、Bcl-2、HIF-1α、GLUT1一抗（均為1∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜，1×TBST清洗3次，每次10 min，加二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，1×TBST清洗3次，每次10 min，曝光顯影，用Image J軟件計(jì)算灰度值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 甘草活性成分及靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP得到甘草化合物及靶點(diǎn)，刪去無(wú)靶點(diǎn)的化合物，最終得到甘草活性成分88個(gè)，靶點(diǎn)213個(gè)。

2.2 肺癌靶點(diǎn)

將GeneCards、OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)收集到的肺癌靶點(diǎn)進(jìn)行合并，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到肺癌靶點(diǎn)23 458個(gè)。

2.3 甘草抗肺癌靶點(diǎn)

將檢索到的213個(gè)甘草活性成分的靶點(diǎn)與23 458個(gè)肺癌靶點(diǎn)比較分析后取重復(fù)值，得到共同作用靶點(diǎn)209個(gè)，作為甘草治療肺癌的潛在靶點(diǎn)。

2.4 核心靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將209個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行分析，根據(jù)Degree值與中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality）高于平均值篩選出排名靠前的核心靶點(diǎn)43個(gè)。Degree值排序居前列的靶點(diǎn)有MAPK1、MAPK3、MMP2、MMP9、AKT1、VEGFA及HIF1A等。這些靶點(diǎn)主要參與細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移、凋亡、細(xì)胞血管生成等過(guò)程。因此，蛋白質(zhì)分子之間的相關(guān)性表明這些靶點(diǎn)可能是甘草對(duì)肺癌起到核心調(diào)控作用的靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 甘草抗肺癌核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

對(duì)甘草抗肺癌209個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，共得到1 312條結(jié)果。其中BP 1 202條，主要涉及凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、蛋白磷酸化的正調(diào)控等；CC 46條，主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、過(guò)氧化物酶體、囊泡腔、細(xì)胞器外膜等；MF 64條，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、一氧化氮合酶的調(diào)節(jié)活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等。各前10條結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 甘草抗肺癌潛在靶點(diǎn)GO富集分析

對(duì)甘草抗肺癌209個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共得到226條通路，主要涉及癌癥相關(guān)通路、動(dòng)脈粥樣硬化、HIF-1信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝、小細(xì)胞肺癌、幽門(mén)螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，前10條通路見(jiàn)圖3。Bcl-2家族是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的一類(lèi)蛋白，包括Bcl-2等凋亡抑制因子和Bax等促凋亡因子。甘草主要活性成分甘草查爾酮A[9]、甘草次酸[10]、異甘草素[11]等通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。HIF-1信號(hào)通路是缺氧微環(huán)境的關(guān)鍵通路，HIF-1α作為調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)70多個(gè)基因，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等，調(diào)控惡性腫瘤的細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。因此，推測(cè)甘草可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的凋亡通路及HIF-1α信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖3 甘草抗肺癌潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.6 共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)

甘草與肺癌共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4。該網(wǎng)絡(luò)包含297個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 495條邊。

圖4 甘草抗肺癌共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)

2.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.7.1 不同濃度甘草提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組比較，1、2、3、4、5 mg/mL甘草提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖均有抑制作用（P＜0.01），表明甘草對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響有劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 各組A549細(xì)胞存活率比較（，n=3）

表1 各組A549細(xì)胞存活率比較（，n=3）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01

存活率/%100.00±1.55 72.21±1.61**66.73±0.22**58.89±0.44**44.62±7.02**22.11±0.30**組別對(duì)照組給藥組濃度/（mg/mL）1 2 3 4 5

2.7.2 甘草對(duì)A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、HIF-1α、GLUT1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，甘草各劑量組Bcl-2、HIF-1α、GLUT1表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），表明甘草對(duì)HIF-1α信號(hào)通路有抑制作用。見(jiàn)表2、圖5。

表2 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、HIF-1α和GLUT1蛋白表達(dá)比較（，/β-actin，n=3）

表2 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、HIF-1α和GLUT1蛋白表達(dá)比較（，/β-actin，n=3）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別對(duì)照組甘草低劑量組甘草中劑量組甘草高劑量組GLUT1 1.39±0.05 0.96±0.02**0.57±0.06**0.30±0.06**濃度/（mg/mL）3 4 5 Bax 0.17±0.02 0.41±0.11**0.52±0.13**1.17±0.23**Bcl-2 1.44±0.07 0.69±0.04**0.52±0.08**0.23±0.07**HIF-1α 0.95±0.08 0.59±0.01**0.54±0.03**0.41±0.03**

圖5 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、HIF-1α和GLUT1蛋白免疫印跡

3 討論

目前肺癌治療以化療為主，而化療藥物的不良反應(yīng)限制其臨床應(yīng)用。甘草作為臨床常用藥物，可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)自噬、抑制糖酵解、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)控miRNA和多種信號(hào)通路等作用機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。但甘草抗肺癌的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)甘草抗肺癌的機(jī)制進(jìn)行研究，獲得88個(gè)藥物活性成分、209個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析獲得MAPK1、MAPK3、MMP2、MMP9及HIF1A等43個(gè)核心靶點(diǎn)。此外，通過(guò)對(duì)209個(gè)關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，推測(cè)甘草活性成分靶點(diǎn)通過(guò)癌癥相關(guān)通路、HIF-1信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡。

本研究篩選出甘草提取物3、4、5 mg/mL 3種給藥濃度作用于人肺癌A549細(xì)胞，并選擇富集程度較高的HIF-1α信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。與對(duì)照組比較，不同濃度甘草提取物均可抑制A549細(xì)胞增殖且具有濃度依賴(lài)性，甘草各劑量組能上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、HIF-1α及GLUT1表達(dá)。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法，對(duì)甘草抗肺癌機(jī)制進(jìn)行研究，驗(yàn)證了甘草抗肺癌多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，提示甘草抗肺癌的作用機(jī)制可能與抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及調(diào)控HIF-1α信號(hào)通路有關(guān)，相關(guān)機(jī)制仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究可為甘草的臨床應(yīng)用及抗腫瘤新藥的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。今后課題組將利用代謝組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)等多種手段結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)甘草抗肺癌的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。