張夢奇，王瓊芬，李 彬，劉 婷，張紅萍，石 婧，徐 虹，鄭國平

（浙江省舟山市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江舟山 316000）

西紅花為鳶尾科植物番紅花Crocus sativusL. 的干燥柱頭，原產(chǎn)于地中海、歐洲南部地區(qū)和伊朗，現(xiàn)我國多個省份均有栽培。西紅花不僅是世界著名的天然香料和食用染料，也是名貴的中藥材，收載于2020 年版《中國藥典（一部）》，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神等功效［1-2］。其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)為類胡蘿卜素及其糖苷類衍生物，包括西紅花苷類（西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ和西紅花苷- Ⅳ）、苦番紅花素、西紅花酸和西紅花醛［3-4］。有關(guān)西紅花的研究主要集中于指標(biāo)成分定量測定［5］，也有用于質(zhì)量評價的指紋圖譜研究［6-7］，但尚未見結(jié)合化學(xué)模式識別用于產(chǎn)地區(qū)分的相關(guān)報道。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別分析可有效表征和評價中藥的內(nèi)在和整體質(zhì)量，并解釋藥材復(fù)雜成分的隱藏規(guī)律，客觀評價不同產(chǎn)地間的品質(zhì)差異［8］。西紅花相關(guān)對照品主要提取于西紅花藥材［9］，檢測成本高。一測多評（QAMS）是適合中藥特點的多指標(biāo)成分質(zhì)量評價新模式，在中藥多指標(biāo)成分的含量測定中應(yīng)用廣泛［10］，可大幅降低檢測成本。故本研究中建立了西紅花的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，采用相似度評價、聚類分析和正交偏最小二乘法- 判別分析（OPLS-DA）對市售西紅花藥材的質(zhì)量進(jìn)行綜合評價；并建立了以西紅花苷- Ⅰ作為內(nèi)參物，測定苦番紅花素及4 種西紅花苷類成分的QAMS 法，旨在為不同產(chǎn)地西紅花藥材的質(zhì)量控制和評價提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Waters Arc 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Shimadzu LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；XSE205DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為0.01 mg）；KQ-300VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為45 kHz）；Milli - Q 型超純水儀（美國Milipore公司）。

1.2 試藥

苦番紅花素對照品（批號為112056-202102，含量為97.3%），西紅花苷- Ⅰ對照品（批號為111588 -201704，含量為88.4%），西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枮?11589-201705，含量為92.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；西紅花苷-Ⅲ對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq-21081003，含量為99.75%）；西紅花苷-Ⅳ對照品（成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司，批號為DST201110-181，含量為98.07%）；甲醇、乙腈（色譜純，J. T. Baker 公司）；水為Milli-Q自制水，其他試劑均為分析純；30批西紅花藥材樣品均購自浙江省內(nèi)藥品批發(fā)、零售企業(yè)，經(jīng)浙江省舟山市食品藥品檢驗檢測研究院鄭國平主任中藥師鑒定為正品，樣品信息見表1。

表1 30批西紅花藥材樣品信息Tab.1 Information of 30 batches of Croci Stigma

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～6 min 時15%A →30%A，6～12 min 時30%A，12～14 min 時30%A →35%A，14～16 min 時35%A →50%A，16～20 min 時50%A →60%A，20～25 min 時60%A）；流速：0.3 mL/min；檢測波長：254 nm（0～8 min，苦番紅花素），440 nm（8～25 min，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ和西紅花苷- Ⅳ）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：4μL。

2.2 溶液制備

分別取苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ和西紅花苷- Ⅳ對照品各適量，精密稱定，加稀乙醇制成質(zhì)量濃度分別為18.27，28.85，9.95，2.96，1.18 μg/ mL 的混合對照品溶液。取西紅花藥材細(xì)粉10 mg，精密稱定，置50 mL 棕色容量瓶中，加稀乙醇適量，置冰浴中超聲處理20 min，放至室溫，加稀乙醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 UPLC 指紋圖譜建立與分析

2.3.1 方法學(xué)考察

精密度試驗：精密量取2.2 項下供試品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，以峰4 為參照峰，分別計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果的RSD分別為0.19%～1.94%和0.06%～0.24%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號S16），按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，10，12 h 時按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰4 為參照峰，分別計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果的RSD分別為0.21%～1.84%和0.03%～0.37%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號S16），取穩(wěn)定性試驗項下供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰4為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果的RSD分別為0.17%～2.23%和0.04%～0.95%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.2 指紋圖譜生成與相似度評價

取30批（編號為S1-S30）西紅花藥材各適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）對色譜圖進(jìn)行分析，將S1 樣品的圖譜作為參照圖譜，時間窗為0.1 min，采用中位數(shù)法，經(jīng)過多點校正和全譜峰匹配，生成對照指紋圖譜（R），共標(biāo)識11 個共有峰，詳見圖1。通過與混合對照品溶液色譜圖進(jìn)行比對，指認(rèn)出5 個共有峰，其中，峰1 為苦番紅花素，峰4為西紅花苷-Ⅰ（參照峰S），峰6為西紅花苷-Ⅱ，峰7為西紅花苷-Ⅳ，峰10為西紅花苷-Ⅲ，詳見圖2。30 批樣品指紋圖譜相似度為0.983～0.999，詳見表2。所有樣品相似度均大于0.98，表明不同產(chǎn)地、不同批次西紅花藥材所含成分基本一致，藥材整體質(zhì)量較穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜可用于西紅花藥材的質(zhì)量評價。

目前，三方共同創(chuàng)新研制了名為“智寶”的移動式病蟲害智能化感知設(shè)備，填補了國內(nèi)外移動式病蟲害智能測報技術(shù)與產(chǎn)品的空白。該設(shè)備集成了包括視覺、溫濕度傳感器、地理位置、移動終端等多種信息獲取手段，有效提升了現(xiàn)有病蟲害監(jiān)測能力。

圖1 30批西紅花藥材超高效液相色譜疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜Fig.1 UPLC overlay fingerprints of 30 batches of Croci Stigma and the reference fingerprint

圖2 超高效液相色譜圖1.Picrocrocin 4.Crocin I 6.Crocin Ⅱ 7.Crocin Ⅳ 10.Crocin ⅢA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.2 UPLC chromatograms

表2 30批西紅花藥材指紋圖譜相似度評價結(jié)果Tab.2 Results of the similarity evaluation of fingerprints of 30 batches of Croci Stigma

2.4 聚類分析

以30 批西紅花藥材的11 個共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，采用組間聯(lián)接，以平方歐氏距離法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，并繪制譜系圖，結(jié)果見圖3。當(dāng)歐氏距離為20 時，30 批西紅花藥材樣品可聚為兩大類，其中，編號為S1，S2，S3（產(chǎn)地伊朗）的樣品聚為一類，剩余批次聚為二類（國產(chǎn)）。當(dāng)歐氏距離為5 時，30 批西紅花藥材樣品可聚為4 類。其中，一類為編號為S1-S3（產(chǎn)地伊朗）的樣品；二類為編號為S4-S6（產(chǎn)地西藏），S8，S10，S12，S13（產(chǎn)地浙江），S22（產(chǎn)地江蘇）的樣品；三類為編號為S25-S30（產(chǎn)地安徽）的樣品；其余批次為四類（產(chǎn)地浙江、江蘇）。由聚類分析結(jié)果可知，產(chǎn)地為伊朗的西紅花與產(chǎn)地為我國的差異明顯，而我國不同產(chǎn)地之間也存在一定差異，但產(chǎn)地為浙江、西藏、江蘇的藥材質(zhì)量較相似，可用聚類分析法對藥材樣品進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分。

圖3 30批西紅花藥材的聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis diagram of 30 batches of Croci Stigma

2.5 OPLS-DA

將30 批西紅花藥材的11 個共有峰的峰面積作為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA 分析，獲得相應(yīng)模型，得分圖見圖4?？梢?，30批西紅花藥材樣品聚為4 類，編號為S1-S3 的樣品聚為一類（產(chǎn)地伊朗）、編號為S4-S6的樣品聚為二類（產(chǎn)地西藏）、編號為S25-S30的樣品聚為三類（產(chǎn)地安徽）編號為S7-S24的樣品聚為四類（產(chǎn)地浙江、江蘇），各組樣品聚類良好、分離明顯。模型的自變量模型參數(shù)R2X（cum）為0.809（＞0.5），因變量模型參數(shù)R2Y（cum）為0.800（＞0.5），表明模型穩(wěn)定性及預(yù)測力較好；累積預(yù)測能力參數(shù)Q2（cum）為0.751 ＞0.5），且R2Y（cum）-Q2（cum）= 0.049 ＜0.3。表明預(yù)測模型具有較好的準(zhǔn)確性和可靠性［11］。

圖4 30批西紅花藥材的OPLS-DA模型得分圖Fig.4 OPLS-DA scores diagram of 30 batches of Croci Stigma

為進(jìn)一步檢驗?zāi)Ｐ偷挠行曰驑颖鹃g是否存在差異，利用SIMCA 14.1 軟件對已建立的OPLS - DA 模型進(jìn)行置換檢驗，設(shè)置迭代次數(shù)為200 次，結(jié)果見圖5。可見，代表模型解釋能力R2為（0，0.064 5），模型預(yù)測能力Q2為（0，-0.38），均小于原始值，表明所建模型未過擬合［12］，可用于有效區(qū)分不同產(chǎn)地的西紅花藥材。

圖5 OPLS-DA模型置換檢驗圖Fig.5 OPLS-DA model permutation test diagram

變量重要性投影（VIP）值可衡量各共有峰的表達(dá)模式對樣本分類判別的影響強度和解釋能力［13］，且當(dāng)VIP ＞1.0 時，表示該變量對于所建模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平［14］。以此為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出5 種貢獻(xiàn)較大的成分，依次為峰8、峰9、峰11、峰10（西紅花苷-Ⅲ）、峰2。詳見圖6。

圖6 共有峰峰面積的VIP圖Fig.6 VIP plot of the common peak area

2.6 含量測定方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL，分別置10 mL棕色容量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件依次進(jìn)樣測定，以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表3，表明各成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表3 5種成分的線性關(guān)系考察與檢測限、定量限確定結(jié)果Tab.3 Results of the linear relation test，LOD and LOQ of five components

檢測限（LOD）與定量限（LOQ）確定：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，用稀乙醇逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以各儀器信噪比（S/N）為10∶1時的待測成分質(zhì)量濃度為LOQ，以S/N為3∶1 時的質(zhì)量濃度為LOD。結(jié)果見表3。

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ峰面積的RSD分別為0.17%，0.22%，0.30%，0.51%，0.43%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取西紅花藥材（編號為S16）細(xì)粉適量，精密稱定，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ的RSD分別為0.55%，0.18%，0.15%，0.73%，1.09%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取重復(fù)性試驗項下供試品溶液，分別于室溫放置0，2，4，8，10，12 h按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各成分峰面積，并計算含量。結(jié)果苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ含量的RSD分別為1.12%，1.59%，1.63%，1.71%，1.92%（n= 6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取西紅花藥材（編號為S16）細(xì)粉10 mg，精密稱定，置100 mL 棕色容量瓶中，共6 份，按2.2 項下方法制備質(zhì)量濃度分別為112.64，99.81，33.24，8.93，3.82 μg/ mL 的混合對照品溶液，精密量取混合對照品溶液8，10，12 mL，分別加入相應(yīng)供試品溶液中，按2.2 項下方法制備供試品加標(biāo)溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算加樣回收率。結(jié)果苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ的平均加樣回收率分別為100.47%，99.79%，99.87%，100.27%，99.73%，RSD分別為0.94%，0.89%，1.18%，1.23%，1.74%（n= 6），表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.7 QAMS 建立

相對校正因子（RCF，fs/i）計算：在中藥材多成分指標(biāo)質(zhì)量評價時，以該藥材中某一代表成分為內(nèi)參物，通過建立該內(nèi)參物與其他待測成分的fs/i計算其他待測組分的含量［15］，實現(xiàn)中藥材多成分同步測定。本研究中采用多點校正法，取線性關(guān)系考察項下系列混合對照品溶液，依次進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以西紅花苷- Ⅰ作為內(nèi)參物，按公式fs/i=（As×Mi）/（Ai×Ms）計算苦番紅花素、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ的fs/i及RSD。其中，As和Ai分別為內(nèi)參物和待測成分的峰面積，Ms和Mi分別為內(nèi)參物和待測成分對照品的質(zhì)量濃度。結(jié)果fs/i分別為3.577，0.844，1.251，1.781，RSD分別為0.88%，0.82%，1.39%，1.98%（n=6）。

耐用性試驗：分別考察不同色譜柱［（Waters Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm），月旭Ultimate UHPLC C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm），Agilent Poroshell 120 SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9μm）］，不同品牌色譜儀（Agilent 1260型、Waters Arc型、Shimadzu LC-30A 型），不同流速（0.25，0.30，0.35 mL/min），不同柱溫（25，30，35 ℃）對各成分fs/i的影響。結(jié)果fs/i的RSD均低于2.0%，表明不同色譜條件對苦番紅花素、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ的fs/i均無顯著影響。

待測成分色譜峰定位：分別考察了苦番紅花素、西紅花-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷-Ⅳ與西紅花苷-Ⅰ間的相對保留時間（Ri/s=ti/ts）和保留時間差（ti-ts）在不同色譜儀和色譜柱中的重復(fù)性。結(jié)果表明，相對保留時間的波動較小，其重復(fù)性明顯優(yōu)于保留時間差，故本研究中選擇相對保留時間作為待測成分色譜峰定位依據(jù)。

樣品含量測定：取30批（編號為S1-S30）樣品各適量，精密稱定，分別制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)法（ESM）測定苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷-Ⅳ的含量；同時采用QAMS 法以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，計算苦番紅花素、西紅花-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ和西紅花苷-Ⅳ的含量，并與ESM 法測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。可見，各成分QAMS法計算值和外標(biāo)實測值間無顯著差異，相對偏差（RD）低于2.0%。同時，采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對2種方法所測得含量進(jìn)行t檢驗，結(jié)果顯示，2種方法無顯著差異（P＞0.05）。以上述5種成分的總量計，浙江、伊朗產(chǎn)藥材含量較高，安徽產(chǎn)藥材含量最低。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

2020 年版《中國藥典（一部）》收載的西紅花藥材含量測定方法采用高效液相色譜（HPLC）法，梯度洗脫時間約為60 min，檢測時間較長。本研究中采用UPLC 法，將檢測時間縮短至25 min 內(nèi)，有效提高了檢測效率，還減少了有機溶劑的使用量。同時，采用梯度洗脫，在保留時間為15～25 min 處獲得多個分離良好的其他西紅花苷成分（西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷-Ⅳ等），但上述成分在常規(guī)HPLC 法檢測中難以獲得良好分離。通過二極管陣列檢測器于190～800 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，苦番紅花素于254 nm 波長處有最大吸收，而其他西紅花苷類成分于440 nm 波長處響應(yīng)較強，故采用波長切換法，以保證檢測靈敏度。優(yōu)化色譜條件后，各成分間分離良好，可滿足西紅花藥材指紋圖譜及QAMS法分析的要求。

3.2 指紋圖譜建立、聚類分析與OPLS-DA

本研究中建立了西紅花藥材的UPLC 指紋圖譜，共檢出11個共有峰。相似度評價結(jié)果顯示，30批西紅花藥材相似度為0.983～0.999，表明不同產(chǎn)地西紅花藥材的化學(xué)成分種類差異小。聚類分析和OPLS-DA結(jié)果均將30 批西紅花藥材分為4 類，聚類分析可實現(xiàn)伊朗、安徽和其他產(chǎn)地西紅花的有效區(qū)分，而OPLS-DA模型可實現(xiàn)伊朗、西藏、安徽產(chǎn)地西紅花的有效區(qū)分，但仍無法有效區(qū)分浙江和江蘇2個產(chǎn)地的西紅花藥材，兩者質(zhì)量高度相近。通過VIP 預(yù)測值排序篩選出5 個貢獻(xiàn)度較大的成分，分別為峰8、峰9、峰11、峰10（西紅花苷-Ⅲ）、峰2，可作為西紅花產(chǎn)地區(qū)分的標(biāo)志物。

3.3 QAMS 法測定結(jié)果分析

QAMS 法可有效解決對照品不易獲得、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、價格昂貴、溶液制備煩瑣等含量測定不利因素。本研究發(fā)現(xiàn)，西紅花藥材中西紅花苷-Ⅰ含量較高、化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定且價格低，故選用西紅花苷- Ⅰ作為內(nèi)參物。方法學(xué)驗證、方法耐用性考察，結(jié)果顯示，西紅花苷- Ⅰ對苦番紅花素、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ、西紅花苷-Ⅳ的fs/i有較好的重復(fù)性，同時QAMS法計算含量與ESM 法實測含量無顯著差異（RD＜2.0%），建立的QAMS法適用于西紅花中多指標(biāo)成分的含量測定。含量測定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地、不同批次西紅花苦番紅花素和西紅花苷類成分總含量差異較大。其中，產(chǎn)地為伊朗和浙江的西紅花各成分總含量較高，產(chǎn)地為安徽的西紅花藥材含量較低，且含量較低樣品普遍為生產(chǎn)日期均早、包裝材料密封性差的樣品。因此，西紅花內(nèi)在品質(zhì)除與其藥材產(chǎn)地相關(guān)外，還與儲存時間、儲存方式相關(guān)。

3.4 方法評價

本研究中建立的UPLC 指紋圖譜結(jié)合QAMS 法準(zhǔn)確、可靠、便捷，且檢測成本低，可用于西紅花藥材的質(zhì)量評價及產(chǎn)地區(qū)分。