唐超峰， 柳科軍， 陳本棟， 卜 陽

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肝膽外科，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科，銀川 750002）

肝癌是常見的原發(fā)性肝癌，占所有原發(fā)性肝癌的75%～85%，在全球癌癥相關(guān)死亡原因中位列第4[1-2]。肝癌的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移涉及多種癌基因、抑癌基因及生長因子，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控是腫瘤細胞代謝和增殖等生物學(xué)行為的關(guān)鍵[3-4]。RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有非常重要的作用，PUF 家族蛋白又稱Pumilio RNA 結(jié)合家族蛋白（主要包括PUM1、PUM2 和PUM3），是高度保守的RNA 結(jié)合域，主要參與基因負性調(diào)控和特異性識別堿基，參與干細胞分裂增殖、細胞周期、DNA 修復(fù)和細胞凋亡等過程，其功能障礙會導(dǎo)致神經(jīng)退行性變、癲癇、共濟失調(diào)、不育和惡性腫瘤[5]。既往研究[6-8]已證實，PUM1 在卵巢癌、非小細胞肺癌及淋巴細胞白血病等腫瘤中發(fā)揮致癌作用。目前關(guān)于PUM1、PUM2、PUM3 基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用并不清楚，因此，本研究基于多組學(xué)數(shù)據(jù)分析PUM1、PUM2、PUM3 基因在肝癌中的表達及其臨床意義，以期為PUF 家族基因的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

通過The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫下載肝癌患者臨床信息和RNA 測序數(shù)據(jù)，去除重復(fù)樣本后共納入371 例肝癌組織基因表達譜樣本和50 例癌旁組織基因表達譜樣本。所有的表達數(shù)據(jù)都通過對數(shù)轉(zhuǎn)換進行歸一化處理。根據(jù)Z-score 標準化的中值，將納入研究的患者分為高PUMs 表達組和低PUMs 表達組，分析PUM1、PUM2、PUM3 基因表達與患者臨床病理特征的相關(guān)性。人類蛋白質(zhì)圖譜（https：//www.proteinatlas.org/）可以使用各種組學(xué)技術(shù)（包括免疫組織化學(xué)法、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)）來定位細胞、組織和器官中的蛋白質(zhì)表達情況[9-11]。本研究從該數(shù)據(jù)庫下載免疫組織化學(xué)圖像來比較肝癌組織中PUMs 的蛋白質(zhì)表達水平，并深入評估其蛋白質(zhì)表達情況。String（https：//cn.string-db.org/）是已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的在線數(shù)據(jù)庫[12]，本研究聯(lián)合Cytoscape 軟件繪制PUMs 蛋白與前20 互作蛋白的網(wǎng)絡(luò)圖。cBioPortal for Cancer Genomics（https：//www.cbioportal.org/）是一個開放訪問的開源資源，用于交互式探索多個癌癥基因組數(shù)據(jù)集[13]。利用cBioPortal 基于TCGA Pan-Cancer Atlas 分析PUMs 基因在肝癌中的突變特征。

1.2 GO/KEGG 富集分析

通過String 數(shù)據(jù)庫得到的PUMs 相關(guān)基因（Spearman 相關(guān)系數(shù)≥0.9，P<0.05） 全部輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫[14]進行注釋、可視化和綜合分析，基因功能分析包括生物過程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）和細胞成分（cellular components，CC），相關(guān)通路主要是KEGG 途徑。當(dāng)FDR＜0.05，對主要富集結(jié)果進行可視化。

1.3 免疫浸潤分析

TumorImmuneEstimationResource（TIMER2.0）（http：//timer. cistrome.org/）基于TCGA 數(shù)據(jù)庫分析免疫細胞浸潤水平[15]。TIMER 2.0 用于分析肝癌中PUMs 表達與免疫細胞浸潤豐度的相關(guān)性。Spearman 用于分析PUMs 與免疫細胞浸潤豐度的相關(guān)性。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 軟件（Windows 版本8.0.0）進行可視化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有的表達數(shù)據(jù)均通過log2（data+1）進行標準化和對數(shù)轉(zhuǎn)換。采用R38.3 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Mann-Whitney U 檢驗分析肝癌組織和正常肝組織的表達差異，而配對樣本t 檢驗用于配對樣本分析。R 包［ggplot2（Version 3.3.3）］用于可視化。使用卡方檢驗或Fisher 精確概率法分析PUMs 表達水平與肝癌患者臨床病理特征的差異。采用Kaplan－Meier 法比較不同PUMs 表達水平患者的總存活率，組間差異比較采用秩和檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PUF 家族基因在正常肝組織、癌旁組織和肝癌組織中表達水平比較

與正常肝組織相比，PUM1、PUM2 及PUM3 mRNA 在肝癌組織中高表達（W=0.487，P=2.1×10-7；W=0.557，P=8.9×10－10；W=0.821，P=1.1×10－14）；與癌旁組織比較，PUM1、PUM2 及PUM3 mRNA在肝癌組織中高表達（t=5.802，P=4.7×10－7；t=6.076，P=1.8×10－7；t=8.294，P=6.8×10-11），見圖1。

圖1 PUF 家族基因在正常肝組織、癌旁組織和肝癌組織中表達差異

2.2 人類蛋白圖譜中PUF 家族基因的免疫組化圖像

基于HPA 數(shù)據(jù)庫免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，肝癌組織中PUM1、PUM2 及PUM3 陽性表達，陽性蛋白表達主要集中于細胞核或細胞質(zhì)，見圖2。

圖2 人類蛋白圖譜中PUF 家族基因在肝癌組織中表達情況（免疫組化×200）

2.3 PUF 家族基因轉(zhuǎn)錄水平與臨床病理的關(guān)系

肝癌組織中PUM1 表達水平在患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）及組織學(xué)分級中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）；肝癌組織中PUM2 表達水平在患者性別、年齡及病理分期中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）；肝癌組織中PUM3 表達水平在患者腫瘤T 分期及病理分期中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），見表1。

表1 PUF 家族基因表達水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

2.4 肝癌組織中PUF 家族基因轉(zhuǎn)錄水平的預(yù)后價值

PUM1、PUM2 及PUM3 高表達組的總生存率（OS）均低于低表達組［危險比（hazard ratio，HR）=1.49（1.06～2.11），P=0.021］、［HR=1.75（1.24～2.46），P=0.001］和［HR=1.47（1.04～2.08），P=0.027］，見圖3。

圖3 PUF 家族基因表達與OS 的關(guān)系

2.5 肝癌中PUMs 共表達基因的蛋白-蛋白相互作用、遺傳改變及功能富集

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示，PUMs 共表達基因的Top20 互作蛋白包括SH3D19、NANOS1、CNOT8、DHX58、NANOS3、NOP9、SEPHS1、RBBP6、TRIM71、CLINT1、FTH1、FTL、WDR46、SIRT7、DAZL、DAZ1、RBM45、REXO4、PARP1 及DNAJC6，見圖4A。基于R 語言對PUMs 共表達基因進行富集分析，結(jié)果顯示，BP 中主要富集于RNA 剪切、P53 類介質(zhì)對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正向調(diào)節(jié)作用、RNA 定位、RNA 轉(zhuǎn)運、mRNA 轉(zhuǎn)運、核轉(zhuǎn)運及甲基化等過程；CC 中主要富集于核斑點、剪接體組裝、核被膜、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體和細胞基質(zhì)連接等；MF 主要富集于RNA 催化活性、鈣粘蛋白（E-cadherin）結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活因子活性、P53 結(jié)合位點、細胞黏附分子、甲基轉(zhuǎn)移酶活性及Ras-GTP 酶活性等；KEGG 主要富集于剪接體、RNA 轉(zhuǎn)運、真核生物核糖體生物發(fā)生、mRNA 監(jiān)測、細胞周期、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、內(nèi)吞作用及肌肉萎縮側(cè)索硬化等信號通路，見圖4B。采用cBioPortal 探索肝癌中PUMs 的遺傳改變，結(jié)果顯示，348 例肝癌患者樣本中73 例（21%）患者PUMs 基因發(fā)生了改變，根據(jù)TCGA-Pan－Cancer Atlas 數(shù)據(jù)集，在肝癌中PUM1、PUM2、PUM3 基因改變分別為5%、10%和8%，見圖4C。

圖4 肝癌中PUMs 的共表達基因蛋白-蛋白相互作用及其遺傳改變、GO/KEGG 功能富集

2.6 PUMs 與腫瘤免疫細胞浸潤的相關(guān)性

基于ssGSEA 免疫浸潤算法評估PUMs 表達與24 種不同免疫細胞類型的關(guān)系，在肝癌中PUM1、PUM2、PUM3 表達與輔助性T 細胞、中樞記憶性T 細胞、輔助性T 細胞2 及嗜酸性粒細胞浸潤水平均呈正相關(guān)關(guān)系（P 均＜0.05），見圖5。

圖5 肝癌中PUF 家族基因表達與免疫細胞浸潤的相關(guān)性

3 討論

肝癌是目前全球最常見、致死率最高的癌癥之一，肝癌患者早期通常無非特異性臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者就診時已無根治性手術(shù)機會，且肝癌容易對化療產(chǎn)生耐藥性，在治療方面仍存在較大局限性[16-17]。因此，為了改善肝癌患者的預(yù)后，仍需進一步研究肝癌的分子調(diào)控機制、挖掘新的診斷和預(yù)后指標。既往研究[18]已證明，轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控的失調(diào)在癌癥中起著非常重要的作用，腫瘤細胞能夠劫持轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控機制，介導(dǎo)腫瘤細胞適應(yīng)局部微環(huán)境。RBPs 作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，參與RNA 剪接、多聚腺苷酸化、調(diào)節(jié)mRNA 穩(wěn)定性、亞細胞定位、蛋白質(zhì)翻譯和降解等過程[18]。而PUMs 表達失調(diào)介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病及惡性腫瘤的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果表明，PUM1、PUM2、PUM3 mRNA 在肝癌組織中均為高表達；PUM1、PUM2、PUM3 陽性蛋白表達主要集中于細胞核或細胞質(zhì)；且PUMs 基因與肝癌惡性進展均有相關(guān)性；在生存分析中發(fā)現(xiàn)，PUM1、PUM2、PUM3 高表達的肝癌患者預(yù)后差。對PUMs 共表達基因進行信號通路富集分析，其中在RNA 剪切、P53 類介質(zhì)對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正向調(diào)節(jié)作用、剪接體組裝、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、Ecadherin 結(jié)合、P53 結(jié)合位點及細胞周期中顯著富集，這提示PUMs 基因在肝癌中高表達，導(dǎo)致其靶點RNA 轉(zhuǎn)錄失調(diào)，而這些靶點RNA 編碼腫瘤細胞增殖、細胞凋亡和細胞周期過程中調(diào)控因子，進而介導(dǎo)腫瘤惡性進展過程。因此，在癌癥背景下對PUMs 蛋白進行研究，能夠在未來為腫瘤個體化綜合治療提供新的分子治療靶點。

PUM1 蛋白在哺乳動物中具有重要作用，參與細胞周期、DNA 修復(fù)和細胞更新等生理過程。PUM1 在許多不同類型的癌癥中促進細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，并抑制細胞凋亡[20]。Guan 等[6]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中的PUM1 水平顯著高于正常組織，下調(diào)PUM1 表達介導(dǎo)STAT3、BCL2、MMP2 和VEGFA的表達水平下調(diào)，PUM1 在體外誘導(dǎo)卵巢癌細胞生長、遷移和侵襲。在胰腺癌中，PUM1 mRNA 表達水平與胰腺癌的預(yù)后和腫瘤的發(fā)生相關(guān)，PUM1可作為胰腺癌的潛在診斷指標；此外，PUM1 的DNA 甲基化水平影響其在胰腺癌中的致癌作用，PUM1 能通過改變免疫細胞浸潤來抑制免疫微環(huán)境，從而影響胰腺癌的免疫治療反應(yīng)[20]。在前列腺癌中，PUM1 呈高表達水平，沉默PUM1 表達能夠抑制腫瘤細胞增殖和細胞周期阻滯，揭示了PUM1 的過表達通過抑制負細胞周期調(diào)節(jié)因子CDKN1B 的表達來促進腫瘤惡性進展的新機制[21]。同時，與正常結(jié)腸細胞系相比，PUM1 mRNA 在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細胞系中呈高表達水平，PUM1 高表達能夠促進腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，驗證了PUM1 在維持癌癥干細胞中的作用[22]。并且PUM1 在西妥昔單抗耐藥結(jié)腸癌細胞系中表達上調(diào)，PUM1 靶向正反饋調(diào)節(jié)DDX5 表達，并在西妥昔單抗耐藥機制中扮演重要角色[23]。體內(nèi)外實驗研究表明，下調(diào)PUM1 表達介導(dǎo)PERK/eIF2/ATF4 信號通路抑制胰腺癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和促進細胞凋亡，證實敲降PUM1 能夠提高胰腺癌細胞對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的敏感性，充分表明PUM1可能成為提高胰腺癌細胞對化療敏感性的新靶點[24]，與既往研究一致。本研究佐證了PUM1 參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，具體機制可能是PUM1 的高表達促進了肝癌細胞增殖且介導(dǎo)免疫細胞浸潤，從而促進了肝癌惡性進展并降低了患者的總體存活率。

PUM2 全長約80 kb，由20 個外顯子構(gòu)成，位于染色體2p24.1 上，其轉(zhuǎn)錄形成985 個氨基酸構(gòu)成的PUM2 蛋白，常見于大腦、心臟、肝臟、腎臟等組織的細胞質(zhì)中，能夠通過抑制細胞周期基因的表達來促進干細胞增殖[25-26]。Zhang 等[27]研究表明，PUM2 在乳腺癌組織中的表達明顯升高，與乳腺癌患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期呈負相關(guān)，體外實驗表明，PUM2 可以通過與miR-376a 競爭性結(jié)合NRP1-3’UTR 來促進乳腺癌細胞“干性”。在卵巢癌中，PUM2 的表達水平在順鉑耐藥卵巢癌細胞和患者組織中上調(diào)，靶向敲低PUM2 表達能夠逆轉(zhuǎn)小干擾RNA-USP46 誘導(dǎo)的順鉑耐藥性，提示PUM2 參與卵巢癌順鉑耐藥的過程[28]。同時，PUM2 在膠母細胞瘤癌組織及細胞系中表達升高，敲低PUM2 表達能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖和遷移[29]。PUM2 在結(jié)直腸癌中的高表達，靶向敲低PUM2 表達，顯著抑制結(jié)腸癌細胞增殖和細胞周期G1/S 阻滯，揭示了PUM2在腫瘤惡性進展中的作用及其作為治療靶點的潛力[30]。本研究表明，肝癌中PUM2 表達水平升高，且同患者不良預(yù)后密切相關(guān)。但是PUM2 在骨肉瘤組織中的表達降低，PUM2 通過與miRNA分競爭性結(jié)合STARD13 3’UTR 來抑制。骨肉瘤惡性進展[31]。由此可見，腫瘤中PUM2 的表達及作用具有一定的異質(zhì)性。因此，探索PUM2 在正常組織中轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制及其在不同類型癌癥中的失調(diào)至關(guān)重要，可能為未來的治療提供新的候選目標。

PUM3 結(jié)構(gòu)域呈L 形，其通過和磷酸骨架的相互作用與RNA/DNA 結(jié)合，PUM3 在原始生殖細胞核中定位，沉默PUM3 表達介導(dǎo)生殖細胞中P53 過度活化，揭示了PUM3 在生殖細胞發(fā)育過程中的重要作用[32]。然而，關(guān)于PUM3 在腫瘤進展中的作用知之甚少。PUM3 表達與宮頸癌患者的總生存期相關(guān)，敲低PUM3 表達能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[33]。Chodary 等[34]利用生物信息學(xué)分析表明，PUM3 基因能夠作為結(jié)直腸癌的預(yù)后/診斷生物標志物。采用免疫組織化學(xué)研究表明，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期乳腺癌標本中，PUM3 的表達水平明顯高于導(dǎo)管原位癌，PUM3 過表達能夠促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，其機制可能與調(diào)節(jié)其下游靶點mRNA 表達相關(guān)[35]。本研究表明，肝癌組織中PUM3 過表達，且其表達水平在患者腫瘤T 分期及病理分期中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，PUM3 高表達的肝癌患者預(yù)后不良，為PUM3 在腫瘤惡性進展中的重要作用提供了一定的理論依據(jù)。此外，在肝癌中，本研究分析了PUM1、PUM2、PUM3 表達與免疫細胞浸潤的關(guān)系，結(jié)果顯示PUM1、PUM2、PUM3 表達與輔助性T 細胞、中樞記憶性T 細胞、輔助性T 細胞2 及嗜酸性粒細胞浸潤水平呈正相關(guān)，但PUM1、PUM2、PUM3 與腫瘤浸潤免疫細胞的直接關(guān)系仍需組織樣本及細胞實驗進一步研究。

綜上所述，PUF 家族基因參與調(diào)控mRNA 在人體各種組織中的翻譯過程，其相關(guān)基因表達在癌癥中受到干擾，導(dǎo)致其靶點mRNA 表達失調(diào)，進而介導(dǎo)腫瘤相關(guān)惡性進展過程。本研究結(jié)果表明，PUM1、PUM2、PUM3 過表達是肝癌惡性進展過程中的關(guān)鍵分子特征，提示PUM1、PUM2、PUM3 可能是肝癌藥物治療的潛在靶點。