董立堯, 王 豪, 高海濤, 馮致科

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

小麥作為我國三大主糧之一,是重要的商品糧以及戰(zhàn)略儲備糧,小麥的產(chǎn)量直接關(guān)系到我國的糧食安全,據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì),2021年全國小麥種植面積高達(dá)2 356萬hm2,產(chǎn)量達(dá)1.37億t,約占我國糧食總產(chǎn)量的20%[1]。農(nóng)田雜草與作物爭奪光照、水分、營養(yǎng)等而抑制作物的生長,制約糧食的高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)。雜草是造成小麥產(chǎn)量損失的主要生物因素,我國每年因雜草危害造成的小麥減產(chǎn)達(dá)15%[2]。我國小麥生產(chǎn)主要分布在黃淮海和長江流域的河南、山東、河北、江蘇、安徽和湖北等省[1],因氣候環(huán)境及耕作方式的不同,小麥田優(yōu)勢雜草在各個地區(qū)不盡相同。近年來對小麥田雜草發(fā)生情況的調(diào)查顯示,我國黃淮海和長江流域的小麥田優(yōu)勢禾本科雜草為日本看麥娘AlopecurusjaponicusSteud.、菵草Beckmanniasyzigachne(Steud.) Fern.、看麥娘AlopecurusaequalisSobol.、多花黑麥草LoliummultiflorumLam.、棒頭草PolypogonfugaxNeesexSteud.、耿氏假硬草Pseudosclerochloakengiana(Ohwi) Tzvel.、野燕麥AvenafatuaL.、雀麥BromusjaponicusThunb.exMurr.、節(jié)節(jié)麥AegilopstauschiiCoss.、早熟禾PoaannuaL.等,優(yōu)勢闊葉類雜草為播娘蒿Descurainiasophia(L.) WebbexPrantl、薺菜Capsellabursa-pastoris(L.) Medic.、豬殃殃GaliumaparineL.、澤漆EuphorbiahelioscopiaL.、鵝腸菜Stellariaaquatica(L.) Scop.、繁縷Stellariamedia(L.) Villars等[2-6]。禾本科雜草的發(fā)生逐年加重,而且田間抗性雜草種類與種群不斷增加,給雜草防除帶來了新的挑戰(zhàn)。

我國小麥田雜草防除主要依靠化學(xué)藥劑,目前雖然登記證有1 410個(根據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng)統(tǒng)計(jì)),但實(shí)際上有效成分種類不是很多,同質(zhì)化程度高。過去多年來常用的播后苗前土壤處理劑產(chǎn)品主要有異丙隆、綠麥隆、吡氟酰草胺等,防除禾本科雜草的苗后莖葉處理劑則主要是乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑和乙酰乳酸合酶(ALS)抑制劑類產(chǎn)品。ACCase抑制劑類除草劑的作用機(jī)制是抑制乙酰輔酶A羧化酶的活性,干擾脂肪酸的生物合成,最終導(dǎo)致植物死亡,我國小麥田廣泛應(yīng)用的品種主要有精噁唑禾草靈、炔草酯、唑啉草酯及其復(fù)配劑。ALS抑制劑是通過抑制植物支鏈氨基酸的合成導(dǎo)致植物生長受阻、死亡,用于小麥田的品種主要有甲基二磺隆、啶磺草胺、氟唑磺隆等及其復(fù)配劑。在生產(chǎn)中使用廣泛的其他除草劑如苯磺隆、氯氟吡氧乙酸、2甲4氯、乙羧氟草醚等是用于防除小麥田闊葉雜草的[7]。綜合來看,小麥田常用的土壤處理劑主要是異丙隆,防除闊葉雜草的莖葉處理劑主要是苯磺隆和雙氟磺草胺等,而防除禾本科雜草的莖葉處理劑在過去很長時間內(nèi)則以精噁唑禾草靈等為主[8]。隨著苯磺隆和精噁唑禾草靈的長期使用,小麥田雜草抗性問題日益嚴(yán)重,一批高活性的新型除草劑的使用量在2010年前后迅速增加,如炔草酯、雙氟磺草胺、唑啉草酯及其復(fù)配制劑成為中國除草劑市場主流。

精噁唑禾草靈自20世紀(jì)80年代后期開始在我國長江流域的小麥田使用,并成為防除小麥田禾本科雜草的主導(dǎo)藥劑。由于這一藥劑的長期單一使用,導(dǎo)致近年來禾本科雜草對它的抗性問題日益突出[9]。從我國多地小麥田采集的菵草[10]、日本看麥娘[11]、看麥娘[12]、多花黑麥草[13]、耿氏假硬草[14]、棒頭草[15]和野燕麥[16]等種群已經(jīng)對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了明顯的抗性。為了明確我國小麥田禾本科雜草對精噁唑禾草靈的抗藥性整體情況,本文梳理了對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性的主要雜草種類及相應(yīng)抗性水平,歸納了其對精噁唑禾草靈的靶標(biāo)抗性機(jī)理及代謝抗性機(jī)理,分析了抗精噁唑禾草靈雜草對不同除草劑的交互抗性及多抗性情況,提出了我國小麥田抗性雜草治理的初步方案。

1 我國小麥田主要禾本科雜草對精噁唑禾草靈的抗性現(xiàn)狀

截至目前,我國小麥田發(fā)現(xiàn)抗精噁唑禾草靈的禾本科雜草至少有以下6種。

1.1 菵草

20世紀(jì)80年代末涂鶴齡報道了菵草在長江流域的稻茬麥田的發(fā)生量呈上升趨勢[17]。從90年代起,菵草在小麥田迅速蔓延,成為小麥田主要雜草之一,形成了草害[18]。2007年張鎖榮報道,蘇南地區(qū)連續(xù)使用精噁唑禾草靈的稻麥連作田的菵草對精噁唑禾草靈均產(chǎn)生了一定的抗性,使用3年和5年的抗性指數(shù)(RI)分別為5.27和8.01,使用9年的RI為21.59[19]。呂波等發(fā)現(xiàn)2009年采集于江蘇、安徽、上海小麥田的17個菵草種群中14個種群對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了抗性,抑制雜草生長的有效中劑量(GR50)為0.133～19.198 g/hm2,句容種群抗性水平最高,RI為144.24[20]。李凌緒發(fā)現(xiàn)2010年-2012年采集于安徽、江蘇、山東、湖北的59個小麥田菵草種群中15個表現(xiàn)出抗藥性,廬江種群抗性水平最高,GR50達(dá)3 870 g/hm2[21]。潘浪發(fā)現(xiàn)2012年-2013年采集于江蘇、安徽及上海的70個菵草種群中有27個對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了抗性,抗性水平最高種群的GR50也達(dá)到2 560 g/hm2[10]?？梢?長江中下游江蘇、安徽及上海等地麥田的部分菵草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了明顯的抗藥性。

1.2 日本看麥娘

日本看麥娘在我國分布較廣,幾乎遍布全國,由于其較強(qiáng)的適應(yīng)能力和喜濕特性,在長江流域的稻茬麥田和油菜田以及黃淮海流域等麥田中成為優(yōu)勢雜草。2007年楊彩宏等報道了句容油菜田的日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生了抗性[22]。2009年郭峰在河南、湖北、江蘇、山東和陜西等地麥田采集了11個種群,發(fā)現(xiàn)江蘇練湖農(nóng)場的種群對精噁唑禾草靈抗性水平最高,GR50達(dá)212.61 g/hm2[23]。畢亞玲發(fā)現(xiàn)2009年-2011年采自安徽、江蘇、山東、河南和湖北5省的小麥田48個種群中24個對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了抗性,安徽天長種群的抗性水平最高,GR50為1 182.30 g/hm2[8]。徐洪樂發(fā)現(xiàn)2010年-2012年采自江蘇、安徽兩地22個種群中安徽肥東種群抗性水平最高,GR50為1 556.08 g/hm2[24]。2019年-2020年許錦程等發(fā)現(xiàn)江淮地區(qū)的數(shù)十個種群均產(chǎn)生了抗性,GR50在223.89～ 429.78 g/hm2[25]。上述進(jìn)展表明,我國長江流域小麥田的日本看麥娘對精噁唑禾草靈抗性十分嚴(yán)重。

1.3 看麥娘

看麥娘與日本看麥娘同屬禾本科看麥娘屬,也是我國農(nóng)田主要雜草之一。2004年黃世霞最早報道江蘇油菜田看麥娘對高效氟吡甲禾靈、精喹禾靈等產(chǎn)生了抗性[26]。郭文磊報道2013年-2015年采自安徽、江蘇、山東和河南四省的77個看麥娘種群中有37個對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性,高抗種群主要集中分布在安徽壽縣、天長和江蘇盱眙、姜堰,天長種群抗性最高,GR50為1 286.3 g/hm2[12]。盧紅等發(fā)現(xiàn)2013年采自江蘇、上海地區(qū)的23個看麥娘種群中有12個對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性,江蘇高郵種群的抗性水平最高,GR50為1 835.21 g /hm2[27]。陳秀濤測定了15個看麥娘種群,有10個產(chǎn)生抗性,RI在11.14～234.51之間[28]?？贷溎锏目剐苑植紖^(qū)域與日本看麥娘抗性種群的分布比較重合,有些田塊抗性日本看麥娘、菵草、看麥娘等多種雜草混生,這可能與這些地區(qū)用藥情況相似有關(guān)。

1.4 多花黑麥草

多花黑麥草又名意大利黑麥草,屬于禾本科黑麥草屬。多花黑麥草原產(chǎn)地中海區(qū)域,是我國引進(jìn)的一個主要冬季牧草品種。近年來,在中國河南、江蘇及湖北地區(qū)逐漸蔓延到小麥田,成為小麥田的一種惡性、抗性雜草。張佩發(fā)現(xiàn)2014年-2016年采自河南、江蘇、山東等地的50個多花黑麥草種群中有42個對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了不同程度的抗性,其中河南駐馬店種群的抗性水平最高,GR50為2 218.41 g/hm2[13]。徐洪樂等也發(fā)現(xiàn)2016年-2017年采自河南新鄉(xiāng)和駐馬店小麥田的多花黑麥草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生高水平的抗性, GR50最高為1 592.24 g/hm2[29]。Zhu等還發(fā)現(xiàn)抗啶磺草胺的多花黑麥草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了高水平的多抗性,GR50高達(dá)2 030.86 g/hm2[30]。Li等發(fā)現(xiàn)安徽地區(qū)的多花黑麥草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性,GR50在84.88～689.21 g/hm2[31]。

1.5 耿氏假硬草

耿氏假硬草,是亞熱帶和溫帶地區(qū)一種廣泛分布的常見雜草,喜濕耐旱,抗鹽耐瘠和耐陰,能在許多環(huán)境條件下生存,常見于潮濕的山地和低洼濕潤地帶。在國內(nèi)其主要分布于上海、江蘇、安徽、河南、山東等地區(qū),主要存在于稻茬麥田,對小麥的危害非常嚴(yán)重。袁國徽報道2011年-2013年采自山東、河南、江蘇等地62個耿氏假硬草種群中25個對精噁唑禾草靈產(chǎn)生高水平抗性(RI在14.7～103.2之間),GR50為438.1～3 033.1 g/hm2[14]。而高海濤檢測了2014年-2015年隨機(jī)采集于安徽、山東、江蘇、河南、上海等地的30個耿氏假硬草種群,發(fā)現(xiàn)只有江蘇江都種群達(dá)到高抗水平,GR50為159.03 g/hm2,抗性指數(shù)RI為15.68,其余29個種群對精噁唑禾草靈依舊敏感,抗性指數(shù)RI在1.00～2.40之間,GR50在10.14～24.32 g/hm2之間,也遠(yuǎn)小于田間推薦劑量(62 g/hm2)[32]。說明小麥田耿氏假硬草對精噁唑禾草靈抗性水平差別較大,袁國徽等調(diào)查的地塊可能具有更長的精噁唑禾草靈用藥歷史[33]。

1.6 棒頭草

棒頭草屬禾本科棒頭草屬,在我國,除東北地區(qū)外的其余地區(qū)均有發(fā)生,尤其在長江流域及其以南各地發(fā)生較嚴(yán)重。在部分地區(qū)已成為優(yōu)勢雜草。我國小麥田棒頭草對精噁唑禾草靈的抗性尚缺乏系統(tǒng)研究,目前只有Zhao等報道了安徽懷遠(yuǎn)縣的種群對精噁唑禾草靈產(chǎn)生較高水平的抗藥性[34]。

2 雜草對ACCase抑制劑的抗藥性機(jī)理

雜草對除草劑的抗藥性機(jī)理復(fù)雜多樣,但一般來說可以分為靶標(biāo)抗性和非靶標(biāo)抗性。靶標(biāo)抗性包括靶標(biāo)酶基因的突變以及靶標(biāo)酶基因的過量表達(dá)。非靶標(biāo)抗性即除草劑作用靶標(biāo)酶以外的其他方式,非靶標(biāo)抗性包括雜草解毒代謝能力增強(qiáng)、除草劑吸收減少、傳導(dǎo)變慢、雜草抗氧化脅迫能力增強(qiáng)等(圖1)[35]。

2.1 雜草抗ACCase抑制劑的靶標(biāo)機(jī)理

精噁唑禾草靈是乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑類除草劑,用于防除禾本科雜草。由于其長期單一使用,目前禾本科雜草對精噁唑禾草靈的抗性問題比較嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A羧化酶基因突變、表達(dá)量上調(diào)是其產(chǎn)生抗性的靶標(biāo)酶機(jī)理。

2.1.1ACCase基因突變導(dǎo)致雜草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性

ACCase是一類生物羧化酶,結(jié)構(gòu)上有3個功能區(qū)域,分別是生物素羧化酶(BC)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、羧基轉(zhuǎn)移酶(CT)。該酶參與脂肪酸生物合成的第一步,即依賴三磷酸腺苷(ATP)催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A(malonyl-CoA),該反應(yīng)也是植物脂肪酸生物合成的首要關(guān)鍵步驟。在當(dāng)前大多數(shù)研究中ACCase基因發(fā)生特定突變會導(dǎo)致ACCase活性發(fā)生變化繼而導(dǎo)致雜草對ACCase類抑制劑產(chǎn)生抗藥性。ACCase氨基酸的變化被認(rèn)為是雜草對ACCase抑制劑產(chǎn)生抗藥性的重要機(jī)制。目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7個位點(diǎn)的14種氨基酸取代與抗性相關(guān)(圖2),分別是Ile-1781-Val,Ile-1781-Leu,Ile-1781-Thr,Ile-1781-Glu,Trp-1999-Cys,Trp-1999-Leu,Trp-1999-Ser,Trp-2027-Cys,Ile-2041-Asn,Ile-2041-Val,Asp-2078-Gly,Cys-2088-Arg,Gly-2096-Ala和Gly-2096-Ser[36-41]。

圖2 ACCase 羧基轉(zhuǎn)移酶(CT)區(qū)的抗性突變位點(diǎn)[39]Fig.2 Herbicide-resistant mutation sites in carboxyl transferase domain of ACCase

Xu等對我國日本看麥娘抗精噁唑禾草靈的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),ACCase氨基酸發(fā)生了Trp-2027-Cys,Asp-2078-Gly,Ile-1781-Leu,Ile-2041-Asn,Trp-1999-Cys,Trp-1999-Leu的5個位點(diǎn)6種突變[42-43]。通過對抗性及敏感日本看麥娘ACCase的提取及測定,發(fā)現(xiàn)在精噁唑禾草靈不同濃度下,抗性和敏感日本看麥娘ACCase活性變化不同,敏感日本看麥娘ACCase活性快速顯著下降,而抗性日本看麥娘的ACCase活性下降幅度小、速度慢,其活性被精噁唑禾草靈抑制程度顯著低于敏感型。Pan等篩選出的27個抗精噁唑禾草靈菵草種群中均存在靶標(biāo)位點(diǎn)ACCase的突變, 共有5種突變類型,分別為I1781L,W2027C,I2041N,D2078G,G2096A[36- 37, 44]。這些位點(diǎn)突變是導(dǎo)致菵草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性的主要原因。同樣的,在對這些不同突變的抗性種群ACCase進(jìn)行酶活測定時,發(fā)現(xiàn)抗性種群ACCase對精噁唑禾草靈的敏感性均低于敏感種群。Xia等[45]、Guo等[46]和Wang等[47]在抗精噁唑禾草靈看麥娘種群中發(fā)現(xiàn)4處突變,分別為I1781L, I2041N, I2041T和D2078G。Zhang等對我國抗精噁唑禾草靈多花黑麥草的基因序列分析,發(fā)現(xiàn)氨基酸Ile-1781-Leu、Asp-2078-Gly、Ile-2041-Asn、Cys-2088-Arg的突變是導(dǎo)致多花黑麥草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性的原因[48]。高海濤[32]、袁國徽[33]在抗精噁唑禾草靈耿氏假硬草中發(fā)現(xiàn)了Trp-1999-Cys和Trp-1999-Ser氨基酸突變。Zhao等[34]在抗精噁唑禾草靈棒頭草種群中發(fā)現(xiàn)了Trp-1999-Ser突變。由此可見,ACCase基因突變是麥田禾本科雜草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性的重要機(jī)理之一。

通常來說,靶標(biāo)酶ACCase基因特定位置的突變均會引起ACCase蛋白結(jié)構(gòu)的改變從而導(dǎo)致對精噁唑禾草靈敏感性下降。但是也有研究發(fā)現(xiàn),ACCase在未發(fā)生基因突變的情況下,ACCase活性改變亦會導(dǎo)致雜草抗藥性的發(fā)生。如張佩[13]發(fā)現(xiàn)采自江蘇省的多花黑麥草種群JLJY-6對精噁唑禾草靈的抗性指數(shù)高達(dá)27.96。但對其ACCase基因序列進(jìn)行研究時未發(fā)現(xiàn)任何已知導(dǎo)致抗性的突變位點(diǎn),且對抗性靶標(biāo)基因表達(dá)量的研究中,抗性和敏感種群的表達(dá)量也沒有顯著性的差異。并且江蘇省抗性種群對除了精噁唑禾草靈外的其他ACCase類抑制劑如精喹禾靈、高效氟吡甲禾靈、炔草酯、烯草酮、烯禾啶和唑啉草酯等藥劑敏感;對ALS類、光合抑制劑類等除草劑都沒有產(chǎn)生抗性。但是在對其抗性種群的ACCase活性研究發(fā)現(xiàn),抗性種群的IC50是敏感種群的9.85倍。這說明江蘇省多花黑麥草抗性種群JLGY-6對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗藥性的主要原因是靶標(biāo)酶活性的降低引起的。由此可見,在ACCase未發(fā)生基因突變的情況下,ACCase酶活性的改變也會導(dǎo)致對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性。

2.1.2ACCase的過量表達(dá)導(dǎo)致雜草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性

2001年有學(xué)者首次提出ACCase的過量表達(dá)與此類除草劑抗性相關(guān)。Bradley等在研究石茅Sorghumhalepense(L.) Pers.對芳氧苯氧基丙酸酯類(APPs)和環(huán)己烯酮類(CHDs)除草劑的抗性機(jī)理時發(fā)現(xiàn)抗性和敏感種群之間ACCase的相對活性沒有差異,但是抗性種群的絕對活性高于敏感種群[49]。他們認(rèn)為導(dǎo)致這種情況發(fā)生的原因是抗性石茅的ACCase過量表達(dá)。徐洪樂利用篩選的內(nèi)參基因檢測了抗性和敏感日本看麥娘在精噁唑禾草靈處理前后,根、莖和葉中ACCase基因表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)在藥劑處理后2 h的葉中,藥劑處理后3、5 d和7 d的莖中,抗性日本看麥娘ACCase基因的表達(dá)量顯著高于敏感日本看麥娘[24]。潘浪通過分析敏感和抗性菵草ACCase基因表達(dá)量的變化,發(fā)現(xiàn)在精噁唑禾草靈處理前和處理后,5個抗性菵草種群中ACCase基因的表達(dá)量均高于敏感種群[10]。張佩發(fā)現(xiàn)多花黑麥草敏感和抗性種群ACCase表達(dá)量變化趨勢都是先經(jīng)過一個緩慢的上升過程到藥后24 h達(dá)到最大值,然后下降,5～7 d之后已不再變化?？剐酝蛔兎N群的ACCase基因表達(dá)量在藥后24 h上升到最大值,是敏感種群的2倍,之后又緩慢下降,但是仍然比敏感種群表達(dá)量高2～3倍[13]。

2.2 雜草抗ACCase抑制劑的非靶標(biāo)機(jī)理

非靶標(biāo)抗性機(jī)理(non-target site resistance,NTSR)越來越受到重視,逐漸被認(rèn)為也是導(dǎo)致雜草對ACCase抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。非靶標(biāo)抗性機(jī)理非常復(fù)雜,抗精噁唑禾草靈的非靶標(biāo)機(jī)理研究很少,而且集中在雜草解毒代謝能力方面,20世紀(jì)90年代,也有發(fā)現(xiàn)個別雜草可以通過膜的去極化對ACCase抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性[50]。

2.2.1相關(guān)代謝酶解毒代謝能力增強(qiáng)導(dǎo)致雜草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性

2.2.1.1代謝酶解毒代謝的一般過程

目前的研究認(rèn)為,代謝抗性是非靶標(biāo)抗性中最重要的部分。除草劑在植物體內(nèi)的代謝是一個復(fù)雜的過程,涉及不同種酶之間的協(xié)作(表1)。這一過程大致可以分為3個階段(圖3):1)除草劑分子被轉(zhuǎn)化成一個更加親水的代謝物,這一階段涉及細(xì)胞色素P450氧化酶系、酯酶、水解酶、氧化酶和過氧化物酶;2)與植物體內(nèi)受體分子結(jié)合,涉及的酶主要有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和糖基轉(zhuǎn)移酶;3)進(jìn)一步軛合和氧化,代謝物被排到液泡或者細(xì)胞壁進(jìn)行進(jìn)一步降解,主要涉及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[51-52]。

表1 植物對除草劑代謝過程中涉及的相關(guān)酶1)Table 1 Enzymes involved in the metabolism of herbicides in plants

圖3 精噁唑禾草靈在雜草體內(nèi)代謝涉及的相關(guān)酶[51]Fig.3 A variety of metabolizing enzymes involved in metabolism of fenoxaprop-P-ethyl in weeds

2.2.1.2細(xì)胞色素P450氧化酶系與雜草抗精噁唑禾草靈

1985年和1986年分別首次報道對靶標(biāo)位點(diǎn)不同的除草劑產(chǎn)生交互抗性的大穗看麥娘AlopecurusmyosuroidesHuds.和硬直黑麥草LoliumrigidumGaud.的抗性是由于細(xì)胞色素P450氧化酶系活性增強(qiáng)而對除草劑的代謝增強(qiáng)所致[53-54]。目前已有個別細(xì)胞色素P450氧化酶系介導(dǎo)的抗性雜草生物型被報道。Wang等發(fā)現(xiàn)早熟禾P.annuaL.對精噁唑禾草靈具有天然耐藥性。在施用精噁唑禾草靈后細(xì)胞色素P450和b5的含量顯著高于施用吡唑解草酯和未做處理的對照植株。用模式底物方法間接測量細(xì)胞色素P450酶活性,發(fā)現(xiàn)其在施用精噁唑禾草靈后活性升高。因此認(rèn)為,細(xì)胞色素P450氧化酶系可能在早熟禾對精噁唑禾草靈耐藥性方面起重要作用[55]。但是在其他ACCase和ALS類抑制劑的抗性研究中發(fā)現(xiàn)了幾個重要的CYP代謝酶基因并驗(yàn)證了其功能。Zhao等在研究看麥娘對甲基二磺隆的抗性時,利用轉(zhuǎn)基因擬南芥Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.驗(yàn)證了CYP709C56過量表達(dá)會導(dǎo)致看麥娘對甲基二磺隆產(chǎn)生抗性[56],Pan等在抗五氟磺草胺光頭稗Echinochloacolona(Linnaeus) Link研究中利用轉(zhuǎn)基因水稻證明了CYP81A68過量表達(dá)會導(dǎo)致其抗性[57]。Bai等在抗ALS抑制劑菵草中發(fā)現(xiàn)了CYP99A44 和CYP704A177兩個CYP基因在代謝抗性中起到重要作用[58]。

2.2.1.3谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與雜草抗精噁唑禾草靈

GST可催化生物體內(nèi)源或外源化合物與谷胱甘肽(glutathione,GSH)的巰基軛合,改變親脂分子的親電子中心而形成低活性的最終產(chǎn)物。另外,GST還具有依賴于GSH的過氧化、異構(gòu)化(isomerization)功能及一些其他非催化活性功能,如非底物配體、脅迫引導(dǎo)的信號處理、細(xì)胞凋亡預(yù)防等[59]。Cummins等研究發(fā)現(xiàn)GST對精噁唑禾草靈代謝活性及GSH過氧化酶(glutathione peroxidase,GPOX)活性的加強(qiáng)導(dǎo)致大穗看麥娘A.myosuroides對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性[60]。

在GST介導(dǎo)的代謝除草劑安全劑應(yīng)用中的數(shù)據(jù)顯示,GST基因可被誘導(dǎo)性表達(dá)。此外在雜草研究中發(fā)現(xiàn),作物中GST基因在代謝除草劑中發(fā)揮了一定作用。Pan等研究發(fā)現(xiàn)菵草GST基因GST-T3、GST-U1和GST-U6在精噁唑禾草靈處理后呈現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)[52]。基因的表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)雜草對除草劑的代謝能力。

2.2.1.4ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與雜草抗精噁唑禾草靈

很多研究證明除草劑在植物液泡中代謝,未見將ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與雜草抗精噁唑禾草靈相聯(lián)系的研究報道。但是,在作物和模式植物中已經(jīng)確認(rèn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與代謝除草劑。有研究顯示,擬南芥和其他物種中的一些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠轉(zhuǎn)運(yùn)不同除草劑和除草劑代謝產(chǎn)物。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同樣在安全劑誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá),因此可以協(xié)調(diào)過多的谷胱甘肽軛合物。一個參與GS-軛合物轉(zhuǎn)運(yùn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtOPT6在氟嘧磺隆處理后也可出現(xiàn)上調(diào)[61]。近期的研究發(fā)現(xiàn),對草甘膦(glyphosate)處理的光頭稗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,通過RNA-Seq和RT-qPCR雙重驗(yàn)證篩選出了2個重要ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABCC8和ABCC10,通過轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因可以通過將雜草體內(nèi)草甘膦轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡減少藥劑到達(dá)靶標(biāo)的量從而導(dǎo)致抗藥性[62]。

印刷行業(yè)現(xiàn)在最缺的可能就是，數(shù)字化的人才，這類人才，不單要熟練操作數(shù)字化設(shè)備，還應(yīng)嫻熟運(yùn)用各類數(shù)字化軟件，李新立坦陳自己的憂慮。誠如他所說，傳統(tǒng)印刷在國內(nèi)經(jīng)過這二十多年的大發(fā)展，已經(jīng)儲備了大量的人才，但在數(shù)字化的時代，一切應(yīng)用都跟數(shù)據(jù)有關(guān)，行業(yè)及企業(yè)要想贏得未來，精通數(shù)字語言的人才就是關(guān)鍵。而如何破局，還需群策群力。

2.2.2雜草對除草劑吸收減少或傳導(dǎo)變慢

已有的研究表明,對除草劑及其有毒代謝物的屏蔽作用和隔離作用被認(rèn)為是雜草對除草劑抗性的一個重要機(jī)理。如飛蓬屬ErigeronL.的抗藥性生物型中,發(fā)現(xiàn)百草枯的移動受到了限制,并且葉綠體的功能如CO2固定和葉綠素?zé)晒忖缈梢匝杆倩謴?fù)。這說明除草劑在其作用位點(diǎn)的結(jié)合可能被阻止[63]。但是目前未見雜草對精噁唑禾草靈吸收和傳導(dǎo)的差異導(dǎo)致抗藥性的報道。

2.2.3雜草抗氧化脅迫能力增強(qiáng)

有研究認(rèn)為小RNA等調(diào)控因子參與的調(diào)控機(jī)制在雜草體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用,也極有可能參與雜草對除草劑的非靶標(biāo)抗性并導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生。

目前對植物中的漆酶(laccase)研究甚少,漆酶的許多生物學(xué)功能未知。已知植物中漆酶是小RNA397(miR397)的靶基因。Pan等[52]在抗精噁唑禾草靈菵草種群中發(fā)現(xiàn)4個氧化酶和過氧化物酶基因表達(dá)上調(diào)。而ptr-mir397a可調(diào)節(jié)其靶基因漆酶基因,隨后漆酶基因再調(diào)控其下游的轉(zhuǎn)錄因子及氧化酶/過氧化物酶基因的表達(dá),從而形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)木質(zhì)素生物合成。鑒于氧化酶/過氧化物酶在雜草對除草劑的抗性中可以發(fā)揮重要的作用,推測抗性菵草中也形成了這樣一個miR397調(diào)控的網(wǎng)絡(luò),并最終導(dǎo)致其對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗藥性。

3 抗精噁唑禾草靈雜草的治理策略

3.1 加強(qiáng)抗精噁唑禾草靈雜草的檢測

抗性雜草的治理首先要發(fā)現(xiàn)抗性雜草、評價雜草的抗藥性水平。通常使用整株生物測定法確定某雜草是否對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性及其抗性水平。通過劑量反應(yīng)曲線計(jì)算出除草劑抑制雜草生長50%的劑量(ED50或GR50)。ED50(effective dose of 50% inhibition in plant growth)即抑制植物生長的有效中劑量。GR50(herbicide dose required 50% growth reduction)即鮮重抑制中量。求出疑似抗性雜草與敏感雜草的ED50或GR50比值,即是某雜草種群對敏感雜草生物型的抗性指數(shù)(resistance index,RI)。2005年南京農(nóng)業(yè)大學(xué)除草劑毒理及抗藥性實(shí)驗(yàn)室根據(jù)雜草抗藥性的實(shí)際,制定了雜草抗藥性研究的分級標(biāo)準(zhǔn):敏感RI≤2;敏感水平下降2150。

隨著雜草抗藥性研究的不斷深入,雜草抗藥性檢測方法也不斷創(chuàng)新,目前廣泛應(yīng)用的生物測定方法包括整株生物測定法、種子生物測定法和培養(yǎng)皿快速檢測法,還有快速分子生物學(xué)測定方法,如靶標(biāo)酶編碼基因測序法、衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性(derived cleaved amplified polymorphic sequence,dCAPS)法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增PCR(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法等。目前在我國小麥田雜草對精噁唑禾草靈抗性研究中最常用的方法為整株生物測定法、靶標(biāo)酶編碼基因ACCase測序法、dCAPS, LAMP等。其中整株生物測定法、靶標(biāo)酶基因ACCase測序是研究抗精噁唑禾草靈雜草必需步驟,而dCAPS和LAMP方法是快速準(zhǔn)確診斷抗藥性突變型雜草的方法。李凌緒[21]、潘浪[10]對抗精噁唑禾草靈的菵草,徐洪樂[24]對抗精噁唑禾草靈的日本看麥娘,郭文磊[12]對抗精噁唑禾草靈的看麥娘,袁國徽[14]對抗精噁唑禾草靈的耿氏假硬草,張佩[13]對抗精噁唑禾草靈的多花黑麥草,分別建立了dCAPS分子檢測技術(shù)。潘浪針對菵草對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性的I1781L,I2041A,G2096A突變建立了LAMP檢測技術(shù)[10]。

雜草抗藥性的檢測方法各有利弊,研究中要根據(jù)除草劑的作用機(jī)理,雜草的基本屬性,研究目的等綜合分析決策選用合適的抗性檢測方法。

3.2 避免使用與精噁唑禾草靈有交互抗性的除草劑

交互抗性指抗性雜草生物型對化學(xué)結(jié)構(gòu)相似或作用機(jī)理相同的其他除草劑產(chǎn)生的抗性,這在抗性雜草中普遍存在。抗精噁唑禾草靈雜草生物型產(chǎn)生后,ACCase類的除草劑則對該類抗性雜草防效較低,甚至完全無效,嚴(yán)重威脅糧食的豐產(chǎn)豐收,給雜草科學(xué)和除草劑科學(xué)研究提出了新的挑戰(zhàn)。目前,國內(nèi)抗精噁唑禾草靈雜草對ACCase類除草劑均產(chǎn)生了不同程度的交互抗性,特別是APP類的炔草酯、精喹禾靈及精吡氟禾草靈的交互抗性較為嚴(yán)重(表2),在防除抗精噁唑禾草靈的抗性雜草中要避免使用此類藥劑加重雜草抗藥性。為便于大家回避交互抗性的除草劑,我們歸納了ACCase氨基酸上的7個位點(diǎn)14種突變會導(dǎo)致雜草對ACCase抑制劑類除草劑產(chǎn)生的抗性及其交互抗性情況(表3)。

表3 ACCase氨基酸突變導(dǎo)致雜草對ACCase類抑制劑類除草劑的交互抗性1)Table 3 Cross-resistance to ACCase-inhibiting herbicides caused by amino acid mutations in ACCase

3.3 篩選能夠治理抗精噁唑禾草靈雜草的除草劑

科學(xué)合理地選用除草劑防除抗精噁唑禾草靈雜草需要在明確雜草抗藥性機(jī)理的基礎(chǔ)上,清楚雜草的交互抗性及多抗性,科學(xué)界定針對該抗性雜草應(yīng)禁用或限用的除草劑類別或產(chǎn)品,最終選擇合適的除草劑。針對抗精噁唑禾草靈菵草種群,潘浪發(fā)現(xiàn)甲基二磺隆、啶磺草胺、異丙隆對抗性菵草具有良好的防效[10];徐洪樂等對抗精噁唑禾草靈日本看麥娘種群的多抗性研究發(fā)現(xiàn),其對氟唑磺隆、甲基二磺隆、磺?；锹?、啶磺草胺、乙草胺、撲草凈、綠麥隆表現(xiàn)敏感[24]?？咕珖f唑禾草靈的耿式假硬草[32]和抗精噁唑禾草靈的多花黑麥草[13]尚未對甲基二磺隆、啶磺草胺、撲草凈、異丙隆等除草劑產(chǎn)生多抗性。盡管抗精噁唑禾草靈的雜草對上述ALS類抑制劑的多抗性不嚴(yán)重,對一些常用的ALS類抑制劑如甲基二磺隆、啶磺草胺等仍然敏感,但是這類藥劑的抗藥性風(fēng)險很高,在防治時盡量回避這類藥劑。

作為防除小麥田禾本科雜草的主要除草劑精噁唑禾草靈及同類除草劑炔草酯等的抗藥性及其對ACCase類除草劑的交互抗性和對其他除草劑的多抗性不斷被報道,設(shè)計(jì)開發(fā)新型作用機(jī)理的除草劑成為當(dāng)前防除抗性雜草的急切要求。由青島清原作物科學(xué)有限公司開發(fā)的新型化合物環(huán)吡氟草酮是HPPD抑制劑類除草劑,對小麥田的各種看麥娘屬雜草(含抗性)表現(xiàn)出很好的防除效果[78]。

4 問題與展望

我國學(xué)者在麥田抗精噁唑禾草靈雜草研究方面取得了很大的進(jìn)展,明確了抗性雜草的種類、揭示了抗性機(jī)理以及初步提出了抗性雜草治理的策略。但是在雜草對精噁唑禾草靈的非靶標(biāo)機(jī)理研究方面不夠系統(tǒng)、不夠深入,在精噁唑禾草靈吸收傳導(dǎo)差異方面未見報道,代謝精噁唑禾草靈的具體途徑、代謝產(chǎn)物,篩選并驗(yàn)證能夠代謝精噁唑禾草靈的功能基因及功能基因的調(diào)控途徑等方面尚處空白。近年來,隨著精噁唑禾草靈對小麥田雜草的防效不斷下降,代替性除草劑啶磺草胺、甲基二磺隆等除草劑在小麥田的使用規(guī)模不斷擴(kuò)大,抗精噁唑禾草靈雜草的多抗性問題開始逐漸顯現(xiàn),這種現(xiàn)象值得我們警惕。2020年李君君等報道了日本看麥娘對精噁唑禾草靈的代謝抗性導(dǎo)致了其對高效氟吡甲禾靈、甲咪唑煙酸、雙草醚、甲基二磺隆等產(chǎn)生中高水平的抗性[79]。周志恒等發(fā)現(xiàn)2020年采集的抗精噁唑禾草靈的野燕麥對ALS類啶磺草胺、PSⅡ 類綠麥隆和HPPD類環(huán)吡氟草酮表現(xiàn)出了敏感性下降[16]。因此,輪用不同作用靶標(biāo)、較低選擇壓的除草劑是控制抗精噁唑禾草靈雜草蔓延的重要措施,而且抗性雜草的治理還需要與耕作、栽培等農(nóng)藝措施結(jié)合起來,如作物輪作能避免在農(nóng)田中長期單一使用除草劑。