王 磊,馬玉紅,吳國(guó)芳*,索宏德,賀麗霞

(1.青海大學(xué) 畜牧獸醫(yī)科學(xué)院/青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016;2.青海省牦牛工程技術(shù)研究中心,青海 西寧 810016;3.青海省高原家畜遺傳資源保護(hù)及創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016;4.大通縣橋頭鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,青海 海東 810600;5.漢中市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,陜西 漢中 723000)

瘤胃含有多種原核(細(xì)菌和古細(xì)菌)和真核(原生動(dòng)物和真菌)微生物,其中20%的瘤胃厭氧真菌在降解纖維素方面發(fā)揮重要作用[1],其參與植物源性聚合物向單體的初始轉(zhuǎn)化,不僅能利用根莖穿透植物細(xì)胞壁的角質(zhì)層和木質(zhì)素,還能分泌降解植物細(xì)胞壁的水解酶,包括纖維素酶、半纖維素酶(木聚糖酶)、酯酶(阿魏酰酯酶、乙酰酯酶和對(duì)香豆酸酯酶)、漆酶和纖維素酶[2-3],從而分解粗飼料(如稻草、干草、青貯飼料)中的纖維素,產(chǎn)生可供反芻動(dòng)物能量代謝的揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)等代謝小分子[4],從而提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)力[5]。因此,瘤胃微生物在飼料轉(zhuǎn)化、生產(chǎn)性能和動(dòng)物健康方面起著關(guān)鍵作用[6]。瘤胃厭氧真菌分泌體代謝底物以提供營(yíng)養(yǎng),因此,它是真菌競(jìng)爭(zhēng)力的決定因素,對(duì)真菌生長(zhǎng)和繁殖至關(guān)重要[7]。瘤胃真菌群落的組成受許多因素影響,如環(huán)境、飲食、喂養(yǎng)方式和年齡[8]。日糧精料比顯著影響瘤胃中厭氧真菌的組成,隨著日糧精料比例的增加,子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和接合菌門(mén)(Zygomycota)顯著增加[9]。前期研究表明緩釋尿素可影響牦牛瘤胃的微生物群落和多樣性,緩釋尿素的增加降低了牦牛瘤胃畢赤酵母菌(Pichia)和地絲菌(Geotrichum)的豐度[10]。在奶牛瘤胃真菌的演替過(guò)程中,厭氧真菌Orpinomyces和新木犀科(Newcallimastigaceae)的相對(duì)豐度隨著日齡和斷奶前的飲食變化而變化[11]。

成年反芻動(dòng)物的瘤胃是一個(gè)成熟、穩(wěn)定的微生物生態(tài)系統(tǒng),宿主與微生物之間具有很強(qiáng)的互作性。因此,在外源性干預(yù)(例如瘤胃液移植和添加外源性菌制劑或抗生素)后,瘤胃的微生物組組成和微生物發(fā)酵參數(shù)可恢復(fù)到其原始或干預(yù)前的狀態(tài)[12]。新生或反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育的早期是飲食干預(yù)瘤胃微生物定植的最佳時(shí)期[13]。研究表明,對(duì)新生山羊進(jìn)行連續(xù)3個(gè)月飲食干預(yù)可改變斷奶后羔羊瘤胃微生物的組成,并影響宿主表型(如甲烷排放或VFA組成)[14]。研究發(fā)現(xiàn),與成年反芻動(dòng)物瘤胃液移植相比,對(duì)幼齡反芻動(dòng)物進(jìn)行瘤胃微生物移植可以有更好、更長(zhǎng)期的干預(yù)效果[12]。總的來(lái)講,在對(duì)新生或幼齡反芻動(dòng)物進(jìn)行瘤胃微生物移植前,必須系統(tǒng)深入地了解其瘤胃微生物的動(dòng)態(tài)演替規(guī)律,從而可確定最佳干預(yù)時(shí)間和目標(biāo)微生物。前期的研究探索了不同年齡、飲食和喂養(yǎng)條件下藏羊瘤胃細(xì)菌和古菌的動(dòng)態(tài)演替過(guò)程[9,15],然而關(guān)于藏羊瘤胃真菌的系統(tǒng)研究較少,特別是在藏綿羊的幼齡階段。因此,本研究選取放牧條件下,不同年齡階段(0、2、7、14、28、42、56、70和360 d)藏綿羊27只,采集其瘤胃內(nèi)容物進(jìn)行ITS基因測(cè)序,深入研究不同日齡羔羊瘤胃真菌組成及動(dòng)態(tài)演替規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與生態(tài)環(huán)境

本試驗(yàn)在青海省黃南州尖扎縣措周鄉(xiāng)洛哇村卻巴養(yǎng)殖專業(yè)合作社(北緯36°39′20″～36°10′00″,東經(jīng)101°37′43″～102°08′40″)進(jìn)行。試驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)草地面積1 266 hm2,平均海拔3 500 m以上,年平均氣溫7.8 ℃,年平均降雨量350～400 mm。草場(chǎng)植被覆蓋率高,分布面積大,夏季主要植物包括莎草科矮蒿草、小蒿草、線葉蒿和其他相關(guān)植物(矮火絨、小早熟禾、高山唐松草);秋季主要植物包括苔蘚(小葉苔蘚和大葉苔蘚)、小莎草和其他相關(guān)植物(如早熟禾、芒屬和針禾屬);冬春季主要植物包括苔蘚、小蒿草、狗尾草、針茅草、珠芽蓼等。牧草營(yíng)養(yǎng)成分(以干物質(zhì)計(jì),%):春季:干物質(zhì)(DM)93.4±0.94、粗蛋白6.35±1.21、中性洗滌纖維(NDF)64.28±1.83、酸性洗滌纖維(ADF)37.42±1.48、粗灰分(Ash)7.62±0.31;夏季:干物質(zhì)(DM)94.35±0.81、粗蛋白16.02±1.82、中性洗滌纖維(NDF)47.98±6.56、酸性洗滌纖維(ADF)22.41±2.19、粗灰分(Ash)9.22±2.22;秋季:干物質(zhì)(DM)94.81±0.81、粗蛋白8.69±2.81、中性洗滌纖維(NDF)57.34±3.84、酸性洗滌纖維(ADF)30.48±4.12、粗灰分(Ash)10.01±2.11;冬季:干物質(zhì)(DM)95.23±1.08、粗蛋白6.72±0.84、中性洗滌纖維(NDF)62.57±1.14、酸性洗滌纖維(ADF)34.15±1.32、粗灰分(Ash)8.46±0.38。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選擇年齡、胎次相近的60只2胎健康藏羊母羊作為試驗(yàn)備選母羊,于2016年7月進(jìn)行同期發(fā)情處理并人工授精。在配種后60 d、90 d對(duì)試驗(yàn)備選母羊進(jìn)行B超早期妊娠診斷。選擇確認(rèn)懷孕、體況良好的妊娠母羊作為最終試驗(yàn)用母羊。2016年12月母羊產(chǎn)羔后,根據(jù)羔羊瘤胃發(fā)育階段分為4組:非反芻階段Non(D0、D2、D7和D14)、過(guò)渡階段Trans(D28、D42和D56)、反芻期Rumi(D70)和成年期Adult(D360)[16]。母羊和羔羊均在全放牧條件下飼養(yǎng),不進(jìn)行任何補(bǔ)飼。羔羊和母羊白天分開(kāi)飼養(yǎng),晚上一起飼養(yǎng)。在第14天之前,羔羊只喂母乳。第14天之后,小羊和母羊一起放牧,在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中可以自由飲水。放牧羔羊在D70自然斷奶。在對(duì)應(yīng)的日齡階段,羔羊(n=3)在早晨禁食2 h后,通過(guò)注射硫噴妥鈉(0.125 mg/kg體重)和氯化鉀(5～10 mL)實(shí)施安樂(lè)死,然后通過(guò)手術(shù)切除瘤胃[17],收集瘤胃液,置于10 mL無(wú)菌低溫凍存管中。D0和D2羔羊體內(nèi)取出瘤胃并用無(wú)菌生理鹽水沖洗,其他瘤胃樣本通過(guò)4層紗布過(guò)濾,并儲(chǔ)存在-80 ℃。

1.3 DNA提取、建庫(kù)和測(cè)序分析

1.3.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增 采用CTAB法提取基因組DNA樣本[18]。使用NanoDrop 1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度和DNA濃度。樣品在離心管中用無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL。使用引物對(duì)ITS1F/ITS2R(ITS1F:5'-CTTGGTCATTAGGAAGTAA-3'和ITS2R:C5'-GCTGCGTTCCATCATGC-3')[19-20]常規(guī)程序擴(kuò)增真菌ITS序列。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳回收,并用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)純化,然后用Tris-HCl洗脫并用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。使用Quanti-FluorTM-ST(Promega,Madison,WI,USA)進(jìn)行檢測(cè)和定量。

1.3.2 Illumina MiSeq測(cè)序 根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina,San Diego,CA,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作方案將純化和擴(kuò)增的片段構(gòu)建到PE 2×300文庫(kù)。原始FASTQ文件通過(guò)Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)控、過(guò)濾,FLASH (V1.2.11)進(jìn)行合并,QIIME 1.9.1進(jìn)行過(guò)濾以獲得干凈的數(shù)據(jù)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 使用UPARSE,根據(jù)97%的序列相似度對(duì)OTU進(jìn)行聚類。根據(jù)OTU表,利用QIIME軟件生成不同分類水平上(門(mén)、綱、目、科、屬)的物種豐度表和多樣品物種分布圖;使用MUSCLE (v3.8.31)進(jìn)行快速多序列比對(duì),以獲得所有代表性O(shè)TU之間的關(guān)系,然后使用PyNAST軟件進(jìn)行校準(zhǔn)。最后,對(duì)均質(zhì)化數(shù)據(jù)進(jìn)行α和β多樣性分析。當(dāng)數(shù)據(jù)非正態(tài)分布時(shí),使用單向方差分析最小顯著性差異(LSD)檢驗(yàn)或非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)對(duì)數(shù)值進(jìn)行比較。利用QIIME (V1.9.1)計(jì)算UniFrac距離,構(gòu)造UPGMA樹(shù)。使用R(V2.15.3)構(gòu)建主坐標(biāo)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年齡階段藏羊瘤胃真菌群落多樣性分析

通過(guò)ITS基因測(cè)序,共獲得2 002 338條高質(zhì)量DNA序列,平均每個(gè)樣本獲得80 094條高質(zhì)量DNA序列。稀釋曲線趨于平坦,表明瘤胃樣品提供了足夠的OTU覆蓋率,可準(zhǔn)確描述各組的真菌組成(Good的覆蓋率>99%)(圖1A)。Shannon指數(shù)反映了各樣品的真菌多樣性,該指數(shù)在不同年齡組間存在顯著差異(圖1B)。其中D0和D56的多樣性顯著高于D70,D360的多樣性顯著高于D42、D56和D70,說(shuō)明成年瘤胃真菌的多樣性較高。從D2到D70,Shannon指數(shù)呈下降趨勢(shì)(圖1B)。根據(jù)瘤胃的發(fā)育過(guò)程,每組樣品分為4個(gè)階段:非反芻階段(Non:D0、D2、D7和D14),過(guò)渡階段(Trans:D28、D42和D56),反芻階段(Rumi:D70)和成體期(Adult:D360)。PCoA分析結(jié)果表明,瘤胃真菌群落隨年齡變化很大,瘤胃真菌在非反芻、過(guò)渡、反芻和成年4個(gè)主要發(fā)育階段呈現(xiàn)顯著差異,尤其是反芻和成年階段與非反芻階段相比存在顯著差異(圖1C)。

圖1 羔羊瘤胃真菌群落多樣性分析

2.2 不同年齡階段藏羊瘤胃真菌群落組成分析

對(duì)4個(gè)關(guān)鍵發(fā)育階段瘤胃真菌組成進(jìn)一步分析表明:在門(mén)水平上,非反芻階段的優(yōu)勢(shì)菌為子囊菌門(mén)(Ascomycota),相對(duì)豐度為44.91%;在過(guò)渡、反芻和成年階段藏羊瘤胃優(yōu)勢(shì)菌為新鞭毛菌門(mén)(Neocallimastigomycota),相對(duì)豐度分別為48.49%、98.53%和86.07%。擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)的豐度隨年齡的增加而逐漸減少。在非反芻階段和過(guò)渡段,Basidiomycota是第二大優(yōu)勢(shì)真菌,其豐度分別為36.94%和39.84%(圖1D);在屬水平上,非反芻階段的優(yōu)勢(shì)真菌為新麗鞭毛菌屬(Neocallimastix)、復(fù)膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)、分枝孢子菌屬(Cladosporium)、Udeniomyces、隱球菌屬(Cryptococcus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉菌屬(Aspergillus)、壺菌屬(Batrachochytrium)和赤霉菌屬(Gibberella)(豐度大于1%),在過(guò)渡階段的優(yōu)勢(shì)真菌為新麗鞭毛菌屬(Neocallimastix)、分支孢子菌屬(Cladosporium)、隱球菌屬(Cryptococcus)和Udeniomyces(豐度大于1%),而在反芻和成年階段,唯一豐度大于1%的真菌是新麗鞭毛菌屬(Neocallimastix),豐度水平分別為47.34%和6.02%(圖2)。與Trans階段相比,Rumi階段Udeniomyces和Sporobolomyces的豐度顯著較高,Cladoporium和Cryptococcus作為豐度較低的真菌菌屬,只在Rumi階段的樣品中被檢測(cè)到。

圖2 不同日齡瘤胃真菌群落在屬水平上的熱圖

為更清楚地描述羔羊不同年齡階段瘤胃真菌群落的分布特征,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了日齡分組分析。在門(mén)水平上,瘤胃真菌以子囊菌門(mén)(Ascomycota)、新鞭毛菌門(mén)(Neocallimastigomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)為主,總相對(duì)豐度在75%以上。隨著羔羊日齡的增加,子囊菌門(mén)(Ascomycota)和新鞭毛菌門(mén)(Neocallimastigomycota)相對(duì)豐度變化最為明顯。從D0～D360,Ascomycota相對(duì)豐度從75.4%減少到10%,新鞭毛菌門(mén)(Neocallimastigomycota)相對(duì)豐度從0.5%增加到86.1%(圖3A)。瘤胃不同發(fā)育階段的真菌組成也有顯著差異。非反芻階段子囊菌門(mén)(Ascomycota)相對(duì)豐度顯著低于過(guò)渡階段。反芻階段新鞭毛菌門(mén)(Neocallimastigomycota),子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)相對(duì)豐度顯著低于過(guò)渡階段(圖3B)。

在屬水平上,不同年齡組的真菌組成存在顯著差異(圖3C)。D0的優(yōu)勢(shì)菌為壺菌屬Batrachochytrium(7.92%)、曲霉菌屬Aspergillus(4.88%)、鏈格孢屬Alternaria(4.69%)、莖點(diǎn)霉屬Phoma(2.67%)、塔角孢屬Tagonosporopsis(2.44%)、踝節(jié)菌屬Talaromyces(1.83%)、盾巨孢囊霉屬Scutellospora(1.66%)、帚枝霉菌屬Sarocladium(1.48%)、葡萄孢屬Botrytis(1.26%)、Crinipellis(0.84%)、假絲酵母菌屬Candida(0.81%)、Darksidea(0.76%)、斯賓塞馬丁氏菌屬Spencermartinsia(0.67%)、邁耶氏酵母菌屬M(fèi)eyerozyma(0.59%)、殼針孢屬Septoria(0.57%)、Zymoseptoria(0.53%)和漆斑菌屬M(fèi)yrothecium(0.49%)。隨著年齡的增加,D0優(yōu)勢(shì)菌的平均相對(duì)豐度逐漸降低。從D0到D360,壺菌屬(Batrachochytrium)平均相對(duì)豐度從7.92%下降到0%,曲霉菌屬(Aspergillus)也呈下降趨勢(shì)。其他真菌的平均相對(duì)豐度隨著年齡的增長(zhǎng)而增加,從D0到D70,新麗鞭毛菌菌屬(Neocallimastix)相對(duì)豐度從0.12%增加到47.3%;從D0到D56,豐屋菌屬(Plenodomus)相對(duì)豐度從0%增加到0.5%(圖4C)。前10位優(yōu)勢(shì)菌在不同年齡段的分布不同。D2的優(yōu)勢(shì)菌為復(fù)膜孢酵母菌屬(Saccharomycopsis)和分支孢子菌屬(Cladosporium),平均相對(duì)豐度分別為31%和19%。從D2到D360,復(fù)膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)的豐度從31%下降到0%。D14的優(yōu)勢(shì)菌為Udeniomyces,平均相對(duì)豐度為14.9%。D14以后,真菌的平均相對(duì)豐度迅速下降。Udeniomyces在D70的相對(duì)豐度最高,達(dá)47.3%,而在D360的相對(duì)豐度僅為6%。在D360,平均相對(duì)豐度最高的前10個(gè)屬的百分比很小,這表明瘤胃中的大多數(shù)真菌尚未鑒定(圖3D)。

圖4 羔羊瘤胃真菌屬間相互作用的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 藏羊瘤胃真菌間的相互作用共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

為在屬水平上更清楚地分析瘤胃真菌之間的相互作用,構(gòu)建了瘤胃真菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明,Ascomycota、Basidiomycota、Zygomycota、球囊菌(Glomeromycota)和Chytridiomycota在屬水平上存在正相關(guān)關(guān)系。Neocallimastix與鹿單孢菌屬(Stagonosporopsis)、Geotrichum、Botrytis、浮球菌屬(Epicoccum)和Saccharomycopsis呈顯著負(fù)相關(guān),而支頂孢屬(Acremonium)和Scutellospora屬呈顯著正相關(guān)(圖4)。瘤胃不同組分之間存在復(fù)雜的相互作用,其中可能包括細(xì)菌-真菌-原生動(dòng)物-病毒-噬菌體相互作用系統(tǒng),這需要更深入的進(jìn)一步的研究。

通過(guò)對(duì)綿羊瘤胃真菌進(jìn)化關(guān)系的分析,發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)屬Neocallimastix與Saccharomycopsis有著密切的親緣關(guān)系。Pyrenula,Saccharomycopsis與Meyerozyma和柳條霉菌屬(Wickerhamomyces)有著密切的遺傳關(guān)系,而Neocallimastix與Saccharomycopsis有著密切的遺傳關(guān)系(圖5)。

4 討 論

本研究旨在系統(tǒng)研究瘤胃真菌群落從出生到成年的動(dòng)態(tài)演替過(guò)程,闡明幼齡藏綿羊的瘤胃在不同日齡、生理階段、分類水平的群落真菌組成。反芻動(dòng)物瘤胃真菌群落組成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,受多種因素影響,包括飲食[9-11,21]和年齡[8]。研究發(fā)現(xiàn),在羔羊出生后的第1天,瘤胃中存在許多真菌。在門(mén)水平上,以子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為主;在屬水平上,共有17個(gè)優(yōu)勢(shì)屬,包括Aspergillus,Alternaria,Myrothecium,Septoria,Batrachochytrium,Scutellospora,Crinipellis,Talaromyces,Spencermartinsia,Darksidea,Phoma,Zymoseptoria,Botrytis,Meyerozyma,Sarocladium,Candida和Stagonosporopsis。通過(guò)真菌多樣性分析發(fā)現(xiàn),從D2～D70,不同日齡組瘤胃真菌多樣性逐漸降低,這可能是由于某些真菌或細(xì)菌在瘤胃中的快速增加受到其它真菌定植的抑制。不同年齡組羔羊瘤胃中的優(yōu)勢(shì)真菌也隨年齡變化。在門(mén)水平上,瘤胃真菌以Ascomycota、Neocallimastigomycota和Basidiomycota為主,總相對(duì)豐度在75%以上。在屬水平上,Neocallimastix相對(duì)豐度從D0的0.12%增加到D70的47.3%。厭氧真菌在大型食草動(dòng)物的胃腸道中占有獨(dú)特的生態(tài)位,被認(rèn)為是消化過(guò)程中消化植物細(xì)胞壁的主要力量,它們分泌高纖維素分解酶和半纖維素分解酶,穿透角質(zhì)層分解植物細(xì)胞壁,使纖維更容易被細(xì)菌分解和利用[22-24]。成年反芻動(dòng)物中,瘤胃真菌占瘤胃微生物總量的3%～4%。如果缺乏真菌,動(dòng)物瘤胃纖維素的降解速率將顯著減少[25]。因此,高纖維飲食會(huì)促進(jìn)瘤胃真菌比例的增加[26]。然而,瘤胃細(xì)菌不降解木質(zhì)素,這阻礙了碳水化合物的利用。在自然界中,死去的植物可以被自然界中的某種真菌降解,例如木質(zhì)素選擇性降解真菌Lentinulaedodes[27],但其在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中降解木質(zhì)素而不消耗纖維素。在綿羊瘤胃中未檢測(cè)到該真菌。前期研究表明Neocallimastix具有很強(qiáng)的纖維素降解能力[28],與羔羊年齡變化具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

在青藏高原放牧的牦牛和藏羊的瘤胃真菌群落研究中,無(wú)論宿主種類如何,Neocallimastigomycota菌群均占優(yōu)勢(shì)[29]。山羊瘤胃真菌群落研究中,在D0、D3、D14、D28和D56瘤胃真菌有51個(gè)常見(jiàn)屬,主要包括Cryptococcus、Aspergillus和盲腸鞭菌屬(Caecomyces)。Aspergillus在第0天約占47%,但隨后從D3下降到D14[20]。這與本試驗(yàn)數(shù)據(jù)中反映的結(jié)果一致。真菌來(lái)源的α-淀粉酶在飼料工業(yè)中非常重要,因?yàn)樗鼜牡矸壑嗅尫牌咸烟呛望溠刻?這可能促進(jìn)酵母存活和動(dòng)物攝入后的酵母代謝活性[30]。米曲霉(Aspergillusoryzae)是一種商用產(chǎn)品,作為免疫刺激劑發(fā)揮著重要作用[31]。結(jié)果表明,D7后瘤胃中的真菌屬以Neocallimastix為核心。而具有豐富纖維素分解酶、木聚糖分解酶和果膠分解酶譜的加利福尼亞新麗鞭毛菌(Neocallimastixcaliforniae),可以幫助瘤胃有效降解植物纖維并獲得宿主所需能量[7]。此外,隨著羔羊年齡的增加,瘤胃攝入粗纖維的比例增加,這對(duì)瘤胃真菌群落的定植和組成豐度有很大影響。給陜北白絨山羊飼喂不同粗纖維比例的飼料發(fā)現(xiàn),瘤胃中Ascomycota、Basidiomycota和Zygomycota的豐度顯著增加,Alternaria、Aspergillus、Neocallimastix、Orpinomyces、單鞭毛菌(Piromyces)和葡萄穗霉屬(Stachybotrys)的豐度顯著增加[9]。此外,以山羊?yàn)榉雌c動(dòng)物模型,日糧中不同比例玉米(0%、25%和50%)對(duì)瘤胃微生物及其代謝產(chǎn)物的影響表明,食物中高比例的谷物增加了纖毛蟲(chóng)和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量,但降低了厭氧真菌的密度和古細(xì)菌的群落豐富度,同時(shí)也增加了內(nèi)毒素、色胺、酪氨酸、組胺和苯乙酸的表達(dá)水平[32]。本研究中的羔羊經(jīng)歷了3個(gè)不同的階段——母乳喂養(yǎng)、母乳和粗飼料喂養(yǎng)和僅粗飼料喂養(yǎng),每個(gè)階段都會(huì)引起瘤胃真菌群落的重大變化。與D360相比,D70瘤胃真菌群落結(jié)構(gòu)不同,說(shuō)明D70瘤胃真菌尚未達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),穩(wěn)定過(guò)程緩慢。由于放牧條件下,成年羊攝入的粗飼料種類復(fù)雜,粗纖維含量較高,這可能是造成真菌群落結(jié)構(gòu)豐度變化的主要原因。前期的研究表明,與舍飼條件相比,成年放牧灘羊瘤胃Naganishia屬、線黑粉菌屬(Filobasidium)和酵母屬(Saccharomyces)菌屬豐度極顯著升高[33]。此外,我們還發(fā)現(xiàn)瘤胃真菌多樣性在D0時(shí)較高,隨著年齡的增長(zhǎng),真菌多樣性逐漸降低。這可能與出生后攝入初乳有關(guān),初乳的攝入使得胃腸道中的乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度上升,胃腸道pH降低,真菌的生長(zhǎng)被抑制[34-36]。

共現(xiàn)分析揭示了綿羊瘤胃中不同真菌的不同互作模式。研究發(fā)現(xiàn),Neocallimastigaceae是山羊瘤胃中的核心科,與其他真菌(座囊菌Dothideomycetes,格孢腔菌Pleosporales,雙孢霉Didymellaceae,長(zhǎng)崎菌Naganishia,Ascomycota,莢胞腔菌Sporormiaceae和Plenodomus)呈負(fù)相關(guān)[15]。這與本研究結(jié)果一致。最近的一項(xiàng)研究確定了Neocallimastigomycota的支架蛋白,并揭示了真菌群落中dockerin支架蛋白的相互作用[37]。厭氧真菌支架蛋白與多種厭氧真菌中含dockerin蛋白表現(xiàn)出交叉反應(yīng)。真菌纖維素體的這一特征可能對(duì)瘤胃內(nèi)多種真菌共存具有重要作用[38]。該研究為日齡對(duì)不同屬真菌共生生態(tài)模式的影響提供了新的見(jiàn)解。初產(chǎn)羔羊瘤胃真菌群落較為單一,隨著綿羊年齡的增加,真菌群落逐漸穩(wěn)定、成熟,表現(xiàn)出復(fù)雜共生模式。

5 結(jié) 論

放牧條件下藏綿羊瘤胃真菌群落定植具有顯著的時(shí)間特異性,其與各時(shí)間的飼料攝入有關(guān)。主要核心菌門(mén)在反芻前和反芻后發(fā)生劇烈的豐度變化。在門(mén)水平上,主要優(yōu)勢(shì)真菌為Ascomycota、Neocallimastigomycota和Basidiomycota,總相對(duì)豐度在75%以上。在屬水平上,不同日齡階段羔羊瘤胃中存在不同的特征真菌。D2的優(yōu)勢(shì)屬為Saccharomycopsis和Cladosporium,D70的優(yōu)勢(shì)屬為Neocallimastix。本研究系統(tǒng)分析了放牧條件下藏綿羊動(dòng)物瘤胃真菌隨日齡的演替過(guò)程,為幼年動(dòng)物早期斷奶和早期日糧干預(yù)提供了理論依據(jù)。