周改玲,喬宏興

(1.河南省商水縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南 商水 466199;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院,河南 鄭州 450046)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)又稱糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis),屬于革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧球菌,能長(zhǎng)期寄生于動(dòng)物、食品、植物、水等各種環(huán)境[1],是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群,但并不是所有的糞腸球菌都為有益菌,一部分糞腸球菌屬于條件致病菌,主要由其毒力因子引起。近年來,由糞腸球菌引起的人及動(dòng)物感染、死亡的病例增多[2],如引起人傳染性心內(nèi)膜炎、雞敗血癥、公豬睪丸炎、家兔腹瀉等,可在人與動(dòng)物之間水平傳播[3-5]。沙門氏菌病(Salmonellosis)又稱沙門氏菌食物中毒、沙門氏菌性小腸結(jié)腸炎等,是由沙門氏菌感染引起的人和各種動(dòng)物疾病的總稱。人感染沙門氏菌臨床上主要侵入血液循環(huán)及消化道引起傷寒以及急性胃腸炎[6]。動(dòng)物沙門氏菌感染主要表現(xiàn)為敗血癥、腸炎和慢性腸炎等[7]。

2021年8月份河南省周口市某鴨場(chǎng)番鴨陸續(xù)發(fā)病,臨床主要表現(xiàn)為精神沉郁、縮脖、采食減少、拉稀等癥狀,死亡率達(dá)20%。本試驗(yàn)從發(fā)病死亡番鴨組織中分離出菌株并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和耐藥性分析,以期為鴨源細(xì)菌病的預(yù)防和治療提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

無菌采集河南省周口市某鴨場(chǎng)死亡的成年番鴨病變肝臟、脾臟組織備用。

1.2 主要試劑

血瓊脂平板、SS瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、細(xì)菌藥敏片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;DL2000 DNA Marker、2×Es Taq Master Mix購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司;瓊脂糖購(gòu)自HydraGene公司;Gold View I型核酸染色劑購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與革蘭氏染色

用接種環(huán)挑取病變組織接種于鮮血瓊脂平板和SS瓊脂培養(yǎng)平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

1.4 分離菌16S rRNA基因序列分析

鏡檢后的單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),送上海派諾森基因科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì),將與測(cè)序菌同源性大于等于99%的菌及幾種常見菌16S rRNA序列利用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹及核苷酸同源性分析。

1.5 致病性試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[8]將培養(yǎng)好的2種菌液通過平板計(jì)數(shù)法分別將濃度調(diào)整為1×108CFU/mL。試驗(yàn)設(shè)1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組,每組10只小鼠,對(duì)照組腹腔注射0.1 mL無菌液體培養(yǎng)基,試驗(yàn)1組注射0.1 mL菌株Ⅰ菌液,試驗(yàn)2組注射0.1 mL菌株Ⅱ菌液,試驗(yàn)3組腹腔注射0.1 mL菌株Ⅰ和Ⅱ混合菌液,在保證飼養(yǎng)條件相同的情況下觀察7 d并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況,并對(duì)死亡小鼠的臟器進(jìn)一步分離鑒定。

1.6 藥敏試驗(yàn)

通過k-B法[9]測(cè)定分離菌的耐藥性,記錄抑菌圈直徑大小,根據(jù)藥敏片說明書的抑菌范圍標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.7 耐藥基因PCR鑒定

根據(jù)于美美等[10]、楊芳芳[11]的研究合成四環(huán)素類(TetO、TetS、TetL)、氨基糖苷類(aph(3")-IIa、ant(3")-Ia、aac(6')-Ib)耐藥基因引物核酸序列6對(duì)。引物由上海生工生物工程有限公司合成,具體見表1。

表1 耐藥基因引物序列

從分離菌株的培養(yǎng)平板挑取單菌落接種到TSB及LB液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h。利用水煮法提取細(xì)菌DNA。以各菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:2×Es Taq Master Mix 10 μL,F/R引物(10 μmoL)各0.5 μL,細(xì)菌DNA 2 μL,ddH2O 7 μL。PCR程序:預(yù)變性95 ℃ 10 min,變性95 ℃ 30 s;退火(溫度見表1)30 s;延伸72 ℃ 40 s,35個(gè)循環(huán),終延伸72 ℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。符合預(yù)期大小的核酸條帶膠回收后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與革蘭氏染色

將番鴨病變組織劃線培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),鮮血瓊脂培養(yǎng)平板長(zhǎng)出一種灰白色、濕潤(rùn)光滑、凸起的圓形菌落(圖1A),菌落周圍形成ɑ溶血環(huán),革蘭氏染色直徑為0.4～1.0 μm,呈球形或橢圓形、單個(gè)、雙個(gè)或鏈狀存在的陽(yáng)性球菌,無芽孢、無莢膜(圖1C),符合糞腸球菌特征,命名為HN2021Ef菌株;SS培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出一種無色透明、表面光滑、濕潤(rùn)、中心有黑點(diǎn)的菌落(圖1B),革蘭氏染色鏡鑒觀察為短桿陰性菌(圖1D),符合沙門氏菌特征,命名為HN2021Sa菌株。

圖1 細(xì)菌分離及鏡鑒結(jié)果

2.2 分離菌16S rRNA基因序列分析

將分離的HN2021Ef菌株純化后送公司測(cè)序,用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄信cNCBI 16S數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,HN2021Ef與糞腸球菌(序列號(hào)JQ388685.1)相似性達(dá)100%,且與其它糞腸球菌株的同源性均大于99%,根據(jù)不同屬細(xì)菌16S rRNA基因同源性為70%～90%,而同一種內(nèi)不同株間基因同源性>99%[12],確定該細(xì)菌為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。同時(shí)將與待測(cè)目的序列同源性大于99%的11個(gè)菌株及沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌參考毒株的16S rRNA基因序列用軟件MEGA 6.06進(jìn)行多序列匹配排列,以Neighbor-Joining方式進(jìn)行同源性比較,并繪制進(jìn)化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本菌與11種糞腸球菌均在一個(gè)分支中,而沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌與本菌株均不在一個(gè)分支,同源性差異很大,具體見圖2、圖3。

圖2 糞腸球菌HN2021Ef株16S rRNA分析結(jié)果

圖3 糞腸球菌HN2021Ef株16S rRNA基因核苷酸序列同源性分析

同樣將分離的HN2021Sa菌種純化后送公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與NCBI 16S數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,最靠前的30多個(gè)序列均為禽沙門氏菌,與該菌的相似性均為99.93%,確定該細(xì)菌為沙門氏菌[12]。將與待測(cè)物種序列同源性大于99%的任意5個(gè)菌株及選取的鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌的16S rRNA基因序列用軟件MEGA 6.06進(jìn)行同源性比較,并繪制進(jìn)化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本菌與5種禽沙門氏菌均在一個(gè)分支中,而鴨疫里默氏菌、大腸桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌等菌株與本菌株均不在一個(gè)分支,同源性差異很大,具體見圖4、圖5。

圖4 沙門氏菌HN2021Sa株16S rRNA分析結(jié)果

圖5 沙門氏菌HN2021Sa株16S rRNA基因核苷酸序列同源性分析

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

小鼠感染沙門氏菌,24 h后均陸續(xù)出現(xiàn)精神萎頓、聚堆、拉稀便等癥狀,36 h后陸續(xù)出現(xiàn)死亡,7 d后死亡3只。小鼠感染糞腸球菌后,12 h出現(xiàn)精神沉郁,食欲減退癥狀,156 h后死亡1只,其余小鼠恢復(fù)正常。而混合感染的小鼠在8 h后均陸續(xù)出現(xiàn)嗜睡、腹瀉、食量減少等癥狀,24 h出現(xiàn)死亡,7 d后死亡5只。對(duì)照組小鼠均無異常。具體結(jié)果見表2。分離3組試驗(yàn)組死亡小鼠肝臟培養(yǎng)細(xì)菌,經(jīng)鑒定1組為沙門氏菌,2組為糞腸球菌,3組為沙門氏菌和糞腸球菌。

表2 2種分離菌對(duì)小鼠致病性結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)

對(duì)分離的沙門氏菌菌株和糞腸球菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果表明,沙門氏菌對(duì)頭孢噻肟、氟苯尼考、阿莫西林3種藥物敏感;對(duì)環(huán)丙沙星、安普霉素、氨芐西林、硫酸黏菌素、替米考星5種藥物中度敏感;對(duì)慶大霉素、多西環(huán)素2種藥物完全耐藥。糞腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素、安普霉素、頭孢噻肟、氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林、替米考星8種藥物敏感;對(duì)氨芐西林、硫酸黏菌素2種藥物中度敏感,對(duì)多西環(huán)素1種藥物完全耐藥,具體結(jié)果見表3。

表3 糞腸球菌菌株及沙門氏菌菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 耐藥基因分析

在對(duì)沙門氏菌及糞腸球菌耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)沙門氏菌檢出四環(huán)素TetO、TetS耐藥基因及氨基糖苷類ant(3")-Ia耐藥基因,糞腸球菌檢出四環(huán)素TetL耐藥基因,具體結(jié)果見圖6。

圖6 糞腸球菌和沙門氏菌菌株四環(huán)素類耐藥基因電泳結(jié)果

3 討 論

本試驗(yàn)從病變番鴨組織中分離鑒定出沙門氏菌及糞腸球菌,經(jīng)16s rRNA序列測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)分離的2種菌株與沙門氏菌及糞腸球菌的同源性最高。其系統(tǒng)發(fā)育樹與核苷酸序列同源性分析結(jié)果表明,不同物種、不同地域、不同時(shí)間上分離的沙門氏菌及糞腸球菌其差異性較小,但不同種屬菌株之間存在一定的差異性,從分子水平上證實(shí)分離的2株不同形態(tài)的菌株分別為糞腸球菌和沙門氏菌。

關(guān)于細(xì)菌耐藥問題在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中一直普遍存在,不合理的用藥方案和藥物泛濫使用,加速耐藥菌株的出現(xiàn)。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,樣品中分離的沙門氏菌對(duì)多西環(huán)素和慶大霉素均完全耐藥,分離出的糞腸球菌對(duì)多西環(huán)素完全耐藥,分離出的2種菌對(duì)其余幾種抗生素出現(xiàn)了不同程度的耐受性。同時(shí)本試驗(yàn)對(duì)分離的沙門氏菌分別進(jìn)行四環(huán)素類(TetO、TetS、TetL)耐藥基因和氨基糖苷類(aph(3")-IIa、ant(3")-Ia、aac(6')-Ib)耐藥基因檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙門氏菌菌株檢測(cè)到TetO、TetS、ant(3")-Ia耐藥基因。TetO和TetS屬于四環(huán)素耐藥機(jī)制中的核糖體保護(hù)蛋白,該蛋白能保護(hù)核糖體不被四環(huán)素作用,使細(xì)菌具有抵抗多西環(huán)素等的能力[13]。氨基糖苷類核苷轉(zhuǎn)移酶(ANT)屬于氨基糖苷類鈍化酶類之一。鄧飛等[14]研究表明由沙門氏菌的耐藥基因編碼的氨基糖苷類修飾酶可對(duì)氨基糖苷類的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,使其失活而無法作用于沙門氏菌,這是介導(dǎo)氨基糖苷類耐藥的主要機(jī)制。李少博等[15]認(rèn)為,沙門氏菌的耐藥性是由于編碼沙門氏菌某些成分的基因發(fā)生突變而造成的,而抗性基因的嵌入及通過基因的轉(zhuǎn)移也能導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)。本試驗(yàn)對(duì)分離的糞腸球菌進(jìn)行四環(huán)素類(TetO、TetS、TetL)耐藥基因檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)糞腸球菌菌株中出現(xiàn)TetL耐藥基因。TetL屬于四環(huán)素耐藥機(jī)制中的外輸泵蛋白第2群蛋白,主要存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中,Tet外輸泵基因編碼的相關(guān)膜蛋白可將四環(huán)素泵出胞外,降低了細(xì)胞內(nèi)保護(hù)核糖體的藥物濃度,從而產(chǎn)生耐藥[13]。因此在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中,對(duì)抗生素的使用要給予足夠的重視,特別是因抗生素的濫用,多重耐藥菌株大量出現(xiàn),且產(chǎn)生的因素復(fù)雜,控制難度大[16]。因此檢測(cè)細(xì)菌的耐藥性有助于全面掌握耐藥性的流行規(guī)律,也為畜禽抗菌藥物的合理使用提供警示和科學(xué)合理的依據(jù)。

關(guān)于動(dòng)物單獨(dú)感染糞腸球菌及沙門氏菌的報(bào)道很多,陳一資等[17]發(fā)現(xiàn)由糞鏈球菌感染的肉鴨爆發(fā)傳染病,且死亡率很高。李慧等[2]將不同劑量的糞腸球菌人工感染小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠腦部呈現(xiàn)不同程度的血腦屏障損傷。井郁金等[18]發(fā)現(xiàn)某羊場(chǎng)由于金黃色葡萄球菌與糞鏈球菌混合感染導(dǎo)致該羊群體溫升高、咳嗽,發(fā)病不斷。沙門氏菌主要發(fā)生于雛鴨等幼禽的急性細(xì)菌傳染病[19-21]。本試驗(yàn)采樣的鴨場(chǎng)在疫病發(fā)生后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),排除病毒性疾病感染,從肝臟中分離出致病性的沙門氏菌和糞腸球菌,致病性試驗(yàn)結(jié)果表明混合感染2種菌的小鼠死亡率增加。分析原因發(fā)現(xiàn)該鴨場(chǎng)每個(gè)鴨舍飼養(yǎng)密度太大,空氣流通不暢,臭味熏天,蒼蠅較多,且鴨舍濕度較大,極利于有害細(xì)菌的繁殖。動(dòng)物機(jī)體是一個(gè)免疫力和病原體互相抗衡和較量的環(huán)境,如果機(jī)體免疫力較高,即便有病原體存在,機(jī)體也處于一個(gè)平衡穩(wěn)定的狀態(tài)。但如果因某種因素而導(dǎo)致免疫力下降,大量的病原體將會(huì)侵入宿主并繁殖,黏附于宿主細(xì)胞,分泌毒性物質(zhì)破環(huán)細(xì)胞組織,感染動(dòng)物使其發(fā)病。因此推測(cè)該鴨場(chǎng)此次發(fā)病與鴨場(chǎng)環(huán)境不良導(dǎo)致鴨群抵抗力下降有關(guān),引起糞腸球菌及沙門氏菌混合感染對(duì)鴨群造成影響。但目前鮮有關(guān)于動(dòng)物混合感染糞腸球菌及沙門氏菌的報(bào)道,對(duì)于感染發(fā)病后哪種菌是原發(fā)、哪種菌是繼發(fā)還需要更深入的研究。本試驗(yàn)對(duì)2種菌進(jìn)行了耐藥分析,也為該鴨場(chǎng)對(duì)癥用藥提供參考。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)從死亡成年番鴨肝臟中成功分離致病性糞腸球菌和致病性沙門氏菌。沙門氏菌對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素耐藥,且檢出四環(huán)素類TetO、TetS耐藥基因及氨基糖苷類ant(3")-Ia耐藥基因。糞腸球菌對(duì)多西環(huán)素耐藥,且檢出四環(huán)素類TetL耐藥基因。