陳思清,徐 寅,藺曉源,周賽男,韓運宗,劉 琴,陳龍彪,張海月,魏星旭

(1.湖南中醫(yī)藥大學,湖南 長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007)

功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是臨床常見的消化系統(tǒng)功能性疾病,排除器質性病變后以早飽、餐后不適、燒心等為主要癥狀,約占消化道門診病例的50%,嚴重影響了現(xiàn)代人的正常生活[1-2]。FD的發(fā)病機制尚沒有統(tǒng)一的認知,多年來主要涉及胃-十二指腸動力減弱、腸道菌群變化及內臟敏感性增加等方面。最新研究表明[3-4],十二指腸低度炎癥可能成為FD的又一主要致病機制。十二指腸組織局部炎性浸潤主要表現(xiàn)為MC及嗜酸性粒細胞的局部聚集,肥大細胞(MC)脫顆粒釋放的MC標記性蛋白類胰蛋白酶(Tryptase)、白介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等一系列活性物質能夠直接作用于十二指腸局部,通過改變腸神經(jīng)膜電位、影響腸道平滑肌甚至與中樞神經(jīng)交聯(lián)等導致胃腸道運動減弱及感覺過敏,從而產(chǎn)生早飽、燒灼感等一系列臨床癥狀[5-7]。四磨湯起源于宋代的《重訂嚴氏濟生方》,被廣大醫(yī)家用于治療FD,效果明確且無明顯不良反應[8-10]。目前四磨湯治療FD的具體機制仍在不斷完善與探索中,本研究從十二指腸低度炎癥出發(fā),觀察四磨湯對肝脾氣滯證FD大鼠十二指腸Tryptase基因表達、血清IL-1β及TNF-α含量的影響,探究四磨湯治療肝脾氣滯證FD的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康SD大鼠60只,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,均為雄性大鼠,體重180～220 g。飼養(yǎng)溫度24～26 ℃,濕度50%～70%。適應性飼養(yǎng)7 d后開始造模。

1.2 實驗藥物與主要試劑

1.2.1 實驗藥物:四磨湯方中人參、天臺烏藥、沉香各6 g,檳榔9 g。均購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院門診中藥房。生藥用10倍蒸餾水浸泡0.5 h后加蒸餾水煎煮2次,第1次1.5 h,第2次1.0 h,合并2次濾液,過濾,濃縮,4 ℃保存待用。四磨湯組給藥量分別為5.62、2.81、1.40 g/(kg·d)。灌胃容積均為1 ml/100 g 體重。莫沙必利(成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司,批號:2E019)。給藥前用蒸餾水溶解,按人體用藥量換算成大鼠等效劑量,給藥量為0.305 mg/(kg·d),灌胃容積為1 ml/100 g體重。

1.2.2 主要試劑:大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(廈門侖昌碩生物科技有限公司);大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(廈門侖昌碩生物科技有限公司);Trizol(Invitrogen,批號:10296028);DEPC(MDL,批號:MD911875);Ultra Pure Agarose(ABI-invitrogen,批號:16500100);Super Script Ⅲ RT 逆轉錄kit(ABI-invitrogen,批號:11752050);Sybr qpcr mix(ABI-invitrogen,批號:4472920)。

1.3 實驗主要儀器 熒光定量PCR儀(Applied biosystems,型號:Step One Software);電泳儀(biorad,型號:EPS 300)。

1.4 實驗方法 動物分組與模型制備:將大鼠隨機分為六組,分別為空白組、模型組、西藥組、四磨湯高劑量組、四磨湯中劑量組、四磨湯低劑量組。選取不可預知的慢性應激[11]對模型組及治療組小鼠進行刺激,包括:食物剝奪(24 h);飲水剝奪合并空瓶刺激(12 h);倒懸(30 min);束縛(30 min);夾尾(1 h);明暗顛倒(24 h);濕籠飼養(yǎng)(24 h);超聲刺激(2 h);強迫游泳(45 ℃,5 min)。每天隨機選取上述九種刺激中的一種,刺激項目相鄰的兩天不重復,讓動物無法預料刺激的發(fā)生,應激處理方法在每日上午8:30開始更換,連續(xù)刺激21 d,每種刺激方法平均使用2～3次。第22天,所有造模大鼠繼續(xù)夾尾刺激以防止大鼠自愈,在此基礎上治療組分別每天灌胃相應劑量的治療藥物及正常飲食飲水,模型組正常飲食飲水并灌胃蒸餾水。連續(xù)灌胃14 d。根據(jù)大鼠一般狀態(tài)、體重、胃排空率、小腸推進運動率及HE染色排除器質性病變判斷造模是否成功[12]。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 一般狀態(tài)觀察:每日觀察大鼠的皮毛色澤、精神狀態(tài)、活動度、糞便性狀等全身情況并測量體重。

1.5.2 胃排空率及小腸推進率的測定:提前準備好半固體制劑[13],末次給藥后禁食不禁水24 h,用半固體制劑灌胃0.5 h后用3% 戊巴比妥鈉5 ml/kg腹腔注射進行麻醉,麻醉完成后剖取全胃擦干后記錄重量,然后稱取胃內容物重量和胃凈重;剖取小腸后鋪于白紙,測量幽門至回盲腸部的長度(C)和幽門至半固體制劑的長度(L)胃排空率=[1-(胃總重-胃凈重)/所給半固體制劑總重]×100%;腸推進率=L/C×100%。

1.5.3 實驗動物取材與HE染色:麻醉后剖開大鼠胸腔,于腹主動脈取血5 ml,將全血標本置于室溫靜置2 h 后于4 ℃ 3000 r/min離心15 min,吸取上清,于-80 ℃條件下保存。隨后冰盒上迅速取下大鼠的十二指腸組織,PBS漂洗后一部分置于4%多聚甲醛中固定,一部分置于液氮中速凍5 min,隨后于-80 ℃冰箱中保存。將4%多聚甲醛固定的十二指腸組織用于HE染色。

1.5.4 RT-PCR檢測Tryptase mRNA表達:為了檢測Tryptase mRNA在組織中的表達水平,取適量組織至1.5 ml離心管中,采用Trizol提取細胞總RNA。使用逆轉錄試劑盒合成產(chǎn)物cDNA。然后對RNA進行相對測定,循環(huán)數(shù)和溫度按試劑盒說明書設置,引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.5.5 ELISA法檢測血清IL-1β及TNF-α含量:取出-80 ℃血清消融,采用ELISA法檢測大鼠血清中IL-1β及TNF-α的水平,具體步驟按照ELISA試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài) 空白組大鼠皮毛潤澤,精神狀態(tài)良好,飲食飲水量正常,大便成形;模型組大鼠皮毛枯黃,性情暴躁而喜聚集于籠邊,飲食飲水量減少,大便稀溏;治療組大鼠較模型組大鼠溫順,皮毛順澤,飲食飲水量增加,大便成形。

2.2 各組大鼠灌胃第14天體重比較 見表2。灌胃結束后,與空白組比較,模型組大鼠體重明顯減輕(P<0.01);與模型組比較,各治療組大鼠體重明顯增加(P<0.01),其中四磨湯中劑量組與西藥組體重增加明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠灌胃第14天體重比較(g)

2.3 各組大鼠胃排空率與小腸推進率比較 見表3。與空白組比較,模型組大鼠胃排空率與小腸推進率均明顯降低(P<0.01);與模型組比較,除四磨湯低劑量組外,各治療組大鼠的胃排空率與小腸推進率均顯著上升(P<0.05)。

2.4 各組大鼠HE染色結果 HE染色觀察各組大鼠十二指腸組織形態(tài)。結果顯示,對照組細胞排列整齊,組織平整。與對照組比較,模型組大鼠十二指腸組織可見大量的腸絨毛上皮細胞脫落,固有層裸露,腸絨毛上皮細胞與固有層分離,腸絨毛形態(tài)不規(guī)則,腸絨毛上皮細胞未見明顯的變性,固有層中腸腺數(shù)量豐富,排列整齊緊密,黏膜下層內結締組織細密。各治療組腸絨毛上皮細胞脫落及其與固有層分離現(xiàn)象均明顯減少,腸絨毛形態(tài)規(guī)則,腸絨毛上皮細胞亦未見明顯的變性,固有層中腸腺數(shù)量豐富,排列整齊緊密,黏膜下層內結締組織細密(圖1)。

圖1 各組大鼠十二指腸黏膜組織病理學表現(xiàn)(HE染色,×100)

2.5 各組大鼠十二指腸Tryptase mRNA表達比較 見表4。RT-PCR法檢測各組大鼠十二指腸Tryptase mRNA,與空白組相比,模型組大鼠十二指腸Tryptase基因的表達明顯增加(P<0.01);與模型組相比,各治療組大鼠十二指腸Tryptase基因的表達顯著下降(P<0.01);且四磨湯中劑量組較四磨湯高劑量組Tryptase基因表達下降更為顯著(P<0.01),說明四磨湯對Tryptase mRNA水平的調節(jié)作用的量效關系以中劑量最佳。

表4 各組大鼠十二指腸Tryptase mRNA表達比較

2.6 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比較 見表5。ELISA法檢測各組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量,與空白組相比,模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯增加(P<0.01);與模型組比較,各治療組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯下降(P<0.01)。

表5 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比較(pg/ml)

3 討 論

十二指腸低度炎癥是研究FD病理生理機制的一個新方向,而嗜酸性粒細胞以及MC等免疫細胞等的局部聚集及有關活性物質的釋放是造成炎癥的主要原因之一[14-16]。多項研究表明,FD患者中確實存在MC異常激活所造成的十二指腸低度炎癥,其脫顆粒釋放的一系列活性產(chǎn)物如TNF-α、白細胞介素、組胺、5-HT、Tryptase、白三烯、前列腺素等可以造成胃腸運動障礙,從而產(chǎn)生FD癥狀[14-17]。西藥治療FD多采用促動力藥、質子泵抑制劑以及抗抑郁藥等,治療效果有限且不良反應較多,如促動力藥導致的錐體外系反應、加重胃腸道出血等[18]。四磨湯由人參、烏藥、檳榔以及沉香四味中藥構成?，F(xiàn)代藥理學研究表明,四磨湯中的多味藥均有與抵抗炎癥相關的藥理作用,如人參中的主要成分人參皂苷與人參多糖具有抗炎、抗氧化、調節(jié)免疫等作用[19];烏藥中的主要成分烏藥烷型倍半萜二聚體和三聚體具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用[20];檳榔中的檳榔堿具有消炎鎮(zhèn)痛、促胃腸運動、抗氧化等作用[21]。本研究表明,四磨湯能降低肝脾氣滯證FD大鼠十二指腸肥大細胞脫顆粒所釋放的炎癥介質含量以降低十二指腸低度炎癥,與相關現(xiàn)代藥理學研究結果一致。MC廣泛分布于皮膚、消化道、呼吸道等部位,是人體重要的免疫細胞之一。胃腸道是人體最大的淋巴免疫器官,其免疫異常狀態(tài)可導致免疫應答持續(xù)激活,產(chǎn)生持續(xù)的炎癥[22]。MC的異常激活已被證實存在于FD患者的發(fā)病過程[17]。FD的一系列癥狀產(chǎn)生于持續(xù)的免疫激活與低度炎癥,而MC脫顆粒釋放的活性物質在此過程中可能發(fā)揮重要作用[14-16]。各種刺激因素激活MC后會使其脫顆粒釋放出多種活性物質,Tryptase、IL-1β以及TNF-α均為具有致炎作用的重要活性物質[23]。

Tryptase作為MC的標記性蛋白,特異性地主要儲存在于MC胞內,是MC脫顆粒釋放出的主要活性物質,是MC激活與脫顆粒的象征[24]。常雄飛等[25]發(fā)現(xiàn),健脾理氣方能夠抑制肥大細胞脫顆粒以降低Tryptase的表達、改善十二指腸緊密連接蛋白表達以治療FD。IL-1β、TNF-α均為炎性介質網(wǎng)絡的關鍵細胞因子,在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要致炎作用[26-28]。本研究表明,四磨湯能顯著減少肝脾氣滯證FD大鼠十二指腸MC脫顆粒,降低十二指腸組織Tryptase基因表達及血清IL-1β、TNF-α含量,以緩解十二指腸局部低度炎癥,改善FD癥狀。且四磨湯高劑量組對FD大鼠十二指腸組織Tryptase基因表達的抑制作用弱于四磨湯中劑量組,這說明四磨湯對肥大細胞脫顆粒的量效關系可能以中劑量最佳。

綜上所述,本研究從十二指腸低度炎癥出發(fā),探索了四磨湯治療FD的新方向,證明了四磨湯能降低肝脾氣滯證FD大鼠十二指腸低度炎癥及肥大細胞脫顆粒,以此改善模型大鼠FD癥狀。四磨湯的作用機制可能與四磨湯降低十二指腸低度炎癥以影響腸上皮、神經(jīng)、平滑肌等有關,但具體信號靶點及作用路徑有待進一步探究。