曾禹沙,李婧婧,許新意,薛雅紅

(1.南京中醫(yī)藥大學研究生院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院,江蘇 南京 210001)

慢性肛門直腸痛(Chronic anorectal pain,CAP)是非器質(zhì)性疾病引起的肛門或直腸部位墜脹疼痛、刺痛等不適,屬于功能性肛門直腸痛(Functional anorectal pain,FAP) 之一,根據(jù)羅馬Ⅳ標準可細分為肛提肌綜合征(Levalor ani syndrome,LAS) 和非特異性功能性肛門直腸痛(Unspecified functional anorectal pain,UFAP),臨床上患病率高達7.7%,以女性多見[1]。CAP為肛腸科難治性疾病,目前發(fā)病機制尚不明確,近期相關(guān)研究顯示可能與脊髓膠質(zhì)細胞、促炎因子有關(guān)[2-5],但尚缺乏有關(guān)證據(jù)。臨床發(fā)現(xiàn)CAP患者的疼痛可放射至陰道、骶尾部、會陰等區(qū)域,涉及整個骶神經(jīng)支配區(qū)[6],臨床可見頑固的CAP經(jīng)各種治療后疼痛仍持續(xù)存在或加重。推測引起慢性疼痛的原因很可能是支配肛門直腸的S2-4脊髓段繼發(fā)病變,引起持續(xù)性神經(jīng)牽涉痛。在治療方面,近年來針刺八髎穴的研究是重點關(guān)注領(lǐng)域,相關(guān)臨床研究已經(jīng)證實針刺八髎穴能明顯改善慢性肛門直腸痛的癥狀[7],但目前針刺八髎穴具體的治療機制仍需進一步探索[8]。慢性肛門直腸痛雖不會對患者生命造成威脅,但疾病導致的痛苦往往會引起一系列異常的精神心理表現(xiàn),Dong等[9]研究發(fā)現(xiàn)功能性肛門直腸痛患者普遍存在抑郁和焦慮癥狀,不僅損害患者健康,還嚴重影響患者生活質(zhì)量。

本實驗旨在通過建立CAP大鼠模型,觀察大鼠S2-3脊髓背角中膠質(zhì)細胞活化情況及電針八髎穴對其干預作用,探討脊髓膠質(zhì)細胞活化及相關(guān)炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)的表達是否引起CAP并參與電針鎮(zhèn)痛。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 18只6～7周齡SD大鼠,體重約200～225 g,購于杭州醫(yī)學院,飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學科學院動物中心[SYXK (浙) 2019-0011]。飼養(yǎng)期間各組大鼠正常飲水,喂養(yǎng)飼料。飼養(yǎng)中心的室溫保持在(21±0.5)℃,濕度保持在45%～50%,光照保持12 h明暗交替。所有動物實驗均得到了浙江百越生物技術(shù)有限公司實驗動物倫理委員會的許可(倫理編號:ZJBYLA-IACUC-20220110),實驗過程遵循了中國動物協(xié)會的指導方針。

1.2 實驗藥物與試劑 戊巴比妥鈉(P010,Merck,德國)、辣椒素(SC8100,Solarbio,中國)、蘇木-伊紅染液(G1031,Servicebio,中國)、4%多聚甲醛(E672002,Sangon,中國)、0.2%苦味酸的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4,PML4280,Coolaber,中國)、5%山羊血清(E510009,Sangon,中國)、抗-IL-1β抗體(E-EL-R0012c,Elabscience,中國)、抗-TNF-α抗體(E-EL-R2856c,Elabscience,中國)、抗-IL-6 抗體(E-EL-R0015c,Elabscience,中國)、抗-GFAP 抗體 (GFAP,1∶10;ab4648,Abcam,英國)、Triton X-100(A600198,Sangon,中國)、抗-OX42 抗體 (1∶1000,GTX76060,46 kDa)、山羊抗兔二抗(Alexa Fluor? 647,ab150083,Abcam,英國)。

1.3 實驗儀器 針灸針(0.35 mm×25 mm,華佗牌,中國)、電針儀(SDZ-Ⅱ,華佗牌,中國)、低溫切片機(KD-2850,KEHUAI,中國)、激光共聚焦顯微鏡(BX53M,Olympus,日本,×40)、熒光顯微鏡(Ⅸ73,Olympus,日本,×200)、電子Von Frey 測痛儀(IITC,美國)、酶標儀(VL0000D2,Thermo Fisher,美國)。

1.4 實驗方法 參考文獻進行造模[10],18只大鼠根據(jù)體重被隨機分為三組(n=6):正常組、模型組和電針組。具體操作方法為:使用戊巴比妥鈉(劑量:45 mg/kg)麻醉大鼠后,將凡士林涂抹在肛門周圍暴露的皮膚上,直徑為1.5 mm的圓頭細管通過肛門快速插入大鼠直腸,模型組及電針組注入0.5 ml辣椒素(濃度:10-4mmol/L),每間隔5 min注入1次,共注入4次,正常組注入等體積0.9%氯化鈉溶液。電針組在造模完成且大鼠清醒2 h后予以針刺八髎穴干預。正常組和模型組大鼠不針刺,但需要經(jīng)歷抓取、固定過程。

針刺干預方法:大鼠只有三對骶后孔,相當于人體次髎、中髎和下髎穴[11-12]。根據(jù)骨性標志定位大鼠骶后孔的位置:首先將大鼠放入限制籠內(nèi),提起大鼠的尾根部,大拇指和中指捏起大鼠尾根處反復上下提放鼠尾,食指感覺到的能活動的關(guān)節(jié)即為第1尾椎和骶骨結(jié)合處;第1尾椎的棘突較尖,骶骨的棘突較長,沿尖棘突順勢向上越過2個較長棘突即是第2、3骶骨的棘突間隙,在此棘突間隙正中偏上處旁開5～10 mm處取次髎穴和中髎穴;第3、4骶骨棘突間隙正中偏上旁開5～10 mm處取下髎穴。針刺部位用碘伏消毒后,采用自制大鼠針刺固定器在其清醒狀態(tài)下進行針刺。采用華佗牌0.35 mm×25 mm針灸針直刺,進針深度約為10～15 mm,雙側(cè)次、中髎和下髎穴接華佗牌電針儀SDZ-Ⅱ型的4個電極,刺激頻率為2/15 Hz,疏密波,電流強度以見大鼠大腿內(nèi)收內(nèi)旋為度,電針時間為30 min/次,1次/d,連續(xù)治療7 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 內(nèi)臟疼痛行為學記錄:觀察并記錄各組大鼠的內(nèi)臟痛相關(guān)行為的數(shù)目,如背部出現(xiàn)弓形、舔腹、伸展、收縮腹部等動作[10],4次辣椒素注入完成且刺激20 min 后,7次電針刺激完成20 min后測量。

1.5.2 機械刺激閾值測量:將大鼠置于底部有金屬絲網(wǎng)的透明有機玻璃盒中。使用電子Von Frey纖維系統(tǒng)研究大鼠尾部、后足底和腹部對機械刺激反應的變化[10]。Von Frey纖維刺激強度以2 g/s的恒定力(截止力50 g)升高。直到大鼠收回爪子、向后拱起或抬起尾巴,記錄為機械痛閾。分別在4次辣椒素注入完成且刺激1 h后、7次電針刺激完成1 h后測量。

1.5.3 蘇木素-伊紅(HE)染色:機械刺激結(jié)束后,戊巴比妥鈉(劑量45 mg/kg)麻醉大鼠,逐層開放胸腔,暴露心臟和血管,經(jīng)左心室插管至升主動脈,用0.9%氯化鈉溶液快速沖洗殘留血液后灌注含有4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的磷酸鹽緩沖液固定40 min。收集大鼠直腸組織和S2-3脊髓組織,浸入30%蔗糖溶液中。用低溫切片機將直腸組織制成30 μm的切片。使用蘇木素染液染色10 min,蒸餾水洗去浮色。分化液分化3 min,自來水沖洗兩次。將切片置于伊紅染液中1 min,蒸餾水稍洗2 s后快速脫水。封片后放在顯微鏡下觀察。

1.5.4 免疫熒光測定大鼠脊髓中標志物OX42和GFAP的熒光表達強度:將上述步驟所獲脊髓組織用OCT包埋并利用低溫切片機制成40 μm的冰凍切片。切片置于冷丙酮中固定15 min。將冰凍切片室溫充分晾干,浸于4%多聚甲醛溶液固定15 min。用PBS漂洗切片5 min后吸出PBS。加入0.1%Triton X-100通透15 min后吸出Triton X-100溶液,用PBS漂洗切片5 min。5%山羊血清對切片上組織進行封閉處理1 h。膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體(GFAP),稀釋比例1∶10,CD11b單克隆抗體(OX42),稀釋比例1∶100,孵育組織,4 ℃避光過夜。第2天用PBS漂洗組織3次,每次5 min。切片上加入山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h。用PBS漂洗組織3次,每次5 min。使用熒光顯微鏡觀察陽性熒光信號(紅色)。

1.5.5 ELISA吸附試驗檢測大鼠脊髓和血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量:用IL-1β試劑盒、TNF-α試劑盒和IL-6試劑盒檢測脊髓和血清,實驗操作均按照試劑盒說明書進行。IL-1β、TNF-α和IL-6抗體被包被在ELISA檢測板上,待測樣品和標準品加入檢測板并與抗體結(jié)合,隨后將生物素化抗體、辣根過氧化物酶標記的抗生物素蛋白、顯色底物和終止溶液依次加入反應板中。終止反應后使用酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度,并計算IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad 8.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以平均值±標準差表示,組間比較使用單因素方差分析;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的內(nèi)臟痛行為次數(shù)比較 與正常組(21.83±1.34)相比,模型組大鼠內(nèi)臟痛行為次數(shù)(39.83±1.77)明顯增加(P<0.01);與模型組相比,電針組大鼠的內(nèi)臟痛行為次數(shù)(30.33±0.94)減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 各組大鼠的機械疼痛閾值比較 見表1。與正常組相比,模型組大鼠尾部、后足底、腹部的機械痛閾值上升(P<0.01);與模型組相比,電針組大鼠尾部、后足底、腹部的機械痛閾值降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠尾部、后足底和腹部機械痛閾值

2.3 各組大鼠直腸黏膜下組織HE染色結(jié)果比較 HE染色結(jié)果顯示,正常組大鼠直腸黏膜下組織無水腫現(xiàn)象,模型組大鼠直腸黏膜下組織出現(xiàn)明顯的水腫病變,電針組大鼠直腸黏膜下組織水腫較模型組明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠直腸黏膜下組織病理學表現(xiàn)(HE染色,×40)

2.4 各組大鼠脊髓中小膠質(zhì)細胞標志物OX42和星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的表達程度比較 免疫熒光染色結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠脊髓中小膠質(zhì)細胞標志物OX42和星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的陽性表達顯著增加(P<0.01);與模型組相比,電針組大鼠脊髓中標志物OX42和GFAP的陽性表達降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2(圖2)。

2.5 各組大鼠脊髓及血清中IL-1β、TNF-α和IL-6水平比較 見表3、4。ELISA結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠脊髓和血清中IL-1β、TNF-α和IL-6水平上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,電針組大鼠脊髓及血清中IL-1β、TNF-α和IL-6水平下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6含量比較(pg/ml)

3 討 論

本研究采用辣椒素構(gòu)建CAP大鼠模型,與目前研究神經(jīng)病理性疼痛的其他模型如福爾馬林大鼠結(jié)腸炎模型[13]、球囊擴張IBS模型[14]、TNBS灌腸模型[15]等相比,直接通過圓頭塑料管注入大鼠直腸,不易引起大鼠軀體疼痛,操作簡單且具有良好可重復性;大鼠相關(guān)內(nèi)臟痛反應出現(xiàn)在刺激后20 min內(nèi),1 h后基本消失,反應呈單相,耗時短;本模型大鼠直腸黏膜下組織僅表現(xiàn)為明顯的水腫病變,無組織結(jié)構(gòu)的破壞,更符合神經(jīng)病理性疼痛的模型特點。

本研究中,測定機械痛閾的原理為測定大鼠在接受纖維絲刺激后產(chǎn)生縮腳或其他動作的反應時間,經(jīng)辣椒素刺激后,大鼠表現(xiàn)出明顯內(nèi)臟痛行為,大鼠后足底、腹部及尾部對機械痛閾上升。此時機械痛閾上升是因辣椒素刺激產(chǎn)生的內(nèi)臟疼痛遠比纖維絲劇烈,內(nèi)臟痛的神經(jīng)沖動傳導在向高級中樞傳入過程中抑制了機械刺激所引起的神經(jīng)沖動信號的傳導,此結(jié)果與部分研究結(jié)果相同[16]。電針治療后大鼠內(nèi)臟疼痛減輕,內(nèi)臟疼痛神經(jīng)沖動傳導中對機械疼痛神經(jīng)沖動信號傳導的抑制減弱,表現(xiàn)為機械疼痛敏感,機械痛閾值降低。

目前CAP發(fā)病機制尚不清,多認為是盆底肌過度活動影響中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳出信號增加和改變導致的一種神經(jīng)病理性疼痛[17]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn),此類疼痛是由神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及免疫炎癥因子和趨化因子共同作用的結(jié)果[18]。李立等[19]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠脊髓背角中 A1 型反應性星形膠質(zhì)細胞明顯增加。膠質(zhì)細胞激活及其產(chǎn)生的炎癥介質(zhì),使傷害性感覺神經(jīng)元敏感導致疼痛慢性化,其中小膠質(zhì)細胞參與了對行為和認知的有害后果[20]。本研究免疫熒光染色結(jié)果示CAP大鼠脊髓中小膠質(zhì)細胞特異性標志物OX42和星形膠質(zhì)細胞特異性標志物GFAP的陽性表達顯著增加,表明CAP模型大鼠存在脊髓膠質(zhì)細胞活化現(xiàn)象,可能引起神經(jīng)元敏感,導致慢性疼痛發(fā)生及維持,成為CAP發(fā)病機制之一。此外,神經(jīng)病理性疼痛可見促炎因子的產(chǎn)生[21]。促炎和抗炎細胞因子是強大的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑,作為介質(zhì)通過神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞相互作用,調(diào)節(jié)突觸傳遞和疼痛信號[22]。本研究中ELISA結(jié)果示CAP大鼠受辣椒素刺激后,脊髓及血清中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6釋放增加,可能參與調(diào)節(jié)突觸傳遞,促進大鼠內(nèi)臟疼痛神經(jīng)信號傳導,導致肛門直腸疼痛持續(xù)。

目前國際公認最佳的治療是生物反饋[23-24],采用溫水或中藥坐浴[25]、中藥熱奄包[26]、電刺激、針灸、SNS[27]、A型肉毒素注射[28]等有一定療效。針灸作為“簡、便、廉、效”的中醫(yī)特色療法,近年來在功能疾病治療方面受到關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)針刺可通過影響疼痛信號的外周傳入、脊髓內(nèi)傳導途徑及信號中樞的整合,調(diào)節(jié)體內(nèi)致痛與鎮(zhèn)痛物質(zhì)的分泌等達到鎮(zhèn)痛的效果[29]。電針可抑制大鼠膠質(zhì)細胞活化及中樞敏化,阻斷疼痛的信號傳導,減輕大鼠疼痛[30-31],臨床研究已證實了電針八髎穴能有效治療CAP[7]。

中醫(yī)學上CAP可歸為大腸疼痛、谷道痛、魄門痛等范疇,該病初起多因氣血虧虛,臟腑經(jīng)絡失于濡養(yǎng),不榮則痛;或久病虛實夾雜,氣血虧虛則推動無力,氣血瘀滯,不通則痛[32],故治療當以通絡止痛、補益氣血為主。臨床上可采用益氣補血方[33](黃芪、熟地黃、酒炒當歸、炒白芍、川芎、黨參、麩炒白術(shù)、茯苓、陳皮、槲寄生、蒸黃精、木香、生山楂、雞血藤、姜黃等)或益氣養(yǎng)血湯[34](炙黃芪、熟地黃、炒白術(shù)、白芍、升麻、柴胡、川芎、青皮、陳皮、當歸、地龍、巴戟天、炙甘草等)治療。其中多以黃芪、熟地補血養(yǎng)血;配以血中之氣藥川芎及活血之當歸、白芍;加之行氣健脾藥如陳皮、青皮、白術(shù)、黨參等,總體以補益氣血、行氣活血通絡之效為主。根據(jù)中醫(yī)“腧穴所在,主治所在”理論,八髎穴位于腰骶部,正對骶后孔,包括上、次、中、下髎穴,針刺有調(diào)節(jié)經(jīng)絡氣血,協(xié)調(diào)臟腑陰陽之效。解剖學上八髎穴位于髂后上棘與后正中線之間,正對S1-4骶后孔,深部為S1-4骶神經(jīng),而支配肛門直腸的神經(jīng)主要源于骶神經(jīng),故相比其他穴位,本實驗選取八髎穴,能有效治療肛門直腸痛。本研究結(jié)果顯示CAP大鼠在電針治療后內(nèi)臟疼痛行為減少,機械痛閾降低,ELISA試驗結(jié)果示CAP模型大鼠在電針治療后脊髓和血清中IL-1β、TNF-α和IL-6含量降低,表明電針可通過抑制其脊髓膠質(zhì)細胞的免疫因子激活,抑制痛覺敏化,從而達到緩解疼痛的效果。

本實驗結(jié)果表明,模型組大鼠出現(xiàn)明顯內(nèi)臟疼痛行為,機械痛閾升高,脊髓中小膠質(zhì)細胞標志物OX42和星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的陽性表達顯著增加,脊髓及血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平上升;而在電針治療后,CAP模型大鼠的內(nèi)臟疼痛次數(shù)減少,大鼠機械痛閾值降低,脊髓中OX42和GFAP的陽性表達降低,脊髓及血清IL-1β、TNF-α、IL-6、GAFP水平下降。綜上所述,大鼠脊髓膠質(zhì)細胞活化及促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6釋放與CAP發(fā)病相關(guān),電針可通過抑制CAP模型大鼠脊髓膠質(zhì)細胞活化及其免疫激活達到緩解CAP疼痛的效果。本研究結(jié)果部分闡釋了CAP的發(fā)病機制,為臨床針刺八髎穴治療CAP提供了理論依據(jù)。