卜小琨, 李京有, 程志華, 張鎖連

(煙臺業(yè)達醫(yī)院, 1. 心胸外科, 2. 病理科, 山東 煙臺, 264004)

肺腺癌是最常見的肺癌類型,占肺癌總數(shù)的40%～50%, 其多數(shù)起源于支氣管黏膜上皮,少數(shù)起源于大支氣管的黏液腺[1-2]。肺腺癌早期缺乏特異性表現(xiàn),部分患者可出現(xiàn)咳嗽、痰中帶血、喘鳴、咯血等癥狀,而部分患者可無明顯癥狀,從而延誤診治,嚴重影響預(yù)后[3]。因此,尋找與早期肺腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的指標,對早期肺腺癌病情及預(yù)后判斷具有重大意義,或可為臨床治療提供新靶點。人天冬氨酸β-羥化酶(ASPH)是一種廣泛表達的Ⅱ型膜蛋白,研究[4]顯示ASPH可在腫瘤組織中呈陽性表達。CD44V6是CD44跨膜蛋白分子的變異體,屬于細胞黏附分子,可影響癌細胞的黏附能力,從而調(diào)控癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[5]。本研究觀察早期肺腺癌組織中ASPH、CD44V6的表達情況,分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取煙臺業(yè)達醫(yī)院2016年10月—2022年6月收治的肺癌患者為研究對象,本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準: ① 符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)》[6]中相關(guān)診斷標準者; ② 經(jīng)病理學檢查確定病理類型為腺癌者; ③ 根據(jù)第8版美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)癌癥分期手冊pTNM分期為ⅠA期、ⅠB期且具備手術(shù)指征的肺腺癌患者(ⅠA期: 腫瘤最大徑≤3 cm, 無區(qū)域淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移; ⅠB期: 腫瘤最大徑>3～5 cm,無區(qū)域淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移); ④ 初診初治者; ⑤ 患者及家屬均知情本研究內(nèi)容; ⑥ 有完整臨床資料和隨訪資料者。排除標準: ① 合并其他惡性腫瘤者; ② 合并血液系統(tǒng)疾病者; ③ 非原發(fā)性肺癌者; ④ 術(shù)前曾行新輔助化療、放療或靶向藥物治療者; ⑤ 合并肝腎功能不全者; ⑥ 合并嚴重感染者。本研究共納入120例早期肺腺癌患者,其中男50例,女70例; 年齡48～80歲,平均(62.11±8.32)歲; 臨床分期為ⅠA期59例, ⅠB期61例。根據(jù)組織分化程度另配對30例患者,男14例,女16例; 年齡49～75歲,平均(60.53±5.61)歲。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集方法: 設(shè)計基線資料調(diào)查表,對所有早期肺腺癌患者基線資料進行詳細調(diào)查并統(tǒng)計,包括性別(男、女),年齡(<60歲、≥60歲),臨床分期(ⅠA期、ⅠB期),分化程度(中高分化、低分化),既往吸煙史(有、無),腫瘤家族病史(有、無),體質(zhì)量指數(shù)(<24 kg/m2、≥24 kg/m2), 腫瘤部位(左葉、右葉),疾病類型(浸潤性、微浸潤性、原位)。

1.2.2 ASPH、CD44V6檢測方法: 所有組織標本均使用全自動免疫組織化學染色系統(tǒng)(Roche Benchmark GX)進行檢測,采用Multimer Detection法進行免疫組織化學染色。所有標本均使用福爾馬林液進行固定,石蠟包埋,將4 μm厚石蠟切片脫蠟; 使用EDTA進行抗原修復(fù),高溫5 min, 低溫15 min; 使用阻斷劑(Dako公司)孵育10 min; ASPH兔抗人單克隆抗體(工作液濃度1∶500, Abcam公司), CD44V6即用型鼠抗人單克隆抗體(Abcam公司),滴加二抗孵育30 min; 現(xiàn)用現(xiàn)配免疫顯色試劑(Dako公司)進行顯色; 復(fù)染判讀結(jié)果。

1.2.3 免疫組織化學結(jié)果判定: 由2名經(jīng)驗超過5年的病理科醫(yī)師采用雙盲法對全部病理切片進行閱片,在顯微鏡下觀察組織染色情況。判定ASPH陽性表達為定位于細胞質(zhì),顏色為棕黃色; 判定CD44V6陽性表達為定位于細胞膜,部分在細胞質(zhì),顏色為棕黃色。見圖1。

A: ASPH陽性表達; B: CD44V6陽性表達。圖1 肺腺癌組織中ASPH、CD44V6陽性表達(放大400倍)

1.2.4 隨訪: 所有患者于出院后完成3年隨訪,隨訪方式為電話或門診復(fù)查,每3個月1次。監(jiān)測并統(tǒng)計隨訪期間120例早期肺腺癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及病死情況,出現(xiàn)上述情況為預(yù)后不良,未出現(xiàn)則為預(yù)后良好。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 癌組織與癌旁組織中ASPH、CD44V6表達情況

癌組織中ASPH、CD44V6陽性率均高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織與癌旁組織中ASPH、CD44V6表達情況[n(%)]

2.2 癌組織中ASPH表達與臨床特征關(guān)系

臨床分期為ⅠB期、分化程度為低分化的患者的癌組織中ASPH陽性表達率高于臨床分期為ⅠA期、分化程度為中高分化的患者的癌組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 不同性別、年齡、既往吸煙史、腫瘤家族史、體質(zhì)量指數(shù)、腫瘤部位、疾病類型的患者的癌組織中ASPH陽性表達率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 早期肺腺癌患者癌組織中ASPH表達與臨床特征關(guān)系[n(%)]

2.3 癌組織中CD44V6表達與臨床特征關(guān)系

年齡≥60歲、臨床分期為ⅠB期、分化程度為低分化的早期肺腺癌患者的癌組織中CD44V6陽性表達率高于年齡<60歲、臨床分期為ⅠA期、分化程度為中高分化的患者的癌組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 不同性別、既往吸煙史、腫瘤家族史、體質(zhì)量指數(shù)、腫瘤部位、疾病類型的患者的組織中CD44V6陽性表達率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 早期肺腺癌患者組織中CD44V6表達與臨床特征關(guān)系[n(%)]

2.4 臨床分期、分化程度與ASPH表達的相關(guān)性

經(jīng)Somers′d檢驗結(jié)果顯示,臨床分期、分化程度與ASPH表達呈正相關(guān)(d=0.281、0.194,P=0.002、0.037)。

2.5 年齡、臨床分期、分化程度與CD44V6表達的相關(guān)性

經(jīng)Somers′d檢驗結(jié)果顯示,年齡、臨床分期、分化程度與CD44V6表達呈正相關(guān)(d=0.207、0.211、0.263,P=0.036、0.022、0.004)。

2.6 ASPH與CD44V6表達在早期肺腺癌中的相關(guān)性

經(jīng)卡方檢驗Phi系數(shù)顯示, ASPH與CD44V6表達在早期肺腺癌中呈正相關(guān)(Phi=0.906,P<0.05)。

2.7 癌組織中ASPH、CD44V6表達情況與早期肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

120例早期肺腺癌患者3年內(nèi)預(yù)后不良25例,占比20.83%。將ASPH與CD44V6表達情況作為自變量(ASPH表達: 1=陽性, 0=陰性; CD44V6表達: 1=陽性, 0=陰性),將早期肺腺癌患者預(yù)后情況作為因變量(1=預(yù)后不良, 0=預(yù)后良好)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示, ASPH與CD44V6陽性表達是早期肺腺癌患者預(yù)后不良的危險因素(OR>1,P<0.05)。見表4。

表4 Logistic回歸分析結(jié)果

2.8 癌組織中ASPH、CD44V6表達情況對早期肺腺癌患者預(yù)后的預(yù)測價值

將早期肺腺癌患者預(yù)后情況作為狀態(tài)變量(1=預(yù)后不良, 0=預(yù)后良好),將ASPH、CD44V6表達情況作為檢驗變量; 繪制ROC曲線,結(jié)果顯示, ASPH、CD44V6表達預(yù)測早期肺腺癌患者預(yù)后的敏感度分別為0.960、0.920, 特異度分別為0.284、0.242。見圖2。

圖2 ASPH、CD44V6表達預(yù)測早期肺腺癌患者預(yù)后的ROC曲線圖

3 討 論

近年來,肺腺癌的發(fā)病年齡有年輕化的趨勢,提高診療效果、延長患者生命及提高生活質(zhì)量一直是臨床治療肺癌的目標[7]。然而,多數(shù)患者確診時已處于中晚期,給臨床治療增加難度,且影響患者預(yù)后情況[8-9]。因此,尋找與早期肺腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的指標意義重大。張繼宗等[10]研究發(fā)現(xiàn), ASPH的表達與腫瘤組織密切相關(guān),且可影響患者預(yù)后情況。CD44V6是機體組織中的一種分化抗原誘導(dǎo)因子,是含變異性外顯子v6編碼序列的CD44分子。張中超等[11]研究指出,組織中CD44V6的表達與癌癥患者臨床病理特征有關(guān)。由此推測ASPH、CD44V6表達可能與早期肺腺癌有關(guān),或可作為臨床評估患者預(yù)后及指導(dǎo)治療方案的有效腫瘤標志物。

本研究結(jié)果顯示,癌組織中ASPH陽性率高于癌旁組織,且與早期肺腺癌患者臨床分期及組織分化程度有關(guān),表明ASPH與早期肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展具有關(guān)系。分析原因為: ASPH是一種高度保守的脫氧酶,其依賴于三羧酸循環(huán)的產(chǎn)物α-酮戊二酸,可在二價鐵存在的條件下羥化多種蛋白質(zhì),也可使表皮細胞生長因子上的天冬氨酸或天冬酰胺殘基發(fā)生羥基化。表皮細胞生長因子與細胞表面的表皮生長因子受體結(jié)合,可啟動細胞核內(nèi)的有關(guān)基因,從而促進細胞分裂增殖,在腫瘤細胞生長、分化及運動中發(fā)揮重要作用。朱良炎等[12]研究結(jié)果顯示, ASPH在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率為68.90%, 癌旁組織陽性表達率為20.00%, 本研究結(jié)果與其結(jié)果一致,進一步證實了ASPH表達與早期肺腺癌的關(guān)系。有研究[13]表明, ASPH表達水平與Notch信號通路的激活密切相關(guān), ⅠB期及低分化肺腺癌患者惡性程度更高,體內(nèi)Notch受體和配體表達水平更高,高度表達的Notch受體和配體刺激Notch信號傳導(dǎo)通路,從而促使ASPH大量表達。

目前已有研究[14-15]報道, CD44與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系,陽性表達者較易發(fā)生脈管浸潤和遠處轉(zhuǎn)移,且生存率低,預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示,癌組織中CD44V6陽性率均高于癌旁組織,且與早期肺腺癌患者年齡、臨床分期及組織分化程度有關(guān),這表明CD44V6的表達與早期肺腺癌的發(fā)生有關(guān),且在臨床進展及癌細胞增殖分化中起到重要作用。分析原因為: CD44V6是CD44的一種變異體,在多種細胞和組織表面廣泛表達,可參與腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質(zhì)的黏附,可通過與細胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸、膠原蛋白、血管內(nèi)皮細胞等的黏附作用,賦予腫瘤細胞很強的生長及轉(zhuǎn)移能力,從而促進腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[16]。因此, CD44V6可參與早期肺腺癌的發(fā)生。此外, CD44V6的上調(diào)可增強透明質(zhì)酸合成酶基因的表達,從而促進透明質(zhì)酸的合成,與透明質(zhì)酸結(jié)合的CD44V6可促進PI3K/Akt信號通路,增加細胞凋亡,進而調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17]。由此可見, CD44V6對疾病進展及癌細胞的分化能力具有調(diào)控作用,且CD44V6的表達情況可能與患者病情有關(guān)。老年人群因為體內(nèi)T淋巴細胞減少,機體免疫力下降,對于癌細胞的清除能力大大降低,更應(yīng)該密切關(guān)注CD44V6表達情況。

本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), ASPH與CD44V6表達具有相關(guān)性,表明ASPH與CD44V6在早期肺腺癌中起到了協(xié)同作用。分析原因為: ASPH可對細胞外黏附分子進行羥基化修飾,促使CD44V6的黏附作用增強,從而共同促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)ASPH與CD44V6陽性表達是早期肺腺癌患者預(yù)后不良的危險因素,具有一定的預(yù)測價值,提示早期肺腺癌組織中ASPH與CD44V6陽性表達可能對預(yù)后評估具有一定的意義。本研究不足之處為: 研究檢測的是癌組織中ASPH和CD44V6的表達情況,并未驗證其是否與患者血液中ASPH和CD44V6的表達有關(guān),后續(xù)會擴大樣本量,增加血液中ASPH和CD44V6的檢測以進行深入研究,以驗證聯(lián)合檢測對于疾病評估和預(yù)后判斷的價值。

綜上所述,早期肺腺癌組織中ASPH和CD44V6陽性表達率較高,且年齡、臨床分期、分化程度與CD44V6陽性表達有關(guān),臨床分期、分化程度與ASPH陽性表達有關(guān)。ASPH和CD44V6或可作為判斷早期肺腺癌病情發(fā)展的潛在標志物。