劉超柱, 胡偉林

(1. 武漢科技大學(xué)附屬武昌醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 湖北 武漢, 430000;2. 武漢科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 湖北 武漢, 430000)

肺癌是威脅人類生命安全的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率與致死率均增長(zhǎng)較快。目前,肺癌的聯(lián)合治療技術(shù)已取得巨大進(jìn)步,但患者預(yù)后仍很差, 5年生存率較低[1-2]。中醫(yī)藥是肺癌患者良好的輔助治療藥物,治療效果良好,且毒性較小[3-4]。左旋含羞草堿是從含羞草中提取的一種植物氨基酸,可抑制咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)[5]。然而,左旋含羞草堿能否調(diào)控肺癌的發(fā)生與發(fā)展尚未明確。微小RNA(miRNA)約有22個(gè)核苷酸,主要通過對(duì)靶基因的翻譯抑制及mRNA降解參與疾病的進(jìn)展過程。研究[6]表明,微小RNA-1301-3p(miR-1301-3p)在肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)增加,下調(diào)miR-1301-3p能夠抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移。本研究探討左旋含羞草堿對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、人肺癌細(xì)胞A549均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC); DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液、多聚甲醛、結(jié)晶紫、噻唑藍(lán)(MTT)均由上海碧云天生物提供; Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)、細(xì)胞裂解液、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑、96孔反轉(zhuǎn)錄儀器和96孔qRT-PCR儀器購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司; 寡聚核苷酸包括anti-miR-NC、miR-1301-3p抑制劑、miR-NC、miR-1301-3p模擬物均由廣州銳博生物合成; Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司; Transwell試驗(yàn)所用的小室以及Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司; 一抗抗體和二抗抗體由美國(guó)Santa Cruz公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組: 將A549細(xì)胞以4 000個(gè)/孔的密度培養(yǎng)于直徑9.6 cm的有蓋培養(yǎng)皿,隨后向孔中加入含不同濃度(100、200、400 μmol/L)左旋含羞草堿的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[7], 分別記為左旋含羞草堿低劑量組、左旋含羞草堿中劑量組、左旋含羞草堿高劑量組,另將正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞記為對(duì)照組。為探討miR-1301-3p對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-1301-3p抑制劑及其對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的A549細(xì)胞,分別記為anti-miR-1301-3p組、anti-miR-NC組。為驗(yàn)證左旋含羞草堿是否可通過調(diào)控miR-1301-3p表達(dá)而影響肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為,本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-1301-3p模擬物及其對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后將400 μmol/L左旋含羞草堿添加到每組并培養(yǎng)24 h, 分別記為左旋含羞草堿+miR-1301-3p組、左旋含羞草堿+miR-NC組。

1.2.2 MTT試驗(yàn): 一系列處理后,收集各組A549細(xì)胞以2 000個(gè)/孔的密度培養(yǎng)于96孔板。根據(jù)MTT試劑盒的說明書,向培養(yǎng)皿每孔中加入5 mg/mL MTT試劑20 μL, 并在培養(yǎng)箱中孵育4 h。向每孔加入150 μL 二甲基亞砜,以溶解細(xì)胞中的甲瓚。隨后,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在490 nm處的吸光度(A)值。最后,根據(jù)所測(cè)A值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,公式為(對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn): 不同處理后,收集各組A549細(xì)胞以200個(gè)/孔的密度培養(yǎng)于12孔板,于5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d, 培養(yǎng)期間每3 d更換1次DMEM培養(yǎng)基。各組A549細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗之后,每孔加入多聚甲醛和1%結(jié)晶紫。觀察細(xì)胞集落形成情況,計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù),單個(gè)集落的判斷標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞團(tuán)直徑大于1 mm, 當(dāng)集落之間出現(xiàn)相互融合時(shí)結(jié)束計(jì)數(shù)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn): 鋪板之前先用馬克筆在6孔板背面筆直地畫3條橫線作為標(biāo)記,經(jīng)不同處理后,收集各組A549細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度培養(yǎng)于6孔板,放置于5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿。用20 μL槍頭垂直于孔板背面的橫線畫1條筆直的道痕,以磷酸鹽緩沖液洗滌,將此時(shí)作為起始時(shí)刻,拍照后將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后拍照。應(yīng)用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率,公式為(劃痕起始寬度-劃痕端點(diǎn)寬度)/劃痕起始寬度×100%。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力: 于Transwell小室提前鋪上Matrigel基質(zhì)膠。不同處理后,收集各組細(xì)胞并以1×105個(gè)/孔的密度鋪在小室的上室,培養(yǎng)48 h,同時(shí)在下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液作為化學(xué)引誘物。用磷酸鹽緩沖液洗滌后,向每孔中加入多聚甲醛和1%結(jié)晶紫,最后于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 qRT-PCR: 依據(jù)Trizol試劑說明書提取細(xì)胞RNA,使用微量核酸蛋白分析儀分析RNA濃度,以A260 nm與A280 nm比值(A260/A280)分析RNA純度,RNA完整性通過將RNA樣品在2%瓊脂糖凝膠中電泳進(jìn)行分析, miRNA反轉(zhuǎn)錄盒子用于RNA反轉(zhuǎn)錄。將SYBR Green試劑10 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、模板2 μL、雙蒸水6.8 μL混合后,按照95 ℃預(yù)變性2 min, 95 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)條件,在儀器上進(jìn)行qRT-PCR。以U6為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算miR-1301-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot): 依據(jù)RIPA裂解液說明書提取細(xì)胞蛋白,將部分蛋白樣品與上樣緩沖液混合均勻以100 ℃水煮12 min。使用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)分析剩余一部分蛋白樣品濃度。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度計(jì)算40 μg蛋白所需體積,隨后按照40 μg蛋白的量對(duì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 5%脫脂牛奶封閉膜2 h, 分別加入E-cadherin(1∶800)、N-cadherin(1∶800)和GAPDH(1∶2 000)一抗抗體稀釋液,再加入二抗稀釋液(1∶3 000), 滴加eyoECL Plus, 暗室內(nèi)曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較,左旋含羞草堿低劑量組、中劑量組、高劑量組的肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率均升高,細(xì)胞克隆形成數(shù)均減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 不同劑量左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞克隆能力的影響

表1 不同劑量左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

2.2 左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響

與對(duì)照組比較,左旋含羞草堿低劑量組、中劑量組、高劑量組的肺癌A549細(xì)胞的劃痕愈合率、N-cadherin蛋白水平和侵襲細(xì)胞數(shù)均降低, E-cadherin蛋白水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 不同劑量左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 不同劑量左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

2.3 miR-1301-3p在BEAS-2B細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)

A549細(xì)胞的miR-1301-3p表達(dá)量為(3.59±0.28), 高于BEAS-2B細(xì)胞的(1.00±0), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞miR-1301-3p表達(dá)的影響

左旋含羞草堿低劑量組、左旋含羞草堿中劑量組、左旋含羞草堿高劑量組的miR-1301-3p表達(dá)量均高于對(duì)照組,且劑量越高, miR-1301-3p表達(dá)量越低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表3。

表3 不同劑量左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞miR-1301-3p表達(dá)的影響

2.5 下調(diào)miR-1301-3p對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

與anti-miR-NC組比較, anti-miR-1301-3p組的細(xì)胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達(dá)升高, miR-1301-3p表達(dá)、細(xì)胞克隆形成數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率和N-cadherin蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖3、表4。

圖3 干擾miR-1301-3p表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 干擾miR-1301-3p對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.6 miR-1301-3p過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)左旋含羞草堿(400 μmol/L)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用

與左旋含羞草堿+miR-NC組相比,左旋含羞草堿+miR-1301-3p組的細(xì)胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達(dá)降低, miR-1301-3p表達(dá)、細(xì)胞克隆形成數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率和N-cadherin蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖4、表5。

圖4 miR-1301-3p過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

表5 miR-1301-3p過表達(dá)逆轉(zhuǎn)左旋含羞草堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞的調(diào)控作用

3 討 論

中醫(yī)藥具有抗炎、抗氧化應(yīng)激與抗腫瘤等功效,可用于減緩肺癌發(fā)展進(jìn)程,其作用機(jī)制與調(diào)控與左旋含羞草堿+miR-NC組比較, *P<0.05。

多種基因或多條信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)[8]。miRNA可通過靶向結(jié)合靶基因而抑制其表達(dá)或翻譯,進(jìn)而調(diào)控肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為,相關(guān)研究[9-10]已證實(shí)miRNA具有作為肺癌診斷及預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物的潛力。

左旋含羞草堿可抑制人頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。研究[12]報(bào)道,左旋含羞草堿可通過介導(dǎo)caspase-9表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。目前,左旋含羞草堿與肺癌相關(guān)性的研究尚極少見,本研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿可抑制肺癌細(xì)胞增殖。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一種有助于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的進(jìn)程,在此轉(zhuǎn)化過程中,癌細(xì)胞能同時(shí)具有間質(zhì)性和上皮性特征,另外還涉及N-cadherin表達(dá)上調(diào)和E-cadherin下調(diào)[13-14]。本研究結(jié)果顯示,左旋含羞草堿能夠降低肺癌細(xì)胞中N-cadherin蛋白水平和細(xì)胞侵襲能力,并增加E-cadherin表達(dá),表明左旋含羞草堿能夠抑制肺癌細(xì)胞遷移及侵襲,這可能與其能抑制EMT有關(guān)。

研究[15]顯示, miR-1301-3p能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和克隆形成。miR-1301-3p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平升高,并可通過靶向調(diào)控Thy-1表達(dá)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌發(fā)展,或可作為評(píng)估患者預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[16]。本研究結(jié)果顯示,肺癌細(xì)胞中miR-1301-3p表達(dá)量升高,而左旋含羞草堿可抑制肺癌細(xì)胞中的miR-1301-3p表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-1301-3p能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,而miR-1301-3p過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)左旋含羞草堿對(duì)肺癌細(xì)胞惡性表型的抑制作用。由此提示,左旋含羞草堿可通過下調(diào)miR-1301-3p表達(dá)而抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述,左旋含羞草堿通過下調(diào)miR-1301-3p表達(dá)而抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力,或可成為治療肺癌的新型藥物。但本研究未探討miR-1301-3p調(diào)控肺癌進(jìn)程的具體機(jī)制,未來還需進(jìn)一步深入研究。