高 莉, 李曉明 , 楊 波, 秦 英, 程 冬, 鄭麗飛, 李 里

(1. 四川省雅安市人民醫(yī)院 血液內(nèi)科, 四川 雅安, 625000;2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科, 四川 瀘州, 646000;3. 四川省攀枝花市中心醫(yī)院 藥學(xué)部, 四川 攀枝花, 617067)

急性髓系白血病(AML)是最常見的急性白血病,其主要特征是髓系細(xì)胞的異常增殖和分化, AML患者的5年生存率較低。因此,尋找可用于AML診斷和預(yù)后的新型生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn),仍是目前需要解決的問題。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)參與多種生理過程,如細(xì)胞的增殖、凋亡和分化、造血、血管生成和病毒感染等[1]。LncRNA可在多種惡性腫瘤的發(fā)生中扮演癌基因或抑癌因子角色,且許多LncRNA與腫瘤的耐藥性高度相關(guān)。LncRNA的異常表達(dá)也可中斷機(jī)體的正常造血,從而導(dǎo)致包括AML在內(nèi)的血液惡性腫瘤發(fā)生[2]。因此,探討LncRNA在AML中的作用將有助于AML的早期診斷,改善患者的臨床預(yù)后,并且為該病的治療提供新思路和方案。

組蛋白的甲基化是一種強(qiáng)大的表觀遺傳標(biāo)記,可修飾組蛋白N末端的賴氨酸和精氨酸殘基。組蛋白甲基化的建立和維持受位點(diǎn)特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)和組蛋白去甲基化酶(HDMs)的動(dòng)態(tài)調(diào)控。組蛋白賴氨酸的甲基化在包括異染色質(zhì)形成、轉(zhuǎn)錄沉默和轉(zhuǎn)錄激活、DNA重組和DNA修復(fù)在內(nèi)的多種生物學(xué)功能中具有重要作用[3]。H3K4me3是一個(gè)最常見的組蛋白甲基化信號(hào),并主要被賴氨酸特異性去甲基化酶5(KDM5)家族蛋白去除,包括KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D。其中KDM5A和KDM5B被報(bào)道[4]在多種癌癥中上調(diào)。LncRNA TRIM52-AS1已被確定在腎癌細(xì)胞中有著調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的作用。但TRIM52-AS1在AML中的確切作用和調(diào)控機(jī)制仍不明確[5-6]。本研究鑒定了組蛋白去甲基化酶KDM5A通過LncRNA TRIM52-AS1在AML細(xì)胞HL-60中,調(diào)控HL-60增殖和遷移。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集四川省雅安市人民醫(yī)院26例AML患者(AML組)及同期健康體檢者26例(正常組)作為研究對(duì)象。本研究經(jīng)四川省雅安市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意,所有納入個(gè)體均簽署書面知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

本研究中使用的ARH-77、HL-60、K-562和KG-1細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心, ARH-77細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco), HL-60、K-562和KG-1細(xì)胞均使用IMDM培養(yǎng)基(Sigma)。培養(yǎng)基中均需加入10%胎牛血清(Excell), 置于37 ℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。采用下文“1.3”及“1.4”中實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)上述4種細(xì)胞系的KDM5AmRNA與其蛋白表達(dá)以及TRIM52-AS1 mRNA表達(dá),篩選KDM5AmRNA與其蛋白表達(dá)較高及TRIM52-AS1 mRNA表達(dá)表達(dá)較低的細(xì)胞系進(jìn)行下一步研究。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen), 操作方法參照該產(chǎn)品說明。按照5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種到12孔板中,待細(xì)胞完全貼壁且達(dá)到約60%匯合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(NC組)、敲低對(duì)照組(sh-NC組)、敲低KDM5A組(sh-KDM5A組)、過表達(dá)對(duì)照組(OE-NC組)、TRIM52-AS1過表達(dá)組(OE-TRIM52-AS1組)、敲低KDM5A+過表達(dá)TRIM52-AS1組(sh-KDM5A+ OE-TRIM52-AS1組)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)

血清或細(xì)胞總RNA提取使用Tiangen公司試劑盒,抽提步驟參照試劑盒說明書。使用Thermo Fisher的Nanodrop 2000機(jī)器對(duì)抽提所得總RNA進(jìn)行質(zhì)檢并測(cè)量RNA的濃度。隨后將1 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 使用Promega的MMLV試劑盒。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序參考Promega的產(chǎn)品說明。使用無(wú)RNase水(GE Healthcare)將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋10倍,并作為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),qRT-PCR實(shí)驗(yàn)使用Bio-rad的SYBR Green熒光定量試劑盒,擴(kuò)增條件為: 50 ℃ 2 min, 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40個(gè)循環(huán)。KDM5A上游引物序列: 5′-TTACCAACAGGTCAGACGCAT; 下游引物: 5′-GGTTTGCTACATTCCTCGGCG。TRIM52-AS1上游引物序列: 5′-GGTCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA; 下游引物序列: 5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)

使用RIPA裂解液(Beyotine)處理細(xì)胞, 4 ℃孵育30 min, 收集細(xì)胞裂解液至1.5 mL的EP管中, 12 000 g 4 ℃離心15 min, 收集上清。向細(xì)胞裂解液中加入蛋白loading buffer煮沸5 min, 通過10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE, 0.3 A、20 V)將20 mg的蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore)上。5%脫脂奶粉(BD)封閉1 h, 分別加入TBST(Coolaber)稀釋的KDM5A兔抗(Abcam, ab70892, 稀釋比例1∶1 000)和GAPDH兔抗(CST, 5174, 稀釋比例1∶3 000), 4 ℃孵育過夜, TBST洗膜3次,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(Abcam, ab6721, 稀釋比例1∶5 000), 室溫孵育1 h, TBST洗膜6次。ECL顯色液顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將HL-60細(xì)胞接種于24孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h。人工構(gòu)建TRIM52-AS1野生型啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因載體pGL4.10-hRluc, 將TRIM52-AS1預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)突變的突變體Mut-TRIM52-AS1和KDM5A雙熒光素酶報(bào)告基因載體共同轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞。孵育48 h后,吸出培養(yǎng)基,加入1×PLB裂解液室溫?fù)u床充分裂解以收集細(xì)胞,使用Promega海腎熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒以及熒光素酶底物發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)產(chǎn)品和儀器使用說明操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 CCK8實(shí)驗(yàn)

將待檢測(cè)的HL-60細(xì)胞按照5 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中,培養(yǎng)24 h。加入10 μL CCK8(MCE), 置于37 ℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱孵育2 h, 2 h使用Thermo Fisher的K3酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光值,并根據(jù)吸光值計(jì)算細(xì)胞增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

將待檢測(cè)的HL-60細(xì)胞分別制備成濃度為2×108個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液; 取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室(Corning), 下室為培養(yǎng)基600 μL。孵育18 h后,取出Transwell小室,擦除室內(nèi)殘余細(xì)胞,甲醇固定膜外細(xì)胞,吉姆薩(Sigma)染色,在倒置顯微鏡下觀察并拍照,每孔取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 KDM5A和TRIM52-AS1在白血病細(xì)胞中異常表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),組蛋白去甲基化酶KDM5AmRNA在AML組患者血清中表達(dá)高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1A。TRIM52-AS1 mRNA在AML組中表達(dá)低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1B。在白血病細(xì)胞ARH-77、HL-60、K-562和KG-1中, HL-60的KDM5AmRNA及其蛋白表達(dá)較高, TRIM52-AS1 mRNA表達(dá)較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1C、1D。選擇HL-60細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。

A: qRT-PCR檢測(cè)AML患者的血清中KDM5A mRNA的表達(dá),與正常組比較, *P<0.05; B: qRT-PCR檢測(cè)AML患者的血清中TRIM52-AS1 mRNA的表達(dá),與正常組比較, *P<0.05; C: qRT-PCR檢測(cè)白血病細(xì)胞中KDM5A和TRIM52-AS1 mRNA的表達(dá),與ARH-77比較, *P<0.05; D: Western blot檢測(cè)白血病細(xì)胞中KDM5A蛋白的表達(dá)。圖1 KDM5A和TRIM52-AS1在白血病細(xì)胞中異常表達(dá)

2.2 TRIM52-AS1抑制白血病細(xì)胞的增殖和遷移

本研究在HL-60細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染成功過表達(dá)TRIM52-AS1, TRIM52-AS1過表達(dá)組的TRIM52-AS1表達(dá)增高(P<0.05), 見圖2A。通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組、過表達(dá)對(duì)照組比較, TRIM52-AS1過表達(dá)組的增殖速率減緩,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖2B。通過Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組、過表達(dá)對(duì)照組比較, TRIM52-AS1過表達(dá)組細(xì)胞遷移被抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖2C。

A: qRT-PCR檢測(cè)TRIM52-AS1的過表達(dá); B: CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)TRIM52-AS1后, HL-60細(xì)胞的增殖情況; C: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)TRIM52-AS1后, HL-60細(xì)胞的遷移情況。與過表達(dá)對(duì)照組比較, *P<0.05。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。圖2 TRIM52-AS1抑制白血病細(xì)胞的增殖和遷移

2.3 KDM5A靶向抑制TRIM52-AS1

通過qRT-PCR和Western blot, 本研究在HL-60細(xì)胞系中敲低KDM5A, 與敲低對(duì)照組比較,敲低KDM5A組的KDM5A表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A、3B)。敲低KDM5A后,發(fā)現(xiàn)TRIM52-AS1表達(dá)上調(diào),與敲低對(duì)照組比較,敲低KDM5A組的TRIM52-AS1表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖3C。通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn),本研究鑒定了KDM5A可以靶向抑制TRIM52-AS1。由于TRIM52-AS1受到KDM5A的調(diào)控,以上結(jié)果提示KDM5A或可通過靶向TRIM52-AS1來(lái)調(diào)控AML的增殖和遷移。

A: qRT-PCR檢測(cè)KDM5A的敲低效率; B: Western blot檢測(cè)KDM5A的敲低效率; C: qRT-PCR檢測(cè)敲低KDM5A后TRIM52-AS1的表達(dá)情況; D: 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KDM5A對(duì)TRIM52-AS1的靶向調(diào)控。與敲低對(duì)照組比較, *P<0.05。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。圖3 KDM5A靶向抑制TRIM52-AS1

2.4 KDM5A通過抑制TRIM52-AS1抑制HL-60細(xì)胞增殖和遷移

與空白對(duì)照組比較,敲低KDM5A組的KDM5A表達(dá)降低,敲低KDM5A組+ TRIM52-AS1過表達(dá)組的TRIM52-AS1表達(dá)增高; 與TRIM52-AS1過表達(dá)組比較,敲低KDM5A組+TRIM52-AS1過表達(dá)組的KDM5A表達(dá)降低, TRIM52-AS1表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖4A。通過CCK8實(shí)驗(yàn),敲低KDM5A后, HL-60細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),與敲低對(duì)照組比較,敲低KDM5A組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 過表達(dá)TRIM52-AS1后, HL-60細(xì)胞的增殖能力減弱,與過表達(dá)對(duì)照組比較, TRIM52-AS1過表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 敲低KDM5A組+TRIM52-AS1過表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力恢復(fù)到正常細(xì)胞的增殖水平,見圖4B。通過Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),敲低KDM5A后,HL-60細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),與敲低對(duì)照組比較,敲低KDM5A組細(xì)胞遷移增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 敲低KDM5A組+TRIM52-AS1過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力恢復(fù)到正常細(xì)胞的增殖水平,見圖4C。因此KDM5A抑制TRIM52-AS1可能導(dǎo)致AML增殖和遷移水平受到顯著抑制。

A: qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的KDM5A和TRIM52-AS1表達(dá); B: CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖; C: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移。兩兩比較, *P<0.05。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。圖4 KDM5A通過抑制TRIM52-AS1抑制HL-60細(xì)胞增殖和遷移

3 討 論

AML具有易復(fù)發(fā)、易產(chǎn)生化療耐藥共2大特點(diǎn),因此迫切需要尋找可用于早期診斷AML的新生物標(biāo)志物[7-8]。研究[9-10]表明, LncRNA參與調(diào)控多種AML相關(guān)基因的表達(dá),從而促進(jìn)或抑制AML的發(fā)生發(fā)展。LncRNA也被確定為白血病的潛在生物標(biāo)志物,其動(dòng)態(tài)變化可能與AML的分期高度相關(guān)[11-13]。LncRNA靶向治療為AML患者提供了新的治療策略和個(gè)體化的治療方案。但LncRNA作為生物標(biāo)志物尚未作為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目,因此也并未廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中。此外,基于LncRNA的靶向治療也僅限于臨床前研究[14]。

KDM5A是一種三甲基化H3K4特異性的組蛋白去甲基化酶。KDM5A的異位表達(dá)會(huì)降低H3K4me3/me2的整體水平。研究[15]證實(shí),KDM5A是通過與其靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能,并在細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。在免疫細(xì)胞的活化過程中,KDM5A與細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,導(dǎo)致其H3K4me3修飾和基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。研究[16]表明,在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中過表達(dá)KDM5A可以通過降低RUNX2啟動(dòng)子上H3K4me3水平抑制BMP2誘導(dǎo)的成骨。敲除KDM5A導(dǎo)致人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞hASCs中堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子osterix(OSX)表達(dá)顯著增加[17]。TRIM52-AS1發(fā)揮其正常生物學(xué)功能的同時(shí)還可以通過LncRNA "molecular sponge"的這一特性參與調(diào)控其靶基因表達(dá)。既往研究[18]發(fā)現(xiàn),TRIM52-AS1可以招募miR-514a-5p,并通過上調(diào)MRPS18A從而促進(jìn)原發(fā)性肝癌(HCC)發(fā)生發(fā)展,其潛在機(jī)制是TRIM52-AS1通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-514a5p上調(diào)MRPS18A表達(dá)。本研究雖沒有找出TRIM52-AS1參與調(diào)控的其他靶基因,但發(fā)現(xiàn)TRIM52-AS1可以抑制白血病細(xì)胞HL-60的增殖和遷移,且發(fā)現(xiàn)KDM5A可作為TRIM52-AS1的上游,靶向抑制TRIM52-AS1的表達(dá)。因此KDM5A可以通過抑制TRIM52-AS1進(jìn)而促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖和遷移,在白血病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究初步發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的可以用于AML患者早期篩查和臨床治療的靶點(diǎn),但KDM5A和TRIM52-AS1是否可廣泛應(yīng)用于臨床,還要深入研究和探討。