崔蘭蘭 張革 徐邦牢

1華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣州 510180）；2中山大學(xué)藥學(xué)院微生物與生化藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室（廣州 511400）

微生物感染是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)境因素，如幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）和胃癌，人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）和宮頸癌，具核梭桿菌（Fusobacteriumnucleatum，F(xiàn)n）和結(jié)腸癌［1-3］。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis，Pg）是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭陰性球桿菌，作為重要牙周致病菌，越來(lái)越多的研究表明該細(xì)菌還是食管癌發(fā)生發(fā)展的重要微生物相關(guān)危險(xiǎn)因素［4］。有研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者食管上皮存在大量Pg，并且Pg 的豐度和食管癌風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后呈正相關(guān)［5］。Pg 可借助菌毛和STAT3 致使食管癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗，促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、化療耐藥［6］。Pg 可通過(guò)其外囊泡促進(jìn)食管癌增殖、遷移［7］。對(duì)Pg 感染的KYSE30 細(xì)胞分泌的外泌體miRNA 分析發(fā)現(xiàn)Pg 通過(guò)調(diào)控外泌體miRNA 表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路參與食管癌發(fā)生發(fā)展［8］。外泌體（exosome，Ex）是一類由細(xì)胞釋放的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，直徑為40 ～ 150 nm，含有DNA、RNA 和蛋白質(zhì)［9］。外泌體通過(guò)攜帶的蛋白質(zhì)、RNA 等介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，血管生成和免疫等［10］。在病毒、細(xì)菌等感染期間，宿主來(lái)源的外泌體受到病原體影響其成分和功能發(fā)生改變［11］。病原體感染的腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體擴(kuò)散到腫瘤微環(huán)境中，重塑腫瘤微環(huán)境［12］。然而，Pg 感染對(duì)食管癌細(xì)胞釋放的外泌體蛋白的表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)Nano-LC/MS 分析檢測(cè)Pg 感染和未感染的食管癌細(xì)胞分泌的外泌體蛋白，并利用信息學(xué)方法找出兩者間差異表達(dá)蛋白并做GO、KEGG富集解析，旨在研究Pg 對(duì)食管癌細(xì)胞外泌體蛋白表達(dá)及其相關(guān)信號(hào)通路的影響，為研究Pg 影響食管癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和細(xì)菌 人食管癌細(xì)胞Eca109、牙齦卟啉單胞菌ATCC33277 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco）、FBS 胎牛血清（Gibco），PVDF 超濾膜（Bio-Rad），0.25%胰蛋白酶（碧云天），CD63 抗體（Abcam）、CD9 抗體（Abcam）、mTOR 抗體（Abcam）、p-mTOR抗體（SCBT）、HIF1α 抗體（Abcam）、GLUT1 抗體（Abcam），血平板培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技）。

1.3 主要儀器 JEM-1400 透射電子顯微鏡購(gòu)自于日本JEOL Ltd 公司，離心機(jī)為美國(guó)Beckman Coulter 產(chǎn)品，動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS）為美國(guó)WYATT公司產(chǎn)品。

1.4 細(xì)胞細(xì)菌培養(yǎng) Eca109 細(xì)胞，用含10%胎牛血清、RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌株ATCC 33277 涂布在血平板，并放置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)（85% N2、10%H2和5% CO2）。

1.5 外泌體的提取 當(dāng)細(xì)胞密度生長(zhǎng)到80%時(shí)，棄舊培養(yǎng)基，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牙齦卟啉單胞菌MOI（1∶10）共培養(yǎng)48 h，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清10 000 ×g離心30 min，然后用0.22 μm濾膜過(guò)濾，然后再100 000 ×g、70 min離心2次，獲得外泌體，用100 μL PBS 重懸，保存于-80 ℃冰箱。

1.6 蛋白質(zhì)譜檢測(cè)樣品前處理

1.6.1 丙酮沉淀酶解 取300 μg 蛋白樣品，用50 mmol/L NH4HCO3稀釋至100 μL，加入4 倍體積的預(yù)冷丙酮沉淀-80 ℃過(guò)夜；4 ℃、15 000 ×g離心30 min，棄上清；用500 μL 冷丙酮洗1 次，同上離心10 min；用500 μL 冷70%乙醇洗1 次，同上離心；用500 μL 冷丙酮洗1 次，同上離心；用50 μL UAbuffer 重懸，加50 mmol/L DTT 2 μL，30 ℃水浴放置1.5 h。加50 mmol/L IAA 13 μL 暗處放置40 min。用 50 mmol/L NH4HCO3稀釋至600 μL，加入0.5 μg Trypsin，37 ℃酶解4 h；再加入0.5 μg Trypsin，37 ℃酶解過(guò)夜；用24 μL 10% TFA 酸化至終濃度0.4%終止反應(yīng)，4 ℃保存。

1.6.2 C18StageTip 肽段脫鹽 取一1.5 mL 離心管，將管蓋挖個(gè)小洞，剛好能卡住C18tips 上方的圓形端口，用于接流出液?；罨疌18tips：加入200 μL 100% MeOH，3 000 ×g離心10 min，棄流出液，重復(fù)3 次；condition：加入200 μL 80% ACN/0.1% FA，4 000 ×g離心8 min，棄流出液，重復(fù)3 次；平衡C18tips：加入200 μL 0.1% TFA，6 000 ×g離心8 min，棄流出液，重復(fù)3 次；上樣：取5 μg 樣品溶于200 μL 0.1% TFA 中，重復(fù)上樣，6 000 ×g離心10 min，棄流出液；洗脫鹽：加入200 μL 0.1% TFA，6 000 ×g離心12 min，棄流出液；洗脫TFA：加入200 μL 0.1% FA，6 000 ×g離心10 min，棄流出液；收集樣品：加入180 μL 80% ACN/0.1%FA，6 000 ×g離心約10 min，收集合并流出液，更換干凈的80%ACN/0.1% FA 潤(rùn)洗過(guò)的離心管；樣品旋干8 h 用20 μL 質(zhì)譜級(jí)0.1%FA 溶解樣品，上機(jī)。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定 從Eca109 細(xì)胞和Pg 感染的Eca109 細(xì)胞上清液通過(guò)差速離心并純化后得到的外泌體，透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）顯示外泌體呈杯口狀，大小均勻，動(dòng)態(tài)光散射（DLS）粒徑分析Ex 和Pg-Ex 平均大小為100 nm，Western blot 顯示Ex 和Pg-Ex 均表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD9，外泌體狀態(tài)良好（圖1）。

2.2 Pg-Ex 蛋白質(zhì)譜生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)定性分析 Nano-LC/MS 分析檢測(cè)到Pg-Ex 有729 和Ex 有952 種蛋白質(zhì)，維恩圖分析顯示兩組之間有678 種蛋白質(zhì)重疊，Pg-Ex 攜帶51 種獨(dú)特的蛋白質(zhì)（圖2），其中4 種為Pg 蛋白，分別為天冬氨酸/谷氨酸特異性二肽基肽酶、肽?；彼崦搧啺泵?、二肽基肽酶7、菌毛FimA 1 型，46 種為細(xì)胞蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果，以log2（fold change）＞1，P＜ 0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行上調(diào)蛋白的篩選及l(fā)og2（fold change）＜-1，P＜ 0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行下調(diào)蛋白的篩選，分別篩選出387 個(gè)Pg-Ex 表達(dá)上調(diào)的蛋白、294 個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白。

圖2 Pg-Ex 和Ex 的獨(dú)特蛋白和重疊蛋白Fig.2 The unique and overlapping proteins of Pg-Ex and Ex

2.2.2 GO 分類 基因本體論（GO）功能富集分析包括以下3 種類型：分子功能（MF）、生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）。將上述篩選得到的差異蛋白輸入Metascape 在線分析工具（https：//metascape.org/gp/index.html），根據(jù)P＜ 0.01，最小重疊為3，富集分?jǐn)?shù)＞ 1.5 進(jìn)行GO 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。

GO 富集分析發(fā)現(xiàn)Pg-Ex 差異蛋白組分主要為細(xì)胞連接、粘著斑、核糖體、纖維膠凝蛋白顆粒（Ficolin）、囊泡、膜、核小體、蛋白酶體復(fù)合物、突觸等；分子功能主要為結(jié)合小分子、具有酶活性、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)翻譯、調(diào)節(jié)酶活性、運(yùn)輸、具有信號(hào)受體活性等；主要參與的生物過(guò)程包括調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、分化，細(xì)胞對(duì)刺激的應(yīng)答，蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白分解代謝，細(xì)胞黏附，趨化，血管生成，細(xì)胞增殖，免疫反應(yīng)等（圖3）。

圖3 Pg-Ex 差異蛋白GO 富集分析Fig.3 Pg-Ex differential proteins GO enrichment analysis

2.2.3 KEGG 注釋通路分析 通過(guò)KEGG 注釋通路分析表明Pg-Ex 差異蛋白富集于PI3K-Akt 信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、HIF1 信號(hào)通路、縫隙連接、腫瘤中心代謝、壞死性凋亡、胰島素信號(hào)通路、mTOR 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、ECM 受體相互作用、AMPK 信號(hào)通路、Hippo 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞黏附、VEGF 信號(hào)通路等（圖4）。

圖4 Pg-Ex 差異蛋白KEGG 通路富集分析Fig.4 Pg-Ex differential proteins KEGG pathway enrichment analysis

圖5 Pg-Ex 促進(jìn)食管癌細(xì)胞糖酵解Fig.5 Pg-Ex promotes Glycolysis of esophageal cancer cells

2.2.4 差異蛋白Western blot 驗(yàn)證 對(duì)差異蛋白mTOR 進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證結(jié)果如圖 5 所示，與Ex 相比，Pg-Ex 的mTOR、P-mTOR 蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，與未處理組和Ex組相比，Pg-Ex處理的Eca109細(xì)胞HIF1α，GLUT1 的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，這表明Pg-Ex 通過(guò)激活m-TOR-HIF1α-GLUT1 通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞糖酵解。

3 討論

腫瘤來(lái)源的外泌體（Tumor-derived exosomes，TEXs）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，通過(guò)運(yùn)輸特定蛋白質(zhì)和RNA 參與腫瘤進(jìn)程［13］。通常，病原體通過(guò)影響宿主蛋白表達(dá)促進(jìn)自身存活、發(fā)展［14］。有研究指出較未感染組，從病原體感染的細(xì)胞中分離的外泌體其RNA、蛋白質(zhì)組成發(fā)生顯著變化［15-17］。病原體可以通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體某些成分從而調(diào)控腫瘤微環(huán)境。如具核梭桿菌感染的結(jié)直腸癌細(xì)胞釋放的外泌體通過(guò)攜帶miR-1246/92b-3p/27a-3p 和游離CXCL16 促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［18］。牙齦卟啉單胞菌最重要的毒力因子是脂多糖（LPS）、菌毛、牙齦蛋白酶和外膜囊泡［19］。我們的研究發(fā)現(xiàn)Pg-Ex 攜帶有Pg 蛋白分別為天冬氨酸/谷氨酸特異性二肽基肽酶、肽?；彼崦搧啺泵?、二肽基肽酶7、菌毛FimA 1 型。這說(shuō)明Pg 影響Pg-Ex 的蛋白表達(dá)，為進(jìn)一步研究Pg 是如何影響食管癌的發(fā)生發(fā)展奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

細(xì)胞連接是指細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的連接結(jié)構(gòu)，在免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖與分化、腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過(guò)程發(fā)揮重要作用［20］。粘著斑指的是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的物理聯(lián)系，通過(guò)整合素發(fā)揮作用，調(diào)控細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長(zhǎng)及分化［21］。Ficolin 通過(guò)激活補(bǔ)體凝集素途徑調(diào)節(jié)免疫影響腫瘤發(fā)展［22］。腫瘤微環(huán)境中趨化因子的異常分布可促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞（即Treg 細(xì)胞、MDSC 和TAM）分化和浸潤(rùn)；或激活PI3K/AKT、ERK 1/2 等信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)腫瘤血管系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移到“轉(zhuǎn)移前生態(tài)位”［23-24］。中心碳代謝傳統(tǒng)意義上包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑以及三羧酸循環(huán)。在缺氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞選擇開(kāi)啟糖酵解代謝并上調(diào)促血管生成因子的表達(dá)，最終促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移［25］。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其中心參與控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）可通過(guò)激活mTOR 信號(hào)通路，上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的表達(dá)促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄和糖酵解酶的磷酸化進(jìn)而增加糖酵解［27］；或者進(jìn)一步趨化VEGF 的合成，促進(jìn)腫瘤微血管生成［26-27］。

本研究發(fā)現(xiàn)Pg-Ex 差異蛋白主要為細(xì)胞連接、粘著斑、核糖體、纖維膠凝蛋白顆粒（Ficolin）、囊泡等；參與調(diào)控細(xì)胞遷移、分化、黏附，趨化，血管生成，細(xì)胞增殖，免疫反應(yīng)等生物過(guò)程；富集于PI3K-Akt 信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、HIF1 信號(hào)通路、腫瘤中心代謝、胰島素信號(hào)通路、mTOR 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、ECM 受體相互作用、VEGF 信號(hào)通路等信號(hào)通路。Pg-Ex通過(guò)激活m-TOR-HIF1α-GLUT1 通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，為糖酵解提供充足的原料，促進(jìn)ATP 的生成，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。綜上所述，Pg-Ex 通過(guò)調(diào)節(jié)一系列生物過(guò)程和信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解代謝、增殖、黏附、遷移、血管形成以及調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，這為Pg-Ex 促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移這一假說(shuō)提供了理論依據(jù)。

本研究利用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)Pg 感染和未感染的Eca109 細(xì)胞釋放的外泌體蛋白進(jìn)行分析，并對(duì)其差異表達(dá)的蛋白做GO、KEGG 富集分析和蛋白免疫印跡驗(yàn)證。結(jié)果表明Pg 通過(guò)影響食管癌外泌體蛋白的表達(dá)譜進(jìn)一步調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路，參與食管癌的發(fā)生發(fā)展。分析Pg 感染和未感染性外泌體差異蛋白有利于弄清Pg 促食管癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制，對(duì)食管癌的防治具有重要意義，但是Pg-Ex 促食管癌機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證之后，才有望為食管癌的防治提供確切的理論依據(jù)。

【Author contributions】CUI Lanlan performed the experiments and wrote the article.ZHANG Ge designed the study and reviewed the article.XU Banglao revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.