許云春 于馨雅 王雅芝 申元英 郭樂

大理大學基礎醫(yī)學院（云南大理 671000）

代謝相關脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）是以肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度蓄積、炎癥反應以及氧化應激為特征的一種常見的肝臟疾?。?］，并可發(fā)展為更加嚴重的肝硬化甚至肝癌等終末期肝病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢［2］。MAFLD 受多重因素影響，脂毒性肝損傷和炎癥反應是其發(fā)病機制中最為重要的驅動因素［3］，NF-κB信號傳導途徑在受損的肝細胞中被激活并誘導炎癥細胞因子分泌，加速疾病進展［4-5］，抑制NF-κB信號通路的激活可能成為減輕MAFLD 中肝細胞炎癥損傷的關鍵［6-7］。因此，探索通過調(diào)控NF-κB信號通路來影響肝損傷和炎癥的潛在機制有望成為新的治療靶點。目前，已有多項研究表明長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在炎癥反應、免疫功能、物質(zhì)代謝和癌癥等生理和病理過程中發(fā)揮重要的生物學功能［8］，lncRNA 是一類長度＞ 200 個核苷酸且不具備蛋白編碼功能的RNA 分子，它能作為促進轉錄的信號或抑制轉錄的誘餌、表觀遺傳調(diào)節(jié)因子等參與基因調(diào)控［9-10］，還可以履行分子介質(zhì)的職責，調(diào)節(jié)細胞信號通路傳導，影響疾病發(fā)展［11-12］。位于11 號染色體的核內(nèi)富集轉錄本1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）是核lncRNA 的一種類型，與趨化因子調(diào)節(jié)、細胞因子產(chǎn)生和炎癥小體激活等炎癥反應過程有關，還可以作為轉錄調(diào)控因子激活NF-κB 信號通路的轉導，該通路被激活促進炎癥反應，加劇細胞損傷［13］。有研究［14］表明沉默lncRNA NEAT1 通過抑制TLR2/NF-κB 信號通路的激活來改善脂多糖誘導的小鼠心肌損傷和炎癥。然而，lncRNA NEAT1 是否可以通過調(diào)控NF-κB 信號通路來影響MAFLD 中肝細胞損傷及炎癥反應目前尚不明確，因此，探究其可能存在的調(diào)控機制可為MAFLD 的診治提供新見解。本研究以棕櫚酸處理人正常肝永生化細胞株（LO2）建立MAFLD體外細胞模型，通過脂質(zhì)體轉染實現(xiàn)過表達或者沉默lncRNA NEAT1，探討其表達水平變化對棕櫚酸誘導的LO2 細胞損傷與炎癥反應的影響，并初步闡明其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；0.25%胰酶、青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；20%無脂肪酸牛血清白蛋白、組織細胞甘油三酯（TG）酶法測定試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；棕櫚酸（西安鯤創(chuàng)科技有限公司）；油紅O 染料（上海邁瑞爾化學技術有限公司）；第一鏈cDNA 反轉錄試劑盒及通用型實時熒光定量PCR 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；lnRcute lncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、lnRcute lncRNA 熒光定量檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；谷丙轉氨酶（ALT / GPT）測試盒、谷草轉氨酶（AST / GOT）測試盒（南京建成生物工程研究所）；TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA 試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；Lipo8000TM轉染試劑（上海碧云天生物技術有限公司）；NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、GAPDH 單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司）；過表達質(zhì)粒pcDNANEAT1（武漢金開瑞生物工程有限公司）；小干擾RNA si-NEAT1（genepharma 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、模型建立及分組 使用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)LO2細胞，并將其置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，當細胞密度達80% ～ 90%時，消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗，分為Blank 組（空白對照），Vehicle組（溶劑對照），PA 組（模型組：添加0.32 mmol/L 棕櫚酸處理24 h）。設置Control 組（陰性對照組）、PA組（模型組）、pcDNA-NC+PA 組（過表達空載對照組）、pcDNA-NEAT1+PA 組（過表達組）、si-NC+PA組（沉默陰性對照組）、si-NEAT1+PA 組（沉默組）。

1.2.2 油紅O 染色和甘油三酯（TG）含量測定評估細胞脂質(zhì)積累 油紅O 染色按照以下步驟進行，細胞處理后，4%多聚甲醛固定30 min，60%異丙醇潤洗后使用油紅O 工作液避光染色30 min，60%異丙醇洗滌后蘇木素染液染色2 min，顯微鏡觀察獲取圖像。TG 含量測定根據(jù)試劑盒說明書進行操作，收集細胞進行裂解，使用酶標儀檢測波長為550 nm 處的吸光度值并根據(jù)標準曲線計算TG 濃度，再通過BCA 法測定細胞內(nèi)蛋白濃度，以蛋白濃度校正TG 含量。

1.2.3 CCK8 檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的LO2 細胞接種于96 孔板中，分組處理后，每孔加入CCK8 溶液10 μL，37℃避光孵育1 h 后使用酶標儀檢測OD450，細胞活力=［（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）］×100%。

1.2.4 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）酶活力測定反映肝細胞損傷 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，按照說明書步驟進行操作，波長510 nm，酶標儀測定各孔OD值，以絕對OD值（OD測定孔-OD對照孔）查標準曲線，求得相應的ALT 和AST 活力單位。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測各目的基因mRNA 水平 采用Trizol 法提取各組細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄為cDNA，通過qPCR 檢測基因表達變化。采用比較閾值循環(huán)法（2-△△Ct）計算各目的基因的相對mRNA 表達量，其中以GAPDH 的表達作為內(nèi)參，主要基因引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測炎癥因子蛋白分泌水平 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，按照各指標試劑盒說明書進行操作，即刻測量OD450值，并根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡（WB）和免疫熒光（IF）檢測NF-κB 信號通路相關蛋白表達 蛋白質(zhì)印跡按以下步驟進行，細胞處理后加入RIPA 裂解液提取總蛋白，使用BCA 法進行蛋白濃度測定并定量，選取12.5%SDS-PAGE 凝膠進行電泳，采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF 膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉或5%BSA封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，二抗于室溫孵育1 h，最后經(jīng)ECL 曝光成像。免疫熒光檢測NFκB p65 核轉位情況，使用4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.5% Triton X-100 作用2 min 使細胞膜通透，1%BSA 封閉2 h，加入NF-κB p65 抗體4 ℃孵育過夜，次日室溫避光孵育熒光二抗，并用DAPI 染核，最后使用熒光顯微鏡觀察獲取圖像。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 棕櫚酸處理對LO2 細胞損傷與炎癥反應的影響 與Blank 組相比，Vehicle 組溶劑處理對LO2細胞脂質(zhì)積累、細胞活力、細胞損傷、炎癥因子表達變化均無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；而PA 組棕櫚酸處理后LO2 細胞內(nèi)脂質(zhì)明顯積累，細胞活力降低，肝細胞損傷指標ALT、AST 酶活性增高，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達升高（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 棕櫚酸處理對LO2 細胞損傷及炎癥反應的影響Fig.1 Effect of palmitic acid treatment on LO2 cell injury and inflammatory response

2.2 棕櫚酸處理對LO2 細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達水平的影響 與Blank 組相比，Vehicle 組溶劑對照處理對lncRNA NEAT1表達無影響（P＞ 0.05），PA 組棕櫚酸處理后lncRNA NEAT1 表達增高（P＜0.01），見圖2。

圖2 棕櫚酸處理對LO2 細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1 表達水平的影響Fig.2 Effect of palmitic acid treatment on the expression level of lncRNA NEAT1 in LO2 cells

2.3 過表達及沉默lncRNA NEAT1 轉染效果的檢測 結果顯示，與過表達空載對照組（pcDNANC+PA）相比，過表達組（pcDNA-NEAT1+PA）lncRNA NEAT1 表達水平進一步增高，與沉默陰性對照組（si-NC+PA）相比，沉默組（si-NEAT1+PA）lncRNA NEAT1 表達降低，提示過表達及沉默均成功（P＜ 0.01），見圖3。

圖3 過表達及沉默lncRNA NEAT1 轉染效果的檢測Fig.3 Detection of overexpression and inhibition effects after interference with lncRNA NEAT1

2.4 過表達及沉默lncRNA NEAT1 對棕櫚酸誘導的LO2 細胞損傷與炎癥反應的影響 結果顯示，與過表達空載對照組（pcDNA-NC+PA）相比，過表達組（pcDNA-NEAT1+PA）細胞活力顯著降低，肝損傷指標ALT、AST 和炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達進一步增高；與沉默陰性對照組（si-NC+PA）相比，沉默組（si-NEAT1+PA）細胞活力有所恢復，肝損傷指標、炎癥因子水平均下調(diào)（P＜ 0.05），見圖4。

圖4 過表達及沉默NEAT1 對棕櫚酸誘導的LO2 細胞損傷與炎癥反應的影響Fig.4 Effects of overexpression and inhibition of NEAT1 on palmitic acid induced L02 cell injury and inflammatory response

2.5 過表達及沉默lncRNA NEAT1 對棕櫚酸誘導的LO2 細胞中NF-κB 信號通路的影響 與Control組相比，PA 組棕櫚酸處理后NF-κB 信號通路被激活，NF-κB 抑制蛋白IKBα 降解，NF-κB p65 的磷酸化及核轉位增加。與過表達空載對照組（pcDNANC+PA）相比，過表達lncRNA NEAT1后進一步促進二者變化。與沉默陰性對照組（si-NC+PA）相比，沉默lncRNA NEAT1 則提高了IKBα 的表達并減少NF-κB p65的磷酸化及核轉位，見圖5。

圖5 過表達及沉默lncRNA NEAT1 對棕櫚酸誘導的LO2 細胞中NF-κB 信號通路的影響Fig.5 Effect of overexpression and inhibition of lncRNA NEAT1 on NF-κB signaling pathway in palmitic acid-induced LO2 cells

3 討論

在MAFLD 中，肝臟脂質(zhì)沉積過多導致脂質(zhì)代謝紊亂，在長期慢性的脂毒性刺激下，肝細胞出現(xiàn)應激性損傷，肝臟表現(xiàn)出嚴重的炎癥反應，伴隨氧化應激增強，炎癥介質(zhì)增加，肝細胞損傷進一步加重［15-16］。因此，探究能夠改善肝細胞損傷和炎癥反應等病理生理過程的策略對緩解MAFLD 的發(fā)展尤為重要。越來越多的lncRNA 被發(fā)現(xiàn)在疾病過程中異常表達，它們已被廣泛建議作為某些病理環(huán)境中的生物標志物和治療靶點，對臨床診斷及療效判定等方面具有重要價值。LncRNA NEAT1作為其中的一種，被證實與多種肝臟疾病的發(fā)病以及病情進展有關，它能夠加速肝纖維化和肝細胞癌的進展，同時通過調(diào)節(jié)炎癥反應在急慢性肝衰竭的發(fā)病機制中發(fā)揮保護作用［17］。然而，在MAFLD 中l(wèi)ncRNA NEAT1 是否發(fā)揮調(diào)節(jié)肝細胞損傷和炎癥反應的作用尚未被闡明。因此，本文就上述問題進行分析。

對于該病的研究，使用棕櫚酸處理HepG2、LO2 細胞構建體外細胞模型已被充分報道與證實［18-20］。其中，油紅O 染色和甘油三酯含量測定是反映肝細胞脂質(zhì)積累的常用方法，也是用于指示建模成功的關鍵指標；ALT、AST 則是反映肝細胞損傷和判斷損傷程度的酶；TNF-α、IL-1β、IL-6 作為經(jīng)典的炎癥細胞因子，其表達增加與肝臟炎癥狀態(tài)相關。本研究采用棕櫚酸誘導LO2 細胞建模，與預期結果一致，處理后細胞脂質(zhì)沉積，甘油三酯含量增加，還存在肝細胞損傷和炎癥反應，說明MAFLD 細胞模型構建成功。在此基礎上，檢測lncRNA NEAT1 在棕櫚酸誘導后的表達變化，發(fā)現(xiàn)其表達上調(diào)，且與肝細胞損傷和炎癥因子表達呈正相關，提示lncRNA NEAT1 可能是棕櫚酸誘導的肝細胞損傷中的重要調(diào)控分子。進一步過表達或沉默lncRNA NEAT1 對其進行功能研究，發(fā)現(xiàn)過表達該分子加劇棕櫚酸誘導的細胞損傷和炎癥反應，沉默該分子后可以緩解上述損傷，以上結果表明，lncRNA NEAT1 在棕櫚酸誘導的肝細胞損傷與炎癥反應中發(fā)揮重要作用。

肝細胞炎癥反應是導致MAFLD 疾病進展的關鍵因素之一，NF-κB 信號通路的激活在其中發(fā)揮重要作用，靜息狀態(tài)下NF-κB 由p65 和p50 與其抑制蛋白（inhibition of NF-κB，IκB）結合形成三聚體以無活性形式存在于肝細胞胞漿中，受到刺激時IκB 被降解，釋放出的NF-κB p65 亞基在胞質(zhì)中被激活，然后磷酸化移位進入胞核誘導TNF-α、IL-1β、IL-6 等多種促炎基因的表達［21］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸誘導的肝細胞中，NF-κB 抑制蛋白IκBα 被降解，釋放出的NF-κB p65 磷酸化入核增多，提示脂毒性損傷狀態(tài)下，NF-κB 炎癥信號通路被激活。推測NF-κB 信號通路的激活和異常表達的lncRNA NEAT1 可能存在聯(lián)系，具體調(diào)控關系尚不明確。先前的研究［22］表明lncRNA NEAT1 通過正調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路促進化膿性小鼠的腦損傷和細胞凋亡與炎癥；lncRNA NEAT1/miR-193a-3p通過影響TLR4/NF-κB 信號通路來調(diào)節(jié)脂多糖誘導的細胞凋亡和炎癥損傷［23］；抑制NEAT1 的表達通過減少NF-κB p65 的細胞核轉位來保護大鼠心肌缺血再灌注損傷［24］，這些都為闡明lncRNA NEAT1 能夠調(diào)控NF-κB 信號通路提供了有力依據(jù)。本研究同樣證明，過表達lncRNA NEAT1 可以進一步促進NF-κB 信號通路的激活，加劇肝細胞損傷，促進炎癥因子的表達，沉默lncRNA NEAT1可以減少該通路的激活，下調(diào)肝細胞損傷指標和炎癥因子。以上結果證實，沉默lncRNA NEAT1 可通過抑制NF-κB 信號通路的激活來減輕肝細胞損傷與炎癥反應，從而在MAFLD 中發(fā)揮保護作用。

綜上所述，本實驗初步證實了lncRNA NEAT1與棕櫚酸誘導的肝細胞損傷及炎癥反應密切相關，且首次驗證了沉默lncRNA NEAT1 通過抑制NF-κB 信號通路的激活來改善上述損傷。但本研究僅在體外細胞模型中得到驗證，并且lncRNA NEAT1 調(diào)控NF-κB 信號通路還可能是通過海綿化下游靶miRNA 來發(fā)揮作用，本課題組下一步將深入研究lncRNA NEAT1 的具體調(diào)控機制并在動物模型中補充論證，以期為代謝相關脂肪性肝病的診治提供更為可靠的實驗依據(jù)。

【Author contributions】XU Yunchun performed the experiments and wrote the article.YU Xinya，WANG Yazhi performed the experiments.SHEN Yuanying and GUO Le designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.