陳嘉琪 史秀麗 黃雪云 吳娜

1江西中醫(yī)藥大學(xué)（南昌 330004）；2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（南昌 330006）

炎癥性腸病是（inflammatory bowel disease，IBD）一種常見(jiàn)的結(jié)腸疾病，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，現(xiàn)多認(rèn)為其是多因素的，包括宿主遺傳因素、免疫失調(diào)、微生物植物群、環(huán)境因素和上皮屏障缺陷［1］。其中免疫調(diào)節(jié)的重點(diǎn)是修復(fù)黏膜愈合缺陷，但上皮因子屏障的形成機(jī)制還不清楚，腸上皮細(xì)胞在腸屏障和免疫調(diào)節(jié)功能中起重要作用，腸上皮穩(wěn)態(tài)和再生對(duì)闡明疾病發(fā)病機(jī)制及改善治療方法具有重要意義。2009 年，SATO 等［2］第一次成功培育出腸道類器官，這使人們對(duì)腸干細(xì)胞和黏膜再生的認(rèn)識(shí)不斷加深。類器官（organoids）是指一種三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)物，體外培養(yǎng)的organoids 能夠再現(xiàn)原始器官的結(jié)構(gòu)和功能特征［3-4］。結(jié)腸類器官（colon organoids）的培養(yǎng)來(lái)源為富含亮氨酸重復(fù)序列G 蛋白偶聯(lián)受體5 陽(yáng)性（leucine-rich repeatcontaining G-protein coupled receptor 5，LGR5+）成體干細(xì)胞和多能干細(xì)胞（Pluripotent stem cell，PSC）［5］。結(jié)腸類器官的培養(yǎng)條件為添加了優(yōu)化生長(zhǎng)因子WENR（Wnt3A、EGF、Noggin、R-spondin 1）的培養(yǎng)基［6-8］。本文就結(jié)腸類器官的培養(yǎng)體系進(jìn)行綜述，旨在為結(jié)腸類器官相關(guān)科研工作者提供參考。

1 結(jié)腸類器官培養(yǎng)源

多數(shù)研究者［6-12］使用6 ～ 8 周、190 ～ 220 g 的C57BL/6 雄性鼠作為結(jié)腸類器官的培養(yǎng)源，該實(shí)驗(yàn)鼠為近交系小鼠，近交系基因純合，遺傳穩(wěn)定，表型一致，背景資料清晰可查［13］，且C57BL/6 小鼠具有各種腫瘤發(fā)病率低、補(bǔ)體活性高、干擾素產(chǎn)量高和易于繁殖等優(yōu)點(diǎn)［14-15］。也有研究者使用兔［16］（歐洲兔、“新西蘭白”實(shí)驗(yàn)兔、澳大利亞野生兔）、禽類［17］、豬［18］、人類［6，9］等的結(jié)腸干細(xì)胞作為colon organoids 培養(yǎng)源。

2 結(jié)腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備

腸上皮是一種獨(dú)特的單層結(jié)構(gòu)，小腸上皮包括隱窩和絨毛，而在結(jié)腸中不存在絨毛［20］。隱窩是充滿未分化細(xì)胞的內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，其頂部具有吸收電解質(zhì)和水的功能，在其底部，LGR5+干細(xì)胞與潘氏細(xì)胞（Paneth cell）交錯(cuò)排列［21］。LGR5+干細(xì)胞分裂增殖產(chǎn)生過(guò)渡增殖細(xì)胞（transit amplifying cell，TA 細(xì)胞），TA 細(xì)胞生長(zhǎng)分化形成腸功能細(xì)胞，包括腸上皮吸收細(xì)胞（Alp+）、Paneth 細(xì)胞（Lyz+）、杯狀細(xì)胞（Muc2+）、內(nèi)分泌細(xì)胞（Chga+）等。Paneth 細(xì)胞可以表達(dá)EGF（表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子）、Wnt-3a（人重組Wnt-3a 蛋白）、TGF-α（α 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子）和Dll4（Dll4 重組蛋白），這些因子可以促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化。然而，值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織中不存在Paneth 細(xì)胞，但其所具有c-Kit 陽(yáng)性分泌細(xì)胞與Paneth 細(xì)胞功能相似，在結(jié)腸類器官培養(yǎng)基中添加外源性Wnt-3a 與c-Kit 陽(yáng)性分泌細(xì)胞協(xié)作以替代單一Paneth 細(xì)胞的作用是必須的。

結(jié)腸類器官的培養(yǎng)條件為添加了WERN（Wnt-3a、EGF、R-spondin 1、Noggin）的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中Wnt-3a 可以維持干細(xì)胞的自我更新及分化能力，Wnt-3a 通過(guò)刺激Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)以達(dá)到隱窩增殖的目的［2，22-24］；EGF 信號(hào)主要刺激小腸Lgr5+和TA細(xì)胞的增殖；R-spondin1 是Wnt 激動(dòng)劑，同時(shí)也是Lgr5+的配體，Lgr5+與配體 R-spondin1 結(jié)合可增強(qiáng)Wnt-β-catenin 信號(hào)通路，通過(guò)Paneth 細(xì)胞放大Wnt 通路的局部效應(yīng)而起作用，Wnt 通路可以刺激隱窩基底柱狀細(xì)胞（crypt base columnar cell，CBC）的增殖，在體內(nèi)可以導(dǎo)致隱窩大量增殖［25-26］；BMP信號(hào)（bone morphogenetic protein，骨形態(tài)發(fā)生蛋白）在腸道發(fā)育過(guò)程中主要誘導(dǎo)異位隱窩的形成，當(dāng)缺失BMP通路抑制劑如Noggin時(shí)，BMP信號(hào)持續(xù)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞建立異位隱窩，最終會(huì)導(dǎo)致息肉和腫瘤的發(fā)生，另外，BMP信號(hào)會(huì)與Wnt信號(hào)發(fā)生拮抗作用，從而阻礙Lgr5+的增殖，因此，在培養(yǎng)基中添加Noggin（BMP 通路抑制劑）的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以維持類器官中正常隱窩的擴(kuò)增［27-28］。通常來(lái)說(shuō)，由于動(dòng)物血清含有不確定的分化因子，因此無(wú)血清培養(yǎng)基更適合干細(xì)胞的培養(yǎng)，但是無(wú)血清培養(yǎng)基需要補(bǔ)充其他因子，如FGF、礦物質(zhì)和維生素等［9，11］。

3 結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基的制備

分離結(jié)腸隱窩后，將其與必需的生態(tài)位因子（即WERN）一起包埋在Matrigel 中，并形成稱為類器官的定型結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)添加各種分子抑制劑以及生長(zhǎng)因子等以促進(jìn)隱窩的增殖。在培養(yǎng)后1 個(gè)月開(kāi)始，結(jié)腸類器官的形態(tài)從出芽結(jié)構(gòu)變?yōu)槟倚越Y(jié)構(gòu)，在形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變的同時(shí)，細(xì)胞增殖逐漸減少，在此時(shí)期ALK 受體和P38 信號(hào)負(fù)調(diào)控腸上皮細(xì)胞的增殖，因此加入A83-01（ALK4/5/7 抑制劑）和SB202190（P38 抑制劑）可以抑制類器官的死亡，顯著提高類器官形成率［6，19］，但FUJII 等［29］指出，用胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF-2）替代p38 抑制劑，能夠在保持細(xì)胞多樣性的同時(shí)有效培養(yǎng)人腸類器官?！癇-27 Supplement”是一種優(yōu)化的無(wú)血清添加劑，可以擴(kuò)增來(lái)自小鼠EGF 響應(yīng)性的前體細(xì)胞?！癗2-Supplement”可以促進(jìn)原代細(xì)胞培養(yǎng)中有絲分裂后期神經(jīng)元的生長(zhǎng)和表達(dá)。“Penicillin-Streptomycin Liquid”青鏈霉素雙抗溶液，作為培養(yǎng)基的一部分用于細(xì)胞培養(yǎng)，可有效抑制多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的生長(zhǎng)，從而有效控制細(xì)胞被細(xì)菌污染。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）能夠刺激細(xì)胞的增殖，高水平的FGF4 和Wnt-3a 協(xié)同作用能夠促進(jìn)腸內(nèi)胚層和腸管狀形態(tài)的生成，從而形成3D 腸球樣體，進(jìn)一步培養(yǎng)形成3D 腸組織［30］。HIBIYA 等［7］研究者還添加了肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF），HGF 能作用于上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞等多種細(xì)胞，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和形態(tài)發(fā)生。YIN 等［31］研究者發(fā)現(xiàn)CHIR99021［糖原合成酶3β（GSK3β）抑制劑］和VPA［乙?；福℉DAC）抑制劑］能夠刺激干細(xì)胞的自我更新，其菌落形成效率是ENR 條件下的20 ～ 50 倍，且CV 條件下培養(yǎng)的細(xì)胞可作為單細(xì)胞傳代10 倍以上，其菌落形態(tài)、繁殖能力、集落形成效率和干細(xì)胞潛能與新分離的Lgr5+干細(xì)胞相似。另外，NEUROG3（腸內(nèi)分泌癥中突變的促內(nèi)分泌應(yīng)答因子）是體外培養(yǎng)的人腸內(nèi)分泌細(xì)胞所必須的［32-33］。在人類結(jié)腸隱窩的培養(yǎng)基中，除了需要添加WENR 等基本生長(zhǎng)因子外，還需要添加一些激素和維生素類物質(zhì)，如加入胃泌素（gastrin）和煙酰胺（nicotinamide）可以提高培養(yǎng)效率，延長(zhǎng)類器官的存活時(shí)間且不干擾腸分化［6］；在培養(yǎng)結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）類器官時(shí)需制定適合腫瘤類器官培養(yǎng)的選擇性培養(yǎng)基［34］，在腫瘤組織中某些信號(hào)通路異常激活，因此可以去除特定的生長(zhǎng)因子，比如，在Wnt 信號(hào)特異性激活的腸癌類器官的培養(yǎng)基中，需要去除Wnt 和R-spondin1；存在EGFR 通路突變的CRC 中，去除EGF；存在p38突變的CRC 中，則去除p38 抑制劑SB202190［35］；由于癌細(xì)胞對(duì)氧濃度敏感，可以在低氧情況下培養(yǎng)晚期CRC 類器官。值得注意的是，有研究者發(fā)現(xiàn)Paneth 細(xì)胞體內(nèi)外的自我更新和增殖依賴于LGR5+干細(xì)胞與Paneth 之間的直接物理接觸，因此Paneth 細(xì)胞和Lgr5+干細(xì)胞的共培養(yǎng)可以提高結(jié)腸類器官的培養(yǎng)效率［31，36］，Lgr5+干細(xì)胞的增殖依賴于Notch 通路，Notch 通路也依賴于細(xì)胞之間的直接接觸。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)腸類器官培養(yǎng)基中添加的生長(zhǎng)因子Tab.1 Growth factors added in colonic organoid medium

4 結(jié)腸類器官分化培養(yǎng)基的制備

Lgr5+干細(xì)胞每24 小時(shí)分裂1次并分化為各種腸上皮細(xì)胞，分化后的主要泌系細(xì)胞包括分泌激素的內(nèi)分泌細(xì)胞，產(chǎn)生黏液的杯狀細(xì)胞和隱窩中的潘氏細(xì)胞。在Lgr5+干細(xì)胞分化前，可向結(jié)腸類器官增殖培養(yǎng)基中加入或移除特定分子抑制劑及生長(zhǎng)因子以促進(jìn)結(jié)腸類器官定向分化。結(jié)腸類器官的培養(yǎng)在WERN 條件下，Lgr5+干細(xì)胞增殖，但是其中Wnt-3a 會(huì)干擾腸道的分化并產(chǎn)生主要由未分化祖細(xì)胞組成的類器官，煙酰胺和p38 抑制劑SB202190 也在很大程度上抑制吞咽細(xì)胞和腸道內(nèi)分泌的分化［32，37］，因此，在結(jié)腸類器官組織的分化期應(yīng)當(dāng)去除這兩種試劑以產(chǎn)生成熟的吞咽細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞。Lgr5+干細(xì)胞受Wnt、Notch、BMP和EGF 等各種信號(hào)的影響［38］，其中，Wnt 和Notch是控制腸道干細(xì)胞分化的兩個(gè)主要信號(hào)通路，當(dāng)這兩種信號(hào)通路均開(kāi)放時(shí)，Lgr5+干細(xì)胞維持增殖狀態(tài)。IWP-2 是Wnt 通路抑制劑，DAPT 是Notch抑制劑。在WERN 條件下，DAPT 通過(guò)Notch 通路轉(zhuǎn)錄因子CSL 的條件性靶向耗竭腸道干細(xì)胞，以終止腸道上皮增殖，并誘導(dǎo)分泌性細(xì)胞的分化，IWP-2 誘導(dǎo)腸細(xì)胞和Paneth 細(xì)胞的分化，IWP-2 和DAPT 同時(shí)應(yīng)用則誘導(dǎo)Lgr5+向杯狀細(xì)胞的分化。CHIR 和VPA 的組合促進(jìn)多種組織中上皮干細(xì)胞的增殖，而不是分化。VPA 抑制分泌細(xì)胞系的分化。IWP-2 和VPA 的組合特異性地誘導(dǎo)了腸細(xì)胞分化，可能的機(jī)制是，IWP-2 誘導(dǎo)了腸細(xì)胞分化，而VPA 抑制了Lgr5+干細(xì)胞向分泌細(xì)胞類型分化。同樣，DAPT 和CHIR 的組合主要誘導(dǎo)Paneth 細(xì)胞分化，而IWP-2 和DAPT 的組合主要誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞分化［3，31］。結(jié)腸隱窩細(xì)胞在培養(yǎng)第10-12 天開(kāi)始出現(xiàn)具有中央腔的單層上皮細(xì)胞和表現(xiàn)出出芽隱窩的結(jié)腸球，當(dāng)中央腔中出現(xiàn)黑色陰影即凋亡的上皮細(xì)胞，則可以進(jìn)行傳代處理。

5 結(jié)腸類器官模型的檢測(cè)

結(jié)腸類器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)可由HE（蘇木精-伊紅）、IHC（免疫組織化學(xué)染色）、AB（Alcian blue）染色，WB（Western blot）分析檢測(cè)。HE 染色可以見(jiàn)到出芽后的結(jié)腸類器官中內(nèi)腔的上皮和間質(zhì)充結(jié)構(gòu)域，在健康的結(jié)腸黏膜中有著簡(jiǎn)單且整齊的柱狀上皮，內(nèi)有中央腔結(jié)構(gòu)。同樣，IHC 染色后能夠在結(jié)腸類器官組織中見(jiàn)到β-catenin（β-連環(huán)蛋白）的膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核強(qiáng)烈表達(dá)，腸道發(fā)育以及維持上皮完整性有賴于β-catenin 和E-cadherin（上皮細(xì)胞鈣黏蛋白）之間的緊密結(jié)合［39］，而Wnt 通路的激活也與此緊密相關(guān)，β-catenin 的強(qiáng)表達(dá)表明結(jié)腸類器官具有高度的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。同時(shí)還可以見(jiàn)到散在分布的Mucin 2，Mucin 2 對(duì)腸黏膜起保護(hù)作用的。AB 能夠?qū)⑺嵝缘鞍拙厶侨緸樗{(lán)色，可以在結(jié)腸類器官中觀察到少量杯狀細(xì)胞和由杯狀細(xì)胞分泌的酸性、中性黏蛋白，這兩種黏蛋白構(gòu)成黏液層以保護(hù)結(jié)腸上皮屏障，免受細(xì)菌和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。緊密連接蛋白在一定程度上控制腸道的通透性，通過(guò)WB 分析可以在成功建立的結(jié)腸類器官模型中見(jiàn)到參與緊密連接的蛋白（Ocln、Tjp1、Cldn4 和Cldn8）均呈陽(yáng)性［40］。

結(jié)腸類器官的增殖活性可由IHC、PAS（Periodic Acid-Schiff stain）染色，免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析等檢測(cè)。其中PAS 染色可見(jiàn)到分化成熟的杯狀細(xì)胞；增殖標(biāo)記物KI67（一種增殖細(xì)胞的相關(guān)抗原）的IHC 染色，能夠見(jiàn)到結(jié)腸柱狀上皮中的細(xì)胞均勻增殖。在2017 年，MUNERA 等［41］研究者明確了SATB2 是人類小腸（回腸）和結(jié)腸上皮的典型標(biāo)志物，IHC 染色能夠觀察到結(jié)腸類器官上皮組織中SATB2 的表達(dá)。PAS 染色能夠顯示結(jié)腸上皮組織中CDX2 均勻且強(qiáng)烈的表達(dá)，CDX2 能夠平衡結(jié)腸組織的增殖與分化，還可以促進(jìn)上皮屏障和腸球體（SPH）的形成［19］。免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析能夠顯示結(jié)腸組織中關(guān)鍵再生相關(guān)標(biāo)記物（SCA1、ANXA1、REG3b 和CLU）的表達(dá)［3］。

結(jié)腸類器官的功能性屏障特性可通過(guò)以下幾種試驗(yàn)來(lái)測(cè)定：在結(jié)腸類器官出現(xiàn)出芽形態(tài)后，通過(guò)occludin 染色可突出顯示上皮細(xì)胞鵝卵石組織，向培養(yǎng)基中添加的熒光葡聚糖4 kDa 顯示缺乏通過(guò)腸屏障均可驗(yàn)證結(jié)腸類器官的腸屏障功能［42］；毛猴素腫脹試驗(yàn)亦可以測(cè)試結(jié)腸類器官的腸屏障功能以及生存力，在類器官中加入毛喉素以誘導(dǎo)膨脹，當(dāng)隨著水流入量的增加，類器官的大小也隨之增加時(shí)即表明此類器官是富有生命力的；MTT比色法可以測(cè)定腸上皮細(xì)胞的存活率以鑒定結(jié)腸類器官的細(xì)胞活力。

6 結(jié)腸類器官的應(yīng)用

HAHN 等［11］在2017 年首次建立了一種基于結(jié)腸類器官的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（OEMT）模型，這是一種新型的腸纖維化模型，該模型為研究具有抗纖維化活性的藥物帶來(lái)了可靠的體外模型，也為開(kāi)發(fā)基于人器官的腸纖維化模型搭建了橋梁；同年，潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的小鼠結(jié)腸類器官模型由HIBIYA 等［7］成功建立，該研究首次證實(shí)了用特定試劑誘導(dǎo)的長(zhǎng)期炎癥刺激引起的結(jié)腸類器官的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，對(duì)該體外模型的繼續(xù)研究為建立炎癥相關(guān)的癌變提供了基礎(chǔ)，人類患者來(lái)源的UC 類器官模型則由SARVESTANI 等［19］以及ALDEBERT 等［19］于2021 年分別建立，其中SARVESTANI 等［19］建立的模型以患者特異性的方式識(shí)別和理解腸上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞直接相互作用背后的潛在機(jī)制，解決了上皮類器官僅關(guān)注上皮，而不包括結(jié)腸炎中微環(huán)境的作用的問(wèn)題，具有研究人類UC 的上皮-間充質(zhì)和腸道微環(huán)境相互作用的優(yōu)勢(shì)；LI 等［43］在2019 年使用新生小鼠第9 天的結(jié)腸成功培育出新生兒腸上皮類器官，并將器官暴露于低氧和脂多糖（LPS）48 h 誘導(dǎo)了上皮損傷，這為研究新生兒期腸道生理、病理學(xué)以及新生兒期疾病過(guò)程［如壞死性結(jié)腸炎（NEC）］提供了離體平臺(tái)；據(jù)現(xiàn)有報(bào)道的小鼠和人結(jié)腸上皮細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)方案，可適用于原發(fā)性結(jié)腸腺瘤或腺癌以及Barrett 食管，這也將是癌類病生物學(xué)和藥物開(kāi)發(fā)的研究不可或缺的基石。

7 結(jié)語(yǔ)

以上總結(jié)了結(jié)腸類器官的培養(yǎng)體系，但目前針對(duì)結(jié)腸類器官培養(yǎng)的研究仍較少，還需要大量的有效實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)來(lái)驗(yàn)證結(jié)腸類器官的培養(yǎng)體系。2014 年，Hans Clever 實(shí)驗(yàn)室發(fā)表了小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)的方法和步驟，但對(duì)于結(jié)腸類器官體外培養(yǎng)條件和方法的描述仍比較籠統(tǒng)。此外，值得注意的是，小鼠與人類CXCL8（一種炎性趨化因子）沒(méi)有同源性，因此該軸在遺傳或化學(xué)誘導(dǎo)的小鼠模型中不存在，所以在研究UC 等炎癥性腸病的腸道類器官時(shí)，應(yīng)使用人類患者結(jié)腸干細(xì)胞衍生的UC 模型［19］。然而，IBD 患者來(lái)源的類器官是否保留了新鮮活檢樣本中發(fā)現(xiàn)的疾病特征尚未得到證實(shí)，這也為進(jìn)一步研究留下了空間。此外，大多數(shù)類器官培養(yǎng)物時(shí)使用的基質(zhì)膠是最常用的細(xì)胞外基質(zhì)，用于支持干細(xì)胞培養(yǎng)，但細(xì)胞外基質(zhì)是一種定義不清的異質(zhì)性蛋白質(zhì)混合物，這增加了培養(yǎng)類器官時(shí)未考慮的未知變量，可能會(huì)影響它們準(zhǔn)確再現(xiàn)體內(nèi)生理學(xué)的能力［6］。

雖然結(jié)腸類器官目前還存在一定的局限性，有待科研工作者進(jìn)一步的優(yōu)化，但是它擁有廣闊的應(yīng)用前景，相信隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，結(jié)腸類器官能夠達(dá)到以替換或修復(fù)患者的缺陷腸組織為主要目標(biāo)的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用，并且為結(jié)腸疾病開(kāi)發(fā)以腸上皮功能恢復(fù)和組織再生為目標(biāo)的治療方法研究提供可靠的臨床前研究模型。

【Author contributions】CHEN Jiaqi collected the literature and wrote the article.SHI Xiuli and HUANG Xueyun assisted in the collection of literature.WU Na revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.