王柯，葉寒露

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是導(dǎo)致老年患者殘疾的最常見退行性關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，以膝關(guān)節(jié)軟骨退變、破壞和骨質(zhì)增生為主要特征，治療方案包括手術(shù)和非手術(shù)兩種，且后者已成為近年研究的熱點(diǎn)［1］。研究顯示，青蒿素、大黃素等中藥單體治療KOA可取得良好療效［2］。大黃素是從大黃的根莖中分離出來的天然蒽醌類化合物，具有抗菌、抗癌和抗炎等多種藥理活性，可通過抗基質(zhì)降解途徑保護(hù)KOA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨［3］。目前，有關(guān)大黃素保護(hù)KOA 膝關(guān)節(jié)軟骨的作用機(jī)制尚不明確。鐵死亡是以鐵失衡和脂質(zhì)過氧化為特征的細(xì)胞死亡方式，在骨質(zhì)疏松癥等骨疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［4］。有研究認(rèn)為，抑制軟骨細(xì)胞鐵死亡、激活核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）通路活化可減輕KOA中軟骨細(xì)胞損傷［5］。大黃素能通過激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路來抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激［6］?；诖?，筆者推測大黃素可能通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路來抑制KOA 大鼠軟骨細(xì)胞鐵死亡，從而保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨。本研究通過構(gòu)建KOA大鼠模型并采用大黃素干預(yù)，觀察軟骨細(xì)胞鐵死亡變化及Nrf2/HO-1信號(hào)通路在此過程中的作用，從而探索大黃素治療KOA的分子機(jī)制，為大黃素用于KOA治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠96只，10～12周齡，體質(zhì)量（350±20）g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。所有大鼠在（25±1）℃、相對(duì)濕度60%～65%的環(huán)境下飼養(yǎng)，每天12 h 光照∶12 h 黑暗，自由攝食飲水。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循3R原則并經(jīng)過武漢市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2021005）。大黃素（美國Sigma 公司）；Nrf2 抑制劑ML385（美國MCE 公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA試劑盒（江西艾博因生物科技有限公司）；改良番紅O-固綠軟骨染色液（北京索萊寶科技有限公司）；原位末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、亞鐵離子（Fe2+）比色法測試盒和活性氧（reactive oxygen species，ROS）熒光法測試盒（DCFH-DA，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；兔抗鼠Ⅱ型膠原α1（collagen type Ⅱα1，COL2A1）抗體（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3 抗體、兔抗鼠MMP-13、兔抗鼠前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）抗體、兔抗鼠谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體、兔抗鼠Nrf2抗體、兔抗鼠甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、兔抗鼠Histone H3 抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG（英國Abcam 公司）；長鏈脂酰輔酶A 合成酶4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）、HO-1抗體（美國Invitrogen公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 模型構(gòu)建與分組干預(yù) 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后按隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)（Sham）組、KOA 組、大黃素（EMO）組、大黃素+Nrf2 抑制劑（EMO+ML385）組，每組24 只。除Sham 組外，其余組大鼠采用改良Hulth法構(gòu)建KOA模型［7］：大鼠仰臥位固定，麻醉后從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，將內(nèi)側(cè)副韌帶切斷，摘除內(nèi)側(cè)半月板，并切斷前交叉韌帶。Sham組僅打開關(guān)節(jié)腔，韌帶和半月板均保持完整。整個(gè)造模過程均保持無菌，術(shù)中實(shí)時(shí)監(jiān)測大鼠的呼吸和心率，術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射20萬U 青霉素。大鼠醒來后正常喂食飲水，并自由走動(dòng)。從造模第4周開始，EMO 組大鼠腹腔注射80 mg/kg 大黃素［3］；EMO+ML385 組大鼠腹腔注射80 mg/kg 大黃素和30 mg/kg ML385［8］；Sham 組、KOA 組分別注射等量生理鹽水和二甲基亞砜（dimethyl surfoxide，DMSO）的混合物（大黃素、ML385 均經(jīng)DMSO溶解后使用生理鹽水稀釋），1次/d，連續(xù)3周。

1.2.2 ELISA檢測血清TNF-α、NO、PGE2水平 各組大鼠麻醉后于腹主動(dòng)脈取血4 mL，3 500 r/min離心10 min，取上層血清并于-20 ℃冰箱保存。每組隨機(jī)取8 只大鼠的血清，參照ELISA 試劑盒說明書用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處光密度（OD）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線方程計(jì)算各組大鼠血清炎性因子TNF-α、NO、PGE2水平。

1.2.3 膝關(guān)節(jié)形態(tài)觀察 取血后處死大鼠，肉眼觀察患肢膝關(guān)節(jié)軟骨、滑膜的顏色、形態(tài)等大體情況。番紅O-固綠染色觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學(xué)變化：每組隨機(jī)取8只大鼠患肢膝關(guān)節(jié)并于4%多聚甲醛固定24 h，以10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脫鈣處理2周，脫水、透明后石蠟包埋并切片（厚度5 μm）。石蠟切片脫蠟至水，Weigent 染液染色5 min，酸性乙醇分化后固綠染液染色5 min，蒸餾水沖洗后Safranin O染液孵育2 min。在顯微鏡下觀察拍照（軟骨基質(zhì)呈紅色）。并根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨組織的結(jié)構(gòu)、著色程度及軟骨細(xì)胞的分布、壞死程度等進(jìn)行國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)（Osteoarthritis Research Society International，OARSI）評(píng)分［9］，總分越高膝關(guān)節(jié)炎程度越嚴(yán)重。

1.2.4 TUNEL染色檢測膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率 取1.2.3中制備的石蠟切片，脫蠟至水后添加蛋白酶K 于37 ℃孵育15 min，添加TUNEL 反應(yīng)混合液于37 ℃避光孵育1 h，DAPI染核，熒光顯微鏡觀察并采集圖像。隨機(jī)讀取6 個(gè)視野，Image J 軟件統(tǒng)計(jì)TUNEL 陽性染色細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞，呈紅色）和總細(xì)胞（呈藍(lán)色），計(jì)算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2 mRNA 表達(dá)水平 每組隨機(jī)取8只大鼠的患肢膝關(guān)節(jié)置于-80 ℃冰箱保存。取出每只大鼠部分膝關(guān)節(jié)軟骨，使用Trizol 試劑提取組織中總RNA 并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板配制反應(yīng)體系（20 μL）：50 mg/L cDNA 2 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，SYBR Green Mix 10 μL，無菌ddH2O 6 μL。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。獲取循環(huán)閾值（Ct 值）。以GAPDH 為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算MMP-3、MMP-13、COL2A1 及PTGS2 的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequence表1 引物序列

1.2.6 生化試劑盒檢測膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MDA、ROS、GSH、Fe2+水平 每組取剩余8只大鼠的患肢膝關(guān)節(jié)制備新鮮軟骨組織勻漿液，12 000 r/min 離心15 min 獲取上清液，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量蛋白濃度后，參照各自測試盒說明書，使用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)檢測MDA（波長532 nm）、ROS（激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長525 nm）及GSH（波長412 nm）、Fe2+（波長593 nm）水平。

1.2.7 免疫組化染色檢測膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、ACSL4陽性表達(dá) 取1.2.3中制備的膝關(guān)節(jié)軟骨組織行常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水后滴加3%過氧化氫以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，置于枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸以行抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉后滴加一抗GPX4（1∶100）、ACSL4（1∶500），4 ℃孵育過夜，滴加生物素標(biāo)記二抗（1∶4 000）37 ℃孵育1 h，DAB 試劑顯色，蘇木精染核。在顯微鏡下觀察拍照（陽性染色細(xì)胞呈棕褐色或棕黃色），使用Image J 軟件計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算陽性細(xì)胞比例。

1.2.8 蛋白免疫印跡檢測膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2、GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平 取出-80 ℃冰箱保存的剩余部分膝關(guān)節(jié)軟骨，使用RIPA裂解液提取組織中總蛋白，細(xì)胞核和質(zhì)提取試劑盒分離胞核和胞質(zhì)蛋白，BCA法定量蛋白濃度。每泳道上樣20 μg變性蛋白（20 μL）進(jìn)行凝膠電泳，切膠后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白封閉膜2 h，膜與一抗MMP-3（1∶2 000）、MMP-13（1∶3 000）、COL2A1（1∶1 500）及PTGS2、GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1、Histone H3（均1∶1 000）、GAPDH（1：10 000）4 ℃孵育過夜，與HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶5 000）37 ℃孵育45 min，化學(xué)發(fā)光試劑顯色。MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2、GPX4、ACSL4、胞質(zhì)Nrf2、HO-1 以GAPDH為內(nèi)參，胞核Nrf2 以Histone H3 為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像后使用Image J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、NO 以及PGE2 水平比較 與Sham 組比較，KOA 組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2 水平升高（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2 水平降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2水平升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum TNF-α,NO and PGE2 levels between the four groups of rats表2 各組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2水平比較（n=8,）

Tab.2 Comparison of serum TNF-α,NO and PGE2 levels between the four groups of rats表2 各組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2水平比較（n=8,）

＊＊P＜0.01；a與Sham 組比較，b與KOA 組比較，c與EMO 組比較，P＜0.05；表3—8同。

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2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)大體形態(tài)和軟骨組織病理形態(tài)學(xué) Sham組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，滑膜未見肥厚，軟骨細(xì)胞排列整齊、呈紅色染色，潮線清晰；KOA組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)則且粗糙有裂紋，滑膜明顯增厚，軟骨層變薄并出現(xiàn)裂隙樣破壞，存在肥大的軟骨細(xì)胞；EMO 組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面更加光滑，裂紋減少，滑膜增厚減輕，軟骨層變厚且裂隙樣破壞明顯改善；EMO+ML385 組大鼠關(guān)節(jié)軟骨破壞較EMO組加重，見圖1、2。與Sham 組比較，KOA 組大鼠OARSI 評(píng)分升高（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠OARSI 評(píng)分降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠OARSI 評(píng)分升高（P＜0.05），見表3。

Fig.1 General morphology of knee joint of rats in each group圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)大體形態(tài)

Fig.2 Pathological changes of knee joint cartilage tissue of rats in each group(safranine O-solid green staining,×200)圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學(xué)變化（番紅O-固綠染色，×200）

Tab.3 Comparison of OARSI score of knee joint cartilage and apoptosis rate of chondrocytes between the four groups of rats表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨OARSI評(píng)分和軟骨細(xì)胞凋亡率比較（n=8,）

Tab.3 Comparison of OARSI score of knee joint cartilage and apoptosis rate of chondrocytes between the four groups of rats表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨OARSI評(píng)分和軟骨細(xì)胞凋亡率比較（n=8,）

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2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況 與Sham組比較，KOA 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與KOA組比較，EMO組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見表3、圖3。

2.4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較 與Sham組比較，KOA 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平升高，COL2A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平降低，COL2A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平升高，COL2A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of MMP-3,MMP-13,COL2A1 and PTGS2 mRNA relative expression levels in knee joint cartilage between the four groups of rats表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(n=8,)

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2.5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MDA、ROS、GSH、Fe2+水平比較 與Sham 組比較，KOA 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MDA、ROS、Fe2+水平升高，GSH 水平降低（P＜0.05）；與KOA組比較，EMO組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MDA、ROS、Fe2+水平降低，GSH 水平升高（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MDA、ROS、Fe2+水平升高，GSH 水平降低（P＜0.05），見表5。

Tab.5 Comparison of MDA,ROS,GSH and Fe2+levels in knee joint cartilage of rats between the four groups表5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MDA、ROS、GSH、Fe2+水平比較（n=8，）

Tab.5 Comparison of MDA,ROS,GSH and Fe2+levels in knee joint cartilage of rats between the four groups表5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MDA、ROS、GSH、Fe2+水平比較（n=8，）

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2.6 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、ACSL4 陽性細(xì)胞比例比較 Sham 組可見大量呈棕褐色或棕黃色的GPX4 陽性細(xì)胞，少量呈棕褐色或棕黃色的ACSL4 陽性細(xì)胞；與Sham 組比較，KOA 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4 陽性細(xì)胞比例降低，ACSL4 陽性細(xì)胞比例升高（P＜0.05）；與KOA組比較，EMO組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4 陽性細(xì)胞比例升高，ACSL4 陽性細(xì)胞比例降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4 陽性細(xì)胞比例降低，ACSL4 陽性細(xì)胞比例升高（P＜0.05），見表6、圖4。

Tab.6 Comparison of the proportion of GPX4 and ACSL4 positive cells in knee joint cartilage between the four groups of rats表6 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、ACSL4陽性細(xì)胞比例比較（n=8，%，）

Tab.6 Comparison of the proportion of GPX4 and ACSL4 positive cells in knee joint cartilage between the four groups of rats表6 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、ACSL4陽性細(xì)胞比例比較（n=8，%，）

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2.7 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與Sham組比較，KOA 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，COL2A1蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，COL2A1蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，COL2A1蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖5、表7。

Fig.5 Protein expression of MMP-3,MMP-13,COL2A1 and PTGS2 in knee joint cartilage of rats in each group圖5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2蛋白表達(dá)

Tab.7 Comparison of the protein relative expression levels of MMP-3,MMP-13,COL2A1 and PTGS2 in knee joint cartilage between the four groups of rats表7 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（n=8,）

Tab.7 Comparison of the protein relative expression levels of MMP-3,MMP-13,COL2A1 and PTGS2 in knee joint cartilage between the four groups of rats表7 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（n=8,）

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2.8 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與Sham 組比較，KOA 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、胞質(zhì)Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，ACSL4、胞核Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、胞核Nrf2、HO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，ACSL4、胞質(zhì)Nrf2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、胞核Nrf2、HO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，ACSL4、胞質(zhì)Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖6、表8。

Tab.8 Comparison of the protein relative expression levels of GPX4,ACSL4,Nrf2 and HO-1 in knee joint cartilage of rats between the four groups表8 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（n=8,）

Tab.8 Comparison of the protein relative expression levels of GPX4,ACSL4,Nrf2 and HO-1 in knee joint cartilage of rats between the four groups表8 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（n=8,）

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3 討論

KOA 為一種退行性慢性關(guān)節(jié)疾病，主要損害關(guān)節(jié)軟骨，導(dǎo)致關(guān)節(jié)周圍疼痛、腫脹和僵硬，是誘發(fā)殘疾主要原因，且隨著人口老齡化和肥胖患病率的增加，其患病率亦逐漸升高［10］。研究顯示，大黃素在體外和體內(nèi)均可通過抑制NF-κB 和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路改善KOA 中軟骨退化［11］。大黃素通過抑制ERK 和Wnt/β-catenin 通路下調(diào)軟骨細(xì)胞中一系列炎癥介質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖［12］。大黃素可減少軟骨基質(zhì)的降解，保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨［4］。此外，炎癥反應(yīng)在KOA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，受損的軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞可在炎性因子誘導(dǎo)下釋放炎性介質(zhì)和酶類等，從而加速軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解和軟骨損傷、退化，故KOA發(fā)生時(shí)表現(xiàn)為軟骨組織、關(guān)節(jié)液及血清中炎性介質(zhì)均呈高水平［13-14］。本研究結(jié)果顯示，KOA 模型大鼠血清炎性介質(zhì)（TNF-α、NO、PGE2）水平以及膝關(guān)節(jié)軟骨組織OARSI評(píng)分、ECM降解酶（MMP-3、MMP-13）mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)水平較Sham 組升高，同時(shí)軟骨細(xì)胞分泌的ECM 主要成分COL2A1 的mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，且膝關(guān)節(jié)軟骨明顯破壞；而大黃素可降低KOA 大鼠血清TNF-α、NO、PGE2 水平以及OARSI 評(píng)分，抑制MMP-3、MMP-13表達(dá)并促進(jìn)COL2A1表達(dá)，同時(shí)明顯改善膝關(guān)節(jié)軟骨破壞，表明大黃素可減輕炎癥反應(yīng)，緩解軟骨基質(zhì)降解，進(jìn)而對(duì)KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨發(fā)揮保護(hù)作用，與既往研究結(jié)果［4,11-12］相一致。

軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞組成成分，主要通過平衡ECM的合成和降解來維持軟骨的完整，故軟骨細(xì)胞損傷是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中的一個(gè)重要問題。研究表明，軟骨細(xì)胞鐵死亡可促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展［15］。在鐵死亡途徑中，鐵依賴性的MDA等脂質(zhì)過氧化物的生成、細(xì)胞內(nèi)GSH消耗和ROS的蓄積是鐵死亡的必要條件和基本特征，PTGS2、GPX4、ACSL4等是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［16］。本研究結(jié)果顯示，KOA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率以及組織中MDA、ROS、Fe2+水平、PTGS2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)、ACSL4 陽性細(xì)胞比例和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高，同時(shí)GSH水平、GPX4陽性細(xì)胞比例和蛋白表達(dá)水平降低，表明本研究構(gòu)建的KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。大黃素干預(yù)治療后，KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率及MDA、ROS、Fe2+水平和PTGS2、ACSL4表達(dá)均降低，同時(shí)GSH水平、GPX4表達(dá)升高，表明大黃素對(duì)KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞鐵死亡具有一定改善作用，提示大黃素可能通過抑制KOA 大鼠軟骨細(xì)胞鐵死亡，減輕膝關(guān)節(jié)軟骨退化，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨作用。李哲等［17］通過生物信息學(xué)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證亦發(fā)現(xiàn)，靶向抑制鐵死亡或許是一種較快且有效延緩骨關(guān)節(jié)炎中軟骨退變的方法。

研究表明，藥用植物及其次級(jí)代謝產(chǎn)物可通過NF-κB、Nrf2等信號(hào)通路以及細(xì)胞凋亡、焦亡和鐵死亡等細(xì)胞死亡模式，發(fā)揮抗KOA作用［18］。Nrf2/HO-1 信號(hào)通路是機(jī)體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要信號(hào)通路，正常情況下，Nrf2 與其抑制蛋白Keap1 以二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，而當(dāng)其受到外界不利環(huán)境刺激后，Nrf2與Keap1解離活化，進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)SOD、HO-1 等Nrf2 下游：靶基因表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用［19］。研究顯示，激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路能夠保護(hù)滑膜細(xì)胞并減輕KOA［20］。此外，激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路能夠抑制2型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥中高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞鐵死亡［21］。本研究中，KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中胞核Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，同時(shí)胞質(zhì)Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，表明KOA 發(fā)生后Nrf2/HO-1 信號(hào)通路被激活，緩解了膝關(guān)節(jié)軟骨組織氧化應(yīng)激損傷，但其抗氧化應(yīng)激能力有限，所以膝關(guān)節(jié)軟骨組織仍存在較嚴(yán)重的病理損傷。大黃素干預(yù)治療后，KOA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中胞核Nrf2、HO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)一步升高，同時(shí)胞質(zhì)Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)一步降低，表明大黃素可能通過促進(jìn)KOA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Nrf2/HO-1信號(hào)通路激活，抑制軟骨細(xì)胞鐵死亡。另有文獻(xiàn)報(bào)道，大黃素通過激活Nrf2/HO-1 通路減輕炎癥和氧化應(yīng)激，保護(hù)敗血癥相關(guān)的腸黏膜屏障損傷［22］。ML385 既是Nrf2 的特異性抑制劑，也是鐵死亡的激活劑［23］。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ML385可抑制Nrf2/HO-1 通路激活，減弱大黃素對(duì)KOA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷和軟骨細(xì)胞鐵死亡的改善作用。以上這些結(jié)果表明，大黃素可能通過激活Nrf2/HO-1 通路抑制軟骨細(xì)胞鐵死亡，保護(hù)KOA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨。

綜上所述，大黃素可抑制KOA大鼠軟骨細(xì)胞鐵死亡，保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2/HO-1 信號(hào)通路激活有關(guān)。大黃素是一種很有前景的預(yù)防和治療KOA的藥物，但本研究僅通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步驗(yàn)證，后續(xù)將就軟骨組織和關(guān)節(jié)液中炎性介質(zhì)水平等進(jìn)行深入分析。