劉宏偉，朱奕，向玲寶，熊洪，陳瑞琦

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，具有較高的病死率和復(fù)發(fā)率。然而，膀胱癌缺乏可靠的腫瘤標(biāo)志物，并且其進展的分子機制尚未完全闡明。目前已發(fā)現(xiàn)大量miRNA在膀胱癌中表達失調(diào)，影響腫瘤增殖、侵襲、血管生成等過程，其有成為膀胱癌早期診斷標(biāo)志物的巨大潛力［1］。研究表明，miR-338-5p 在人類多種癌癥中表達失調(diào)［2-4］。然而，miR-338-5p 在膀胱癌中的作用和機制尚未闡明。本研究通過檢測miR-338-5p在膀胱癌中的表達，并通過細(xì)胞實驗闡明miR-338-5p在膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人輸尿管上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1 和人膀胱癌細(xì)胞T24 和UM-UC-3 均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。miR-338-5p mimics和miR-338-5p inhibitor購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；TSHZ3過表達質(zhì)粒（以GV712為載體）購自上海吉凱基因有限公司；F-12K、RPMI-1640 和DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；胎牛血清購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine RNAimax 轉(zhuǎn)染試劑和Trizol 試劑購自美國Invitrogon公司；X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；CCK-8試劑購自日本同仁公司；Transwell小室購自美國BD 公司；PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green premix Ex Taq 試劑盒購自TaKaRa 公司；miRNA 熒光定量PCR試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司；SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TSHZ3、Wnt3a、β-catenin、GAPDH 和β-actin抗體購自美國proteintech公司。

1.2 組織標(biāo)本 收集2019 年9 月—2022 年9 月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行根治性膀胱切除術(shù)的33例膀胱癌患者的癌組織和癌旁組織。組織標(biāo)本取出后立即置于液氮中保存，所有癌組織均經(jīng)病理醫(yī)師診斷為膀胱尿路上皮癌。患者均簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 SV-HUC-1 細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的F-12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)，T24細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，UM-UC-3細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。轉(zhuǎn)染時，提前將2×105個T24 細(xì)胞或1.5×105個UM-UC-3 細(xì)胞接種至6 孔板內(nèi)，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書將miR-338-5p mimics、miR-338-5p inhibitor、TSHZ3 過表達質(zhì)粒和各自的對照組（mimics-NC、inhibitor-NC、vector）分別轉(zhuǎn)染至T24和UM-UC-3細(xì)胞中，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 RNA 提取和qRT-PCR 將SV-HUC-1、T24 和UMUC-3細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期提取各細(xì)胞系的RNA。T24 和UM-UC-3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，收集各組細(xì)胞，提取RNA。分別將膀胱癌組織和癌旁組織研磨，提取RNA。將以上提取的RNA測定濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miRNA 的反轉(zhuǎn)錄采用加尾法。miR-338-5p 引物：上游5'-ACGGTACTAACAATATCCTGG-3'，下游引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。內(nèi)參采用U6，U6引物：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH 引物：上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40 個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt計算各基因相對表達量。

1.3.3 CCK-8 實驗 將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的T24 和UM-UC-3 細(xì)胞分別接種至96 孔板內(nèi)，每孔1 000 個細(xì)胞，每組設(shè)置4個復(fù)孔。分別在第1、2、3、4、5天同一時間向每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。在酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.4 Transwell 遷移實驗 收集轉(zhuǎn)染24 h 后處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，離心后用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸為單個細(xì)胞并計數(shù)。在24孔板下室加入600 μL血清含量為20%的完全培養(yǎng)基，將Transwell 小室置于24孔內(nèi)，在小室內(nèi)加入200 μL 含8×104個細(xì)胞的重懸液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后取出，采用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，待小室干燥后在顯微鏡下隨機讀取3個視野拍照并計數(shù)。

1.3.5 Transwell侵襲實驗 提前將凍存于-20 ℃的基質(zhì)膠置于4 ℃解凍。次日，按照基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)基1∶5 的體積比配成稀釋液，Transwell 小室置于24 孔板內(nèi)，吸取50 μL 的基質(zhì)膠稀釋液鋪于小室內(nèi)，然后將24 孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)2～3 h使基質(zhì)膠稀釋液凝固，后續(xù)實驗步驟同Transwell遷移實驗。

1.3.6 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?采用TargetScan、miRDB和Targetminer 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-338-5p 潛在的靶基因，選定靶基因TSHZ3。構(gòu)建miR-338-5p與TSHZ3的雙螢光素酶報告基因載體，將含有與miR-338-5p結(jié)合位點的TSHZ3 3'-非翻譯區(qū)（UTR）的野生型序列和突變型序列分別插入GPmiRGLO質(zhì)粒中，構(gòu)建TSHZ3野生型質(zhì)粒（TSHZ3-wt）和突變型質(zhì)粒（TSHZ3-mut）。然后將2 種質(zhì)粒分別與miR-338-5p mimics共轉(zhuǎn)染至膀胱癌細(xì)胞中。24 h后收集細(xì)胞，按照說明書操作要求，使用帶有化學(xué)發(fā)光檢測的酶標(biāo)儀檢測螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的發(fā)光信號強度，根據(jù)測得值進行統(tǒng)計分析。

1.3.7 Western blot 實驗 收集轉(zhuǎn)染后48 h 的細(xì)胞并提取各組總蛋白，測量蛋白濃度并加熱變性。制備SDS-PAGE 凝膠，將30 μg總蛋白加入上樣孔內(nèi)，恒壓電泳2 h，然后恒流轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉1 h。在4 ℃條件下孵育一抗（TSHZ3、Wnt3a 抗體濃度為1∶1 000，β-catenin、GAPDH 和β-actin 抗體濃度為1∶10 000）過夜，次日孵育二抗1 h并進行化學(xué)反應(yīng)曝光，使用Image J 軟件進行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 上述實驗均重復(fù)3 次。實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 作圖，SPSS 21.0 進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett 法；2 組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-338-5p 在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達 miR-338-5p 在膀胱癌組織中的表達量高于癌旁組織（2.99±1.65vs. 1.29±0.22，n=33，t=5.220，P＜0.01）。

2.2 miR-338-5p 在正常輸尿管上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中的表達 miR-338-5p 在膀胱癌T24 和UMUC-3 細(xì)胞中的表達高于其在輸尿管上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1中的表達，見圖1。

Fig.1 The expression of miR-338-5p in normal urothelial cells and bladder cancer cells圖1 miR-338-5p在正常輸尿管上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中的表達

2.3 過表達和敲低miR-338-5p的轉(zhuǎn)染效率 膀胱癌T24 和UM-UC-3 細(xì)胞中miR-338-5p mimics 組miR-338-5p 的相對表達量是mimics-NC 組的（5.75±0.48）倍和（6.04±0.33）倍，見圖2A。而轉(zhuǎn)染miR-338-5p inhibitor 后，與inhibitor-NC 相比，miR-338-5p的表達水平下調(diào)，見圖2B。

Fig.2 Transfection efficiency of overexpression and inhibition of miR-338-5p圖2 過表達和敲低miR-338-5p的轉(zhuǎn)染效率

2.4 過表達和敲低miR-338-5p對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示，與mimics-NC組相比，過表達miR-338-5p后T24和UM-UC-3細(xì)胞的增殖能力提高；轉(zhuǎn)染miR-338-5p inhibitor 后細(xì)胞的增殖能力下降（P＜0.05）。見圖3、4。

Fig.3 Effect of overexpression of miR-338-5p on cell proliferation detected by CCK-8 assay圖3 CCK-8檢測過表達miR-338-5p對細(xì)胞增殖的影響

Fig.4 Effect of inhibition of miR-338-5p on cell proliferation detected by CCK-8 assay圖4 CCK-8檢測抑制miR-338-5p表達對細(xì)胞增殖的影響

2.5 過表達和敲低miR-338-5p對膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 Transwell 遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，miR-338-5p mimics組膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均高于mimics-NC 組；轉(zhuǎn)染miR-338-5p inhibitor 后膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)較inhibitor-NC組減少（P＜0.05）。見表1，圖5、6。

Tab.1 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the four groups表1 各組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較（n=3，個/視野，）

Tab.1 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the four groups表1 各組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較（n=3，個/視野，）

＊＊P＜0.01。

?

Fig.5 Effects of overexpression of miR-338-5p on migration and invasion of bladder cancer cells(crystal violet staining,×200)圖5 過表達miR-338-5p對膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig.6 Effects of inhibition of miR-338-5p on migration and invasion of bladder cancer cells(crystal violet staining,×200)圖6 抑制miR-338-5p表達對膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

2.6 miR-338-5p 與TSHZ3 3'-UTR 的潛在結(jié)合位點 篩選出TSHZ3 可能為miR-338-5p 的潛在靶基因。TargetScan 預(yù)測miR-338-5p 與靶基因TSHZ3的3'-UTR的結(jié)合位點，見圖7。

Fig.7 Nucleotide sequences complementary to miR-338-5p in the 3'-UTR of TSHZ3圖7 TSHZ3的3'-UTR與miR-338-5p互補的核苷酸序列

2.7 miR-338-5p 對TSHZ3 的靶向調(diào)控作用 將構(gòu)建的TSHZ3-wt 和TSHZ3-mut 分別與miR-338-5p mimics 共轉(zhuǎn)染T24 和UM-UC-3 細(xì)胞。雙螢光素酶報告基因結(jié)果顯示，miR-338-5p mimics能夠降低野生型TSHZ3質(zhì)粒的螢光素酶活性（P＜0.05），然而不能降低突變型TSHZ3 質(zhì)粒的螢光素酶活性（P＞0.05），見表2。過表達miR-338-5p可降低膀胱癌細(xì)胞中TSHZ3 mRNA和蛋白水平，見圖8、9。

Tab.2 Comparison of the luciferase activity between the two groups表2 各組螢光素酶活性比較 （n=3，）

Tab.2 Comparison of the luciferase activity between the two groups表2 各組螢光素酶活性比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01。

?

Fig.8 Effect of overexpression of miR-338-5p on TSHZ3 mRNA expression圖8 過表達miR-338-5p對TSHZ3 mRNA表達的影響

Fig. 9 Effect of overexpression of miR-338-5p on TSHZ3 protein level圖9 過表達miR-338-5p對TSHZ3蛋白水平的影響

2.8 過表達TSHZ3 減弱miR-338-5p 的促癌作用 細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，與SV-HUC-1 細(xì)胞相比，T24 和UM-UC-3 細(xì)胞TSHZ3 mRNA 表達水平也顯著降低（P＜0.05），見圖10。功能挽救實驗顯示，相較于mimics-NC組，過表達miR-338-5p能夠提高膀胱癌細(xì)胞的增殖能力，同時過表達TSHZ3 部分抵消了miR-338-5p 對膀胱癌細(xì)胞增殖的促進作用（P＜0.05），見圖11。同時轉(zhuǎn)染miR-338-5p mimics 和過表達TSHZ3 組細(xì)胞的遷移和侵襲能力較miR-338-5p mimics組明顯降低（P＜0.05），見表3、圖12。

Tab.3 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the three groups表3 各組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較（n=3，個/視野，）

Tab.3 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the three groups表3 各組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較（n=3，個/視野，）

＊＊P＜0.01；a 與mimics-NC 組比較，b 與miR-338-5p mimics 組比較，P＜0.05。

?

Fig.10 The mRNA expression of TSHZ3 in normal urothelial cells andbladder cancer cells圖10 TSHZ3 mRNA在正常輸尿管上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中的表達

Fig.11 Cell viability detected by CCK-8 assay in each group圖11 CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖活力

Fig.12 Migration and invasion of each group of cells(crystal violet staining,×200)圖12 各組細(xì)胞遷移侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

2.9 過表達miR-338-5p對Wnt/β-catenin信號通路的影響 Western blot 結(jié)果表明，與mimics-NC 組相比，過表達miR-338-5p 增加膀胱癌UM-UC-3 細(xì)胞中Wnt3a（0.78±0.03vs.1.21±0.05，n=3，t=12.874，P＜0.01）和β-catenin（0.88±0.02vs. 1.25±0.06，n=3，t=10.979，P＜0.01）蛋白表達水平，見圖13。

Fig.13 Effect of overexpression of miR-338-5p on the protein level of Wnt3a and β-catenin圖13 過表達miR-338-5p對Wnt3a和β-catenin蛋白水平的影響

2.10 過表達TSHZ3對Wnt/β-catenin信號通路的影響 在膀胱癌UM-UC-3 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TSHZ3 過表達質(zhì)粒，Western blot結(jié)果顯示，與vector組相比，Wnt3a（0.82±0.05vs. 0.51±0.04，n=3，t=8.138，P＜0.01）和β-catenin（0.94±0.03vs.0.75±0.07，n=3，t=4.409，P＜0.05）蛋白水平降低，見圖14。

Fig.14 Effect of overexpression of TSHZ3 on the protein level of Wnt3a and β-catenin圖14 過表達TSHZ3對Wnt3a和β-catenin蛋白水平的影響

3 討論

膀胱癌與高齡、吸煙、接觸化學(xué)致癌物、職業(yè)暴露和環(huán)境污染等多種因素相關(guān)，具有較高的復(fù)發(fā)率和進展率［5］。研究表明，癌基因的激活或者抑癌基因的失活與膀胱癌的發(fā)生及進展密切相關(guān)［6］。miRNA 是一種長度為20～22 個核苷酸的非編碼RNA，其表達失調(diào)與惡性腫瘤的增殖、遷移、侵襲、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)［7］。因此，闡明膀胱癌中關(guān)鍵miRNA的作用和機制，探索新的潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點具有重要的臨床意義。

3.1 miR-338-5p 在腫瘤中的表達及作用 研究表明，miR-338-5p在肺癌［2］、食管癌［8］和胃癌［9］中表達下調(diào)，在膠質(zhì)瘤［3］、惡性黑色素瘤［10］、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤［11］和結(jié)直腸癌［4］中表達上調(diào)。本研究首先檢測了miR-338-5p 在膀胱癌中的表達，qRT-PCR 結(jié)果顯示miR-338-5p 在膀胱癌中呈高表達。細(xì)胞功能實驗表明過表達miR-338-5p 可促進膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，敲低miR-338-5p 表達抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。TSHZ3 基因能夠編碼一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，課題組前期研究證實TSHZ3 在膀胱癌中低表達并抑制細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲［12］。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-338-5p 與TSHZ3 的3'-UTR 存在潛在結(jié)合位點。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，在膀胱癌細(xì)胞中，與mimics-NC+TSHZ3-wt 組相比，miR-338-5p mimics+TSHZ3-wt 組的螢光素酶活性下降。Western blot結(jié)果顯示，過表達miR-338-5p可降低膀胱癌細(xì)胞中TSHZ3蛋白水平，表明miR-338-5p 對TSHZ3 具有靶向負(fù)調(diào)控作用。挽救實驗表明，過表達TSHZ3 部分抵消了miR-338-5p對膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進作用，提示miR-338-5p 通過抑制TSHZ3 的表達促進膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

3.2 miR-338-5p及TSHZ3對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用 研究表明，在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-338-5p 模擬物，lncRNA MBNL1-AS1 對細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用以及對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用減弱，說明miR-338-5p 通過調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路促進Y79細(xì)胞的增殖和遷移［11］。Yao 等［13］研究發(fā)現(xiàn)miR-338-5p能夠通過調(diào)控Wnt8/β-catenin通路促進胰腺癌細(xì)胞的干性和進展。本研究證實，過表達miR-338-5p可上調(diào)膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞內(nèi)Wnt3a和βcatenin 蛋白表達水平，提示miR-338-5p 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究進一步探討了miR-338-5p 下游靶基因TSHZ3 對Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白的作用，結(jié)果顯示過表達TSHZ3可抑制Wnt3a和βcatenin 蛋白表達，說明TSHZ3 在膀胱癌內(nèi)發(fā)揮抑癌作用可能與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

綜上所述，miR-338-5p 在膀胱癌中高表達，miR-338-5p 通過抑制TSHZ3 的表達促進膀胱癌的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與激活Wnt/βcatenin信號通路有關(guān)，這為miR-338-5p作為膀胱癌潛在治療靶點提供了理論基礎(chǔ)。