齊 鑫，荀德旭，馮舒琪，高 娜，侯思宇，盧雨青，黃 蘭，陳佳佳

(蘇州科技大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 江蘇 蘇州 215011)

胃癌是起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查顯示，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率位列第5，死亡率位列第4，對(duì)患者的身體健康和生命安全帶來(lái)嚴(yán)重的威脅[1]。胃癌患者常出現(xiàn)胃灼熱、反酸和其他常見(jiàn)慢性腸胃道疾病相似癥狀，在早期難以察覺(jué)。盡管近年來(lái)胃癌的研究和治療手段取得了重要的進(jìn)展，但是胃癌的致病機(jī)制尚未十分明確，晚期患者的5 年總體生存率低，對(duì)胃癌患者進(jìn)行有效的治療仍面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[2]。因此，研發(fā)新的藥物有助于優(yōu)化胃癌的治療方案。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展以及生物數(shù)據(jù)和醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)的飛躍式增長(zhǎng)，藥物重定位已逐漸成為一種發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有藥物新適應(yīng)癥的高效策略，可以加快新藥研發(fā)的進(jìn)程。其中基于計(jì)算的藥物重定位方法通過(guò)系統(tǒng)識(shí)別潛在的藥物-靶點(diǎn)和藥物-疾病之間的相互作用，可大大降低傳統(tǒng)藥物研發(fā)的成本、周期和風(fēng)險(xiǎn)[3]。關(guān)聯(lián)圖譜(connectivity map,CMap)數(shù)據(jù)庫(kù)存儲(chǔ)了不同濃度和時(shí)間點(diǎn)對(duì)癌癥細(xì)胞系進(jìn)行小分子藥物處理后獲得的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，為探索由小分子化合物引發(fā)的基因表達(dá)變化特征，揭示小分子化合物、基因以及疾病狀態(tài)之間的聯(lián)系提供了重要的研究平臺(tái)[4]。目前，基于CMap 的計(jì)算藥物重定位方法已被生物學(xué)家及醫(yī)藥工作者廣泛應(yīng)用于癌癥治療藥物的篩選和研發(fā)。

本研究利用基于CMap 的藥物重定位策略篩選治療胃癌的小分子化合物并預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)。首先，利用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌腫瘤組織和正常對(duì)照組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，確定與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，并基于CMap 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選治療胃癌的候選藥物。然后，利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network, PPIN)鑒定關(guān)鍵的樞紐基因，并利用分子對(duì)接預(yù)測(cè)候選藥物與樞紐基因的結(jié)合能力來(lái)預(yù)測(cè)藥物的靶點(diǎn)；進(jìn)一步，利用生物信息學(xué)方法對(duì)潛在靶點(diǎn)的表達(dá)模式、診斷和預(yù)后性能進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的獲取

在NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中，下載與胃癌相關(guān)的3 組基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE54129、GSE65801和GSE26899。其中，GSE54129 數(shù)據(jù)集的平臺(tái)為GPL570，包含111 例胃癌組織樣本和21 例正常對(duì)照組織樣本；GSE65801 數(shù)據(jù)集的平臺(tái)為GPL14550，包含32 例胃癌組織樣本和32 例配對(duì)的正常對(duì)照組織樣本；GSE26899 數(shù)據(jù)集的平臺(tái)為GPL6947，包含96 例胃癌組織樣本和12 例正常對(duì)照組織樣本。

1.2 差異表達(dá)基因的鑒定

使用“Limma”R 包鑒定在胃癌組織和正常對(duì)照組織樣本之間顯著差異表達(dá)的基因[5]，鑒定標(biāo)準(zhǔn)為|log2(fold change)|≥1 且校正后的P＜0.05。進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)繪制韋恩圖，篩選在上述3 個(gè)數(shù)據(jù)集中均上調(diào)表達(dá)或下調(diào)表達(dá)的基因。

1.3 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

利 用“clusterProfiler”R 包[6]，對(duì) 在3 個(gè) 數(shù) 據(jù)集中重疊的差異表達(dá)基因分別進(jìn)行基因本體論(gene ontology, GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，探究差異表達(dá)基因顯著富集的條目(校正后的P值小于0.05)。

1.4 利用CMap 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)治療胃癌的候選小分子藥物

將在GSE54129、GSE65801 和GSE26899 這3個(gè)數(shù)據(jù)集中均顯著上調(diào)的基因和均顯著下調(diào)基因上傳到CMap 數(shù)據(jù)庫(kù)中的“Query”模塊進(jìn)行分析[7]。結(jié)果文件中，連通度分?jǐn)?shù)(connectivity score)表示胃癌相關(guān)基因的表達(dá)特征與CMap 中收錄的小分子化合物之間的相關(guān)性。連通度分?jǐn)?shù)越接近-100，表示藥物的治療潛力越大。本研究選擇連通度分?jǐn)?shù)小于-80 作為篩選治療胃癌候選小分子化合物的閾值。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用分析

利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)3 個(gè)數(shù)據(jù)集中重疊差異表達(dá)基因之間的相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，置信分?jǐn)?shù)(confidence score)代表蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)弱[8]。本研究以置信分?jǐn)?shù)大于0.400 為閾值篩選可靠的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，并構(gòu)建PPIN。進(jìn)一步，使用Cytoscape 軟件(3.6.1 版本)[9]進(jìn)行PPIN 的可視化和拓?fù)湫再|(zhì)分析，鑒定連接度(degree)值排名前10%的結(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的樞紐結(jié)點(diǎn)。

1.6 候選藥物分子和潛在靶點(diǎn)的分子對(duì)接

為了探究候選藥物的作用靶點(diǎn)，利用AutoDock 軟件(4.2.6 版本)[10]對(duì)PPIN 中樞紐基因編碼的蛋白質(zhì)與候選藥物進(jìn)行分子對(duì)接。具體地，在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)[11]中分別檢索和下載PPIN 中樞紐基因編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)文件，同時(shí)在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)[12]中搜索和下載候選藥物的三維結(jié)構(gòu)文件。進(jìn)一步，在對(duì)蛋白質(zhì)和藥物配體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理之后，利用AutoDock 軟件對(duì)候選藥物和蛋白質(zhì)進(jìn)行分子對(duì)接，每一個(gè)蛋白質(zhì)與相應(yīng)藥物要進(jìn)行50 次對(duì)接，選出結(jié)合能最低的對(duì)接結(jié)果。當(dāng)結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol 時(shí)，表明配體和受體具有較好的結(jié)合活性。使用Pymol 軟件對(duì)親和力最佳的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化和分析[13]。

1.7 生存分析

為了探究潛在藥物靶點(diǎn)的預(yù)后價(jià)值，對(duì)其與胃癌患者生存時(shí)間的相關(guān)性進(jìn)行分析。具體地，使用在線工具Kaplan-Meier plotter[14]，分析靶點(diǎn)基因高表達(dá)組和低表達(dá)組之間生存時(shí)間(包括總體生存期和無(wú)進(jìn)展生存期)是否存在顯著的差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)上，使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(P＜0.05)來(lái)評(píng)估兩組間生存時(shí)間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的差異表達(dá)基因

使用“Limma”R 軟件包分別對(duì)3 個(gè)數(shù)據(jù)集GSE54129、GSE26899 和GSE65801 中腫瘤組織和正常對(duì)照組織樣本間差異表達(dá)的基因進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，以|log2(fold change)|≥1 和校正后的P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在GSE54129、GSE26899 和GSE65801數(shù)據(jù)集中分別鑒定了2 533、521 和2 403 個(gè)差異表達(dá)基因(圖1a～圖1c)。值得注意的是，76 個(gè)上調(diào)基因和127 個(gè)下調(diào)基因在3 個(gè)數(shù)據(jù)集中均顯著差異表達(dá)(圖1d～圖1e)，表明這些基因在胃癌致病過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。

圖1 差異表達(dá)基因的鑒定

2.2 差異表達(dá)基因的功能注釋

為了進(jìn)一步研究上述3 個(gè)胃癌數(shù)據(jù)集中重疊差異表達(dá)基因的功能，使用“clusterProfiler”R 包分別進(jìn)行了GO 功能富集分析和KEGG 代謝通路富集分析。如圖2a 所示，重疊的差異表達(dá)基因在細(xì)胞外基質(zhì)組織(extracellular matrix organization)、組織穩(wěn)態(tài)(tissue homeostasis)和激素代謝過(guò)程(hormone metabolic process)等生物過(guò)程條目顯著富集，在含膠原蛋白的胞外基質(zhì)(collagen-containing extracellular matrix)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(endoplasmic reticulum lumen)等細(xì)胞組分條目顯著富集，在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分(extracellular matrix structural constituent)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)等分子功能條目顯著富集。KEGG 結(jié)果也顯示重疊的差異表達(dá)基因在蛋白質(zhì)的消化吸收(Protein digestion and absorption)、藥物代謝-細(xì)胞色素P450 通路(Drug metabolismcytochrome P450)和細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用(ECM-receptor interaction)等與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的代謝通路顯著富集，如圖2b 所示。

圖2 差異表達(dá)基因的GO 功能富集分析和KEGG 代謝通路富集分析

2.3 候選小分子藥物的篩選

為了探索治療胃癌的候選小分子藥物，本研究采用CMap 在線分析工具對(duì)胃癌相關(guān)基因表達(dá)特征與小分子藥物之間的聯(lián)系進(jìn)行了分析。具體地，通過(guò)將重疊的76 個(gè)上調(diào)基因和127 個(gè)下調(diào)基因上傳到CMap 數(shù)據(jù)庫(kù)，以連接分?jǐn)?shù)＜-80 分為標(biāo)準(zhǔn)，鑒定了10 種治療胃癌的候選藥物，如表1 所示。

表1 利用CMap 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定的治療胃癌的候選小分子化合物

其中，PD-0325901、菲達(dá)替尼(fedratinib，TG-101348)、NVP-AUY922、西地尼布和布雷非德菌素A(brefeldin A)為已報(bào)道的具有胃癌治療價(jià)值的小分子藥物，表明本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果具有可靠性。另外，左炔諾孕酮、TWS-119、Tyrphostin-AG-1478、VU-0415374-1 和L-690488 為本研究新發(fā)現(xiàn)的治療胃癌的候選小分子化合物。

2.4 PPIN 的構(gòu)建與樞紐基因的鑒定

蛋白質(zhì)間的相互作用是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)執(zhí)行生命功能的重要方式，在包括癌癥發(fā)生發(fā)展等多種生命活動(dòng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)在上述3 個(gè)數(shù)據(jù)集中鑒定的203 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行相互作用分析，構(gòu)建了由152 個(gè)節(jié)點(diǎn)和480 條邊組成的PPIN，如圖3a 所示。鑒于PPIN 中樞紐基因具有成為藥物靶點(diǎn)的潛力，利用Cytoscape 軟件對(duì)構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化和拓?fù)湫再|(zhì)分析，以度(degree)值排名前10%為篩選標(biāo)準(zhǔn)，鑒定了16 個(gè)樞紐基因，如圖3b所示。其中，TIMP1 為基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)家族重要的成員之一，在抑制基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞信號(hào)通路(如細(xì)胞死亡、增殖和血管生成)等方面具有重要作用[15]；PDGFRB 是血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)，在抑制血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中起關(guān)鍵作用[16]。而且，TIMP1 和PDGFR 均可作為胃癌預(yù)后生物標(biāo)志物[16-17]，提示樞紐基因在胃癌發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

圖3 差異表達(dá)基因的PPIN 分析

2.5 胃癌候選小分子藥物潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

為了預(yù)測(cè)胃癌候選小分子藥物的靶點(diǎn)，本研究利用Autodock 軟件對(duì)PPIN 中樞紐基因編碼蛋白質(zhì)與基于CMap 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定的候選藥物進(jìn)行了分子對(duì)接分析。結(jié)果顯示，左炔諾孕酮和西地尼布可分別與TIMP1 和PDGFRB 結(jié)合。具體地，西地尼布可與PDGFRB 蛋白的口袋結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)分別為第63 位和第112 位谷氨酸(GLU)，結(jié)合能為-6.28 kcal/mol，如圖4a 所示，這與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的西地尼布能夠結(jié)合PDGFR 家族成員相符合；左炔諾孕酮與TIMP1 第100 位的絲氨酸(SER)、第102 位的纈氨酸(VAL)、第112 位的谷氨酰胺(GLN)和第162 位的精氨酸(ARG)作用，結(jié)合能為-9.24 kcal/mol，如圖4b 所示。因此，本研究新鑒定的胃癌候選藥物左炔諾孕酮可能通過(guò)結(jié)合TIMP1 的口袋，達(dá)到治療胃癌的效果。

圖4 鑒定的胃癌候選藥物與其潛在靶點(diǎn)的分子對(duì)接

2.6 胃癌候選藥物潛在靶點(diǎn)的功能研究

首先，為了驗(yàn)證候選藥物潛在靶點(diǎn)基因在腫瘤組織和正常對(duì)照組織中的表達(dá)模式，通過(guò)箱線圖展示了TIMP1 和PDGFRB 在GSE54129、GSE26899和GSE65801 這3 個(gè)數(shù)據(jù)集中的表達(dá)模式，并利用GEPIA2 在線分析工具[19]對(duì)藥物潛在靶點(diǎn)TIMP1和PDGFRB 在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。如圖5a～5b 所示，靶點(diǎn)基因TIMP1 和PDGFRB 在胃癌腫瘤組織中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P＜0.05)。然后，通過(guò)ROC 曲線分析評(píng)估TIMP1 和PDGFRB 來(lái)區(qū)分胃癌患者和正常對(duì)照的敏感性和特異性，AUC 值越高則代表區(qū)分能力越強(qiáng)。如圖5c 所示，在GSE54129、GSE26899 和GSE65801 數(shù)據(jù)集中，TIMP1 的AUC 值在0.960～0.994 之間，基因PDGFRB 的AUC 值在0.786～0.974 之間，表明TIMP1 和PDGFRB 對(duì)胃癌具有較好的診斷效果。進(jìn)一步，利用Kaplan-Meier Plotter 工具進(jìn)行生存分析來(lái)研究TIMP1 和PDGFRB分別與胃癌患者總體生存時(shí)間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，與TIMP1 低表達(dá)組相比，TIMP1 高表達(dá)組患者的總體生存率顯著降低(P＜0.05)；類(lèi)似地，PDGFRB 高表達(dá)組患者的總體生存率也顯著低于PDGFRB 低表達(dá)組患者的總體生存率(P＜0.05)，如圖5d 所示，表明靶點(diǎn)基因TIMP1 和PDGFRB 的表達(dá)水平與胃癌患者的預(yù)后生存時(shí)間密切相關(guān)。

圖5 潛在靶點(diǎn)基因的表達(dá)模式和功能分析

3 結(jié) 束 語(yǔ)

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型之一，大多數(shù)患者到醫(yī)院檢查就診時(shí)已發(fā)展到中晚期，手術(shù)治療效果不佳，現(xiàn)有藥物的治療效果有限，因此，迫切需要研發(fā)具有更好療效的靶向藥物，提高胃癌的臨床治療效果。

本研究基于胃癌的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，采用CMap 的藥物重定位方法，鑒定了10 種治療胃癌的候選小分子化合物。其中，PD-0325901、菲達(dá)替尼、NVP-AUY922、西地尼布和布雷非德菌素A 為已報(bào)道的具有胃癌治療潛力的小分子化合物。如PD-0325901 作為MEK 抑制劑能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[20]；西地尼布為KIT 和VEGFR 抑制劑，具有抗血管生成的作用，文獻(xiàn)[21]對(duì)西地尼布聯(lián)合順鉑和氟嘧啶治療日本初治晚期胃癌患者進(jìn)行了臨床I 期研究，發(fā)現(xiàn)20 毫克/天西地尼布聯(lián)合順鉑和氟嘧啶是可以耐受的，具有抗腫瘤的活性。此外，左炔諾孕酮、TWS-119、tyrphostin-AG-1478、VU-0415374-1 和L-690488 為本研究新發(fā)現(xiàn)的治療胃癌的候選小分子化合物，值得深入研究。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，PPIN 是探究癌癥致病機(jī)制和預(yù)測(cè)候選藥物靶標(biāo)的重要工具。通過(guò)鑒定PPIN 中的樞紐節(jié)點(diǎn)并將其分別與上述篩選得到的小分子藥物進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)小分子藥物西地尼布可與PDGFRB 結(jié)合，結(jié)合能為-6.28 kcal/mol，這與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的西地尼布能夠結(jié)合PDGFR 家族成員的結(jié)果是一致的。另外，分子對(duì)接結(jié)果也顯示，左炔諾孕酮可與TIMP1 的口袋結(jié)合，結(jié)合能為-9.24 kcal/mol。但是左炔諾孕酮對(duì)胃癌的治療作用尚未報(bào)道，為本研究的新發(fā)現(xiàn)。

左炔諾孕酮是一種口服避孕藥，主要通過(guò)抑制排卵、改變子宮內(nèi)膜和宮頸黏液，達(dá)到避孕的效果。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，左炔諾孕酮或左炔諾孕酮宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)(levonorgestrel intrauterine system，LNG-IUS)還具有抗癌作用，尤其對(duì)于子宮內(nèi)膜癌治療有一定的療效，但是它們對(duì)癌癥的影響仍存在爭(zhēng)議。如左炔諾孕酮宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)可通過(guò)降低異位子宮內(nèi)膜中腺體和間質(zhì)雌激素受體α(estrogen receptor α, ERα)、ERβ 和 孕 激 素 受 體(progesterone receptor, PR)的表達(dá)，改善輕度至中度子宮內(nèi)膜異位癥女性的癥狀[22]。文獻(xiàn)[23]發(fā)現(xiàn)左炔諾孕酮宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)能夠影響宮腺肌癥患者子宮內(nèi)膜中類(lèi)固醇受體共調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平。文獻(xiàn)[24]的研究結(jié)果顯示，左炔諾孕酮能夠通過(guò)雄激素受體抑制人子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞中組織纖溶酶原激活物的分泌。另外，文獻(xiàn)[25]的研究結(jié)果顯示，孕酮宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)與低于預(yù)期的子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胰腺癌和肺癌發(fā)病率相關(guān)，但與高于預(yù)期的乳腺癌發(fā)病率相關(guān)[25]。需要注意的是，左炔諾孕酮作為一種激素類(lèi)的藥物，其對(duì)于男性患者和女性患者的治療效果可能存在較大的差異。另外，長(zhǎng)期使用左炔諾孕酮可能會(huì)產(chǎn)生抗癌和促癌的效應(yīng)。一方面，左炔諾孕酮可在一定程度上降低子宮內(nèi)膜癌等癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，長(zhǎng)期使用左炔諾孕酮可能會(huì)增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[26]。因此，在使用左炔諾孕酮時(shí)，需要注意其副作用和風(fēng)險(xiǎn)，并根據(jù)個(gè)體情況選擇合適的用藥方案。

綜上，本研究利用基于CMap 數(shù)據(jù)庫(kù)的藥物重定位方法鑒定了10 種治療胃癌的候選藥物，其中小分子化合物左炔諾孕酮可與PPIN 中的樞紐節(jié)點(diǎn)TIMP1 結(jié)合，且結(jié)合能低于已報(bào)道的藥物西地尼布與其靶點(diǎn)PDGFRB 的結(jié)合能，提示左炔諾孕酮可作為新型小分子藥物來(lái)治療胃癌，但具體的作用機(jī)制還需通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。