馮智尊 ，楊雅斐 ，王海崗 ，陳 凌 ，Santra Dipak K ，王瑞云 ，，喬治軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031；3.內(nèi)布拉斯加大學(xué) 林肯分校農(nóng)藝系小宗糧豆研究與推廣中心，美國 內(nèi)布拉斯加州 69361）

糜黍（Panicum miliaceumL.）是起源于我國的古老粟類，又稱黍稷、黍、稷、糜子、穄，脫殼后稱黃米。糜黍有粳糯之分，糜米酸粥、糜子甜飯分別為晉菜和陜菜系列代表，前者由粳性糜子經(jīng)發(fā)酵制作而成，后者則由糯性黍子蒸煮而得。糜黍是我國華北和西北干旱半干旱地區(qū)廣泛種植的局域性口糧[1-6]。糜黍為C4植物，生育期短（60～90 d），能適應(yīng)包括生物和非生物脅迫在內(nèi)的多種逆境，可以高效利用水熱資源，在六大洲（亞洲、歐洲、非洲、南美洲、北美洲、大洋洲）均有分布，為邊際和土壤貧瘠地區(qū)的救災(zāi)備荒作物[7-10]。2023 年為國際粟類作物年，契合時代需求，對糜黍作物開展的遺傳多樣性評估、抗性改良和品質(zhì)提升等方面的研究日漸增多。糜黍不僅營養(yǎng)豐富，而且還具有保健功能，對乳糜病、肥胖癥、褥瘡等均具有一定的治療效果。隨著國家農(nóng)業(yè)特優(yōu)戰(zhàn)略的實施，糜黍種質(zhì)資源收集、整理和評估工作陸續(xù)展開。糜黍不僅產(chǎn)量低下，而且作為異源四倍體，基因組復(fù)雜，與水稻、小麥等大宗作物相比，其研究進展緩慢。目前，全球有糜黍種質(zhì)資源2 萬余份，我國有1 萬余份，山西有2 000 余份。若想合理利用如此眾多的資源，首先必須搞清其遺傳背景，建立精準簡便的鑒定體系成為亟待解決的問題[11-14]。

SSR 作為一種分子標記普遍存在于各種作物的基因組中，在糜黍種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析方面應(yīng)用較多。HU 等[15]最早使用種間SSR 分析了我國資源的遺傳差異。趙飛龍[16]利用15 個SSR 評估了來自我國16 個糜黍主產(chǎn)省的80 個品種的遺傳多樣性。王瑞云等[17]利用15 個糜黍特異性熒光SSR鑒定來源于我國11 個省（區(qū)）的132 份資源，檢測到107 個等位變異，每個位點等位變異數(shù)為2～14 個，平均7 個；基因多樣性指數(shù)為0.093 6～0.867 6，平均0.529 8；多態(tài)性信息含量為0.089 3～0.853 8，平均0.486 4；基于遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示，我國糜黍資源來自4 個基因庫（東北地區(qū)、黃土高原、北方地區(qū)和西北地區(qū)），與基于遺傳距離的聚類結(jié)果一致，均與材料的地理來源相關(guān)。LIU 等[18]采用67 個SSR 分析來自4 個群組的栽培種和地方品種的遺傳多樣性，共檢測到179 個等位變異，有效等位基因數(shù)為1.995 個，遺傳多樣性指數(shù)為0.725。何杰麗等[19]基于高通量測序結(jié)果設(shè)計EST-SSR 引物，分析了國內(nèi)外不同生態(tài)區(qū)的144 份資源，利用主成分分析將材料劃歸7 個類群。王倩等[20]基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)了200 個高基元EST-SSR，多態(tài)性篩選后獲得52 個多態(tài)性標記，多態(tài)率為26%；利用上述標記檢測200 份核心資源，發(fā)現(xiàn)Shannon 多樣性指數(shù)變幅為0.309 3～1.091 0，平均為0.727 7。糜黍作物分子身份證的構(gòu)建工作較少，陳小紅等[21]以來源于4 個生態(tài)栽培區(qū)的130 份資源為材料，基于35 個高基元SSR 構(gòu)建了DNA 分子身份證。王宇卓等[22]以272 份山西糜黍核心種質(zhì)為材料，基于ID Analysis 4.0 軟件，用20 個SSR 構(gòu)建了材料的分子身份證。

糜黍是我國起源的特色雜糧作物，而山西是中華民族發(fā)祥地之一，在山西省萬榮縣荊村新石器時代的遺址中就有燒焦的黍穗遺存。在山西，山區(qū)面積占全省總面積的80%以上，糜黍的抗旱耐瘠特性使其種植廣泛，從北（大同天鎮(zhèn)新平堡鎮(zhèn)平遠頭村）到南（運城芮城永樂鎮(zhèn)南張村）、從西（運城永濟韓陽鎮(zhèn)長旺村）到東（大同靈丘柳科鄉(xiāng)南坑村）均有吃糜黍食品的習(xí)俗，包括糜米酸粥、泡泡油糕、棗介糕、小車刀切糕、黃米粽子、稷米面煎餅、沙棘開口笑、糜米涼粉等，糜黍是天鎮(zhèn)、靈丘、河曲、岢嵐等晉北冷涼地區(qū)的主要農(nóng)作物之一，在人們的日常生活中不可或缺。

本研究選取山西10 個地市的80 份糜黍資源為材料，評估其遺傳差異，并構(gòu)建了各自的DNA 分子身份證，旨在為加快親本選育、推動糜黍育種進程提供材料基礎(chǔ)和基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為80 份糜黍資源，來自山西省除晉城以外的10 個地市，其中，晉北地區(qū)48 份（忻州24 份、大同13 份、朔州11 份），晉中地區(qū)26 份（晉中14 份、呂梁5 份、太原4 份、陽泉3 份），晉南地區(qū)6 份（長治1 份、臨汾1 份、運城4 份）。材料明細如表1 所示。

1.2 試驗方法

剪取糜黍三葉期葉片，采用改良CTAB 法[23]提取DNA。DNA 的完整度和濃度檢測方法同何杰麗等[19]。PCR 擴增程序和反應(yīng)體系同林元香等[24]。擴增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，硝酸銀染色顯影。

利用軟件PowerMarker 3.25 和PopGen 1.32 計算遺傳多樣性參數(shù)[25-27]。利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)的資源特征分析軟件ID Analysis 4.0 創(chuàng)建分子身份證?；诙M制（0，1）為PCR 擴增產(chǎn)物賦值（有電泳條帶記為1，無電泳條帶則記為0）。就一份材料而言，每個SSR 檢測產(chǎn)生一個數(shù)值，多個標記形成的數(shù)值組合在一起構(gòu)成該材料的字符串DNA 分子身份證。使用在線條形碼生成器（http：//barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.pHP）將對應(yīng)字符串生成可掃描的條形碼DNA 分子身份證。利用二維碼在線生成器（https：//cli.im/）將材料基本信息（包括名稱、統(tǒng)一編號、來源地、材料類別、字符串和條形碼DNA 分子身份證）轉(zhuǎn)化為可掃描的二維碼，即為二維碼DNA 分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性SSR 引物的篩選

44 對糜黍SSR 引物序列如表2 所示。

表2 44 對糜黍SSR 引物序列Tab.2 Primer sequences of 44 SSR markers in broomcorn millet

用山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院糜子作物分子育種課題組前期構(gòu)建的44 對糜黍特異性SSR 引物（表2）擴增80 份糜黍資源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21 個標記（RYW3、RYW7、RYW11、RYW14、RYW18、RYW26、RYW28、RYW29、RYW30、RYW31、RYW37、RYW39、RYW40、RYW49、RYW54、RYW56、RYW61、RYW62、RYW65、RYW67 和RYW82）的擴增條帶清晰、多態(tài)性較好，可以作為候選核心引物用于分子身份證的構(gòu)建。其中，RYW82 擴增部分糜黍材料的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示。

2.2 基于SSR 的糜黍資源遺傳多樣性參數(shù)分析

由表3 可知，80 份材料在44 個位點共檢測出130 個等位變異，平均每個位點檢出3 個等位變異；檢測到有效等位基因介于1.936 9（RYW16）～2.993 2（RYW67），平均為2.662 6；Shannon 多樣性指數(shù)（I）介于0.676 8（RYW16）～1.097 5（RYW67），平均為1.016 1；觀測雜合度介于0.109 6（RYW6）～0.569 4（RYW16），平均為0.243 6；期望雜合度介于0.487 1（RYW16）～0.670 4（RYW67），平均為0.625 2；Nei's基因多樣性指數(shù)介于0.483 7（RYW16）～0.665 9（RYW67），平均為0.621 1，檢測出多態(tài)性信息含量（PIC）介于0.417 0（RYW20）～0.797 4（RYW67），平均為0.660 4。綜合PIC 和I值，高于平均值的SSR引物有21 對（RYW3、RYW7、RYW11、RYW14、RYW18、RYW26、RYW28～RYW31、RYW37、RYW39、RYW40、RYW49、RYW54、RYW56、RYW61、RYW62、RYW65、RYW67 和RYW82）。利用ID Analysis 4.0 軟件分析，發(fā)現(xiàn)16 個標記（RYW62、RYW67、RYW56、RYW65、RYW61、RYW40、RYW37、RYW31、RYW82、RYW29、RYW28、RYW49、RYW39、RYW54、RYW18 和RYW30）組合在一起可區(qū)分全部材料。

表3 基于44 對SSR 引物的糜黍遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of broomcorn millet based on 44 SSR primers

2.3 基于UPGMA 的糜黍資源的聚類分析

基于UPGMA，用16 對引物對80 份糜黍材料聚類，結(jié)果如圖2 所示，80 份糜黍資源可以劃歸4 個類群（類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。類群Ⅰ（紅色）包括21 份材料，其中，忻州最多（23.8%），為5 份；晉中次之（38.1%），為8 份；大同、陽泉均為2 份，占比均為9.5%；朔州、長治、太原、臨汾最少，均為1 份，占比均為4.8%。其中，51 號和55 號聚在一起，均來自晉中市；30 號和35 號聚在一起，均來自忻州市。類群Ⅱ（綠色）包括12 份材料，其中，忻州最多（66.7%），為8 份；大同次之（16.7%），為2 份；朔州和晉中均為1 份，占比均為8.3%。其中，37 號和69 號聚在一起，均來自忻州市；28 號、74 號、75 號、76 號聚在一起，也均來自忻州市。類群Ⅲ（藍色）包括38 份材料，其中，朔州最多（21.1%），為8 份；大同次之（18.4%），為7 份；忻州位列第3（15.8%），為6 份；晉中和呂梁均為5 份，占比均為13.2%；運城和太原較少（分別占比10.5%和5.3%），分別為4、2份；陽泉最少（2.6%），為1 份。其中，9 號、15 號、16 號、21 號聚在一起，均來自朔州；31 號和32 號聚在一起，均來自忻州；79 號和80 號聚在一起，均來自呂梁；62 號和63 號聚在一起，均來自運城。類群Ⅳ（黃色）包括9份材料，其中，忻州最多（55.6%），為5份；大同次之（22.2%），為2 份；朔州和太原最少，均為1 份（11.1%）。其中，70 號和71 號聚在一起，均來自忻州市。

圖2 80 份糜黍核心種質(zhì)資源聚類Fig.2 Cluster diagram of 80 core germplasm resources of broomcorn millet

2.4 基于SSR 的糜黍資源主成分分析

基于16 對SSR 引物對80 份糜黍資源進行主成分分析（PCA），結(jié)果如圖3 所示，前3 個主成分PC1（Dim-1）、PC2（Dim-2）和PC3（Dim-3）分別解釋總方差的29.12%、4.06%和3.04%，共解釋累積方差的36.22%。80 份糜黍材料劃歸10 個類群（G1～G10），其中，G1 共13 份材料，全部來自大同；G2 共11 份材料，全部來自朔州；G3 共24 份材料，全部來自忻州；G4 共4 份材料，全部來自太原。

圖3 基于SSR 的80 份糜黍資源主成分分析Fig.3 Principal component analysis of 80 broomcorn millet resources based on SSR

2.5 糜黍資源DNA 分子身份證的構(gòu)建

基于SSR 的80 份糜黍資源的二維碼DNA 分子身份證如圖4 所示。

圖4 基于SSR 的80 份糜黍資源的二維碼DNA 分子身份證Fig.4 DNA molecular identity cards of 80 broomcorn millet resources based on SSR

由圖4 可知，用21 對SSR 引物擴增80 份糜黍資源，利用ID Analysis 4.0 軟件分析，發(fā)現(xiàn)16 個標記（RYW62、RYW67、RYW56、RYW65、RYW61、RYW40、RYW37、RYW31、RYW82、RYW29、RYW28、RYW49、RYW39、RYW54、RYW18 和RYW30）組合在一起可區(qū)分全部材料。如，材料1的字符串DNA 分子身份證為1100111111010111，顯示擴增條帶情況為：引物RYW62 有，RYW67 有，RYW56 無，RYW65 無，依次類推直到RYW30 有。將以上數(shù)據(jù)輸入條形碼生成器，即可得到條形碼DNA 分子身份證。整合上述字符串、條形碼DNA分子身份證和材料的基本信息（名稱、統(tǒng)一編號、來源地、材料類別），輸入二維碼在線生成器獲得二維碼DNA 分子身份證。

3 結(jié)論與討論

3.1 基于SSR 的糜黍資源的遺傳多樣性衡量參數(shù)

遺傳多樣性評估參數(shù)是衡量植物資源遺傳差異的重要指標。就糜黍資源的Shannon 多樣性指數(shù)（I）值和多態(tài)性信息含量（PIC）值而言，王宇卓等[22]用85 個SSR 擴增272 份山西核心種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)I 值和PIC 值分別為1.055 2 和0.692 1；陳小紅等[21]基于35 個SSR 擴增來源于4 個生態(tài)栽培區(qū)的130 份材料，發(fā)現(xiàn)I 值和PIC 值分別為1.047 2 和0.696 6；本研究用44 個SSR 檢測80 份山西材料，發(fā)現(xiàn)I 值和PIC 值分別為1.016 1 和0.660 4，與上述研究結(jié)果基本相符。

雜合度反映的是群體內(nèi)遺傳變異程度，觀測雜合度值越接近期望雜合度值說明該群體受外來因素的影響越小，更傾向于處于遺傳平衡狀態(tài)。就糜黍資源的觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）而言，王舒婷等[28]用27 個SSR 分析57 份山西材料，發(fā)現(xiàn)Ho 值和He 值基本一致（分別為0.500 4 和0.496 4）；連帥等[29]用63 個SSR 檢測192 份世界材料，分別為0.611 3 和0.388 7；陳小紅等[21]用35 個SSR 擴增130 份中國資源，發(fā)現(xiàn)Ho 值和He 值分別為0.716 8和0.638 6；王宇卓等[22]用85 個SSR 鑒定272 份山西材料，發(fā)現(xiàn)Ho值和He值分別為0.741 9和0.641 5。本研究檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ho 值和He 值分別為0.243 6和0.625 2，與上述研究結(jié)果存在較大差異，這可能與試驗材料地理來源差異以及試驗材料的數(shù)量有關(guān)。

3.2 常規(guī)SSR 和熒光標記SSR 檢測方法的比較

目前，檢測物種資源間的遺傳差異常用2 種方法，一是基于SSR 的聚丙烯酰胺凝膠電泳法，二是基于熒光SSR 的熒光毛細管電泳法。楊文娟等[30]用2 種方法評估芝麻種質(zhì)的遺傳差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果檢測標記的擴增條帶清晰、多態(tài)性條帶數(shù)目少且條帶間分子量存在較大差異，則上述2 種檢測結(jié)果基本一致，如標記ZMM2818 和ZMM1851 片段大小分別為260～278、268～284 bp，用2 種方法均檢測到7 個多態(tài)性位點，且一一對應(yīng)；標記ZMM1935和ZMM1494，用2 種方法均分別檢測到6、12 個多態(tài)性位點，但聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶模糊；引物ZMM2254 和ZMM3037，用2 種方法均檢測到多態(tài)性位點數(shù)目不同，前者分別為4、5 個，后者分別為6、8 個。連靈燕等[31]以全球第三大糧食作物玉米的20 個自交系為材料，基于聚丙烯酰胺凝膠電泳用21 個SSR 構(gòu)建了的指紋圖譜。鑒別水稻和玉米DNA 指紋圖譜，當(dāng)分析材料較少時，聚丙烯酰胺凝膠電泳法比熒光毛細管電泳法經(jīng)濟有效，一方面不需要昂貴的測試儀器；另一方面，試劑便宜，且常規(guī)引物不僅合成價格低，而且保存期長達4 a[32]。靳玲兵等[33]以經(jīng)濟樹種核桃為材料，用上述2 種方法評估多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)熒光標記用的數(shù)量多則合成成本太高，限制實際應(yīng)用，因此，需要用聚丙烯酰胺凝膠電泳先行對SSR引物進行初步篩選。在糜黍方面，王宇卓等[22]和陳小紅等[21]基于常規(guī)SSR 分別檢測了山西資源和中國資源的遺傳差異；林元香[34]則比較了2 種方法的差異，發(fā)現(xiàn)熒光SSR 檢測僅用7 個標記，是普通SSR 檢測（20 個標記）效率的3 倍。

3.3 字符串DNA 分子身份證在植物鑒定中的運用

在作物DNA 分子身份證的構(gòu)建過程中，SSR引物的篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[35]。通常，就物種遺傳差異的衡量指標而言，Na 值、I 值和PIC 值越高，檢測引物在品種鑒定中的靈敏度越高。但本研究結(jié)果表明，單純按照某指標的高低排序?qū)σ镞M行組合，難以獲得最優(yōu)核心引物組合，而使用相關(guān)排列組合軟件則選擇效果好。本研究在引物的初步篩選中，多態(tài)性較高、位列前3 的為RYW67、RYW18 和RYW61，但它們分別排在第39、10、35 位。作物種質(zhì)資源的DNA 分子身份證與材料的地理來源密切相關(guān)，地理來源接近，分子身份證類似；地理來源存在較大差異，則分子身份證容易識別[21]。陳昌文等[12]以果樹資源桃樹為材料，構(gòu)建了中國品種的DNA分子身份證，其中來源于吉林的吉林8501 和吉林8601 分子身份證432566620382554 和43257661038 55545 類似，前4 位數(shù)字完全一致；而來源于新疆的喀什3 號和陜西的陜甘山桃分子身份證436756614 3957525 和1502233222010434 差異明顯，很容易識別。就糜黍資源而言，DNA 分子身份證的構(gòu)建研究不多，陳小紅等[21]基于35 個高基元SSR 構(gòu)建了來源于4 個生態(tài)栽培區(qū)的130 份材料的字符串DNA 分子身份證，其中，山西省陽泉市黑黍子（編號19）和紅黍子（編號30）分別為00110101001100001和00110010011100111，較為相似；而陜西省安康市的糯糜子（00004821）和內(nèi)蒙古雙耳糜（00007276）分別為11110101111010111 和1010001000100101，差異明顯。王宇卓等[22]基于20 個高基元SSR 構(gòu)建了272 份山西材料的字符串DNA 分子身份證，發(fā)現(xiàn)陽泉市平定縣的大白黍（序號35）和紅黍子（序號37）分別為10011111101001111011和100101011110 01111011，較為相近；而大同市靈丘縣的大青黍（序號8）和陽泉市平定縣的紅黍子（序號23）分別為00100111000011001010 和11111101111111111111，差異較大。本試驗也得到類似結(jié)果，大同市天鎮(zhèn)縣的白疙垛和紫龍帶分子身份證0010100101001111和0010110110010011，前5 位字符完全一致，不易識別；而忻州市偏關(guān)縣的灰臉蛋黍和運城市聞喜縣的白軟黍分子身份證分別為0000011000111101 和1111010111100111，前4 位字符完全不同，易于分辨。

本研究以80 份山西糜黍種質(zhì)資源為試驗材料，基于用最少引物區(qū)分最多材料的原則，用16 個SSR 構(gòu)建了全部材料的二維碼DNA 分子身份證，為糜黍育種親本的選配提供了本底信息，同時也為糜黍資源遺傳多樣性檢測提供了分子檢測工具。