王 雪，孫玉榮，張 諾，李忠祥，任志賢，張寶俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801）

植物在自然界與各類病原生物長期的攻防和博弈的過程中[1]，形成了一套高效復(fù)雜防御系統(tǒng)以抵御多類病原菌的侵染與為害。由病原體相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP）觸發(fā)的免疫反應(yīng)（Pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（Effector-Triggered Immunity，ETI）在寄主植物發(fā)揮抗病性、阻礙病菌侵染方面起著重要的作用[2]。其中，PTI途徑由許多類受體激酶（Receptorlike kinases，RLKs）和類受體蛋白調(diào)節(jié)作為誘導(dǎo)第一層防御反應(yīng)的模式識(shí)別受體檢測(cè)PAMP，對(duì)非適生性病原菌具有廣譜抗性[3]。細(xì)胞壁相關(guān)激酶（Wall-associated kinases，WAKs）基因家族是一類獨(dú)特的RLKs 基因，在植物防御病原菌中發(fā)揮著重要作用[4]，它們編碼的跨膜蛋白具有胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶（Ser/Thr kinase，STK）結(jié)構(gòu)域和胞外類表皮生長因子（Epidermal growth factor-like，EGFlike）結(jié)構(gòu)域[5]。伴隨著WAK 基因家族的鑒定及功能驗(yàn)證研究的深入，其在植物抗病方面的重要作用陸續(xù)被證明。研究發(fā)現(xiàn)，ZmWAK-RLK1（Htn1）通過減少玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）滲透到宿主組織中而導(dǎo)致感染過程的改變，賦予玉米數(shù)量抗性[6]；番茄細(xì)胞壁相關(guān)激酶SlWAK1 依賴于Fls2/Fls3 促進(jìn)對(duì)假單胞菌（Pseudomonas syringae）的質(zhì)外體免疫反應(yīng)[7]；棉花中，GhWAK7A通過調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)防御棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）[8]；在水稻中，OsWAK91是參與防御水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）的候選基因[9]。OsWAK1在水稻中的過表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)稻瘟病菌的抗性[10]；TaWAK7D通過調(diào)控小麥多個(gè)病程相關(guān)基因的表達(dá)，正向參與小麥對(duì)紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的防御反應(yīng)[11]；ZmWAK在抗性玉米品種的中胚軸中高度表達(dá)[12]。這些發(fā)現(xiàn)表明，WAK 基因家族對(duì)于植物防御病原菌是必不可少的。

谷子一直被作為主要的雜糧作物在我國栽培[13]，具有悠久的種植歷史，在中華文明的形成過程中發(fā)揮了重要作用，其營養(yǎng)均衡且對(duì)糖尿病、腸胃病、心腦血管疾病等多種疾病有食療作用[14]。谷子是一種生長能力強(qiáng)、CO2利用率高、需水量少的C4 光合途徑作物[15]，在保障全球糧食安全中具有潛在作用。由禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）引起的谷子白發(fā)病是一種嚴(yán)重威脅谷子安全生產(chǎn)的主要病害，常年的發(fā)病率為20%～30%，一些優(yōu)良易感品種的發(fā)病率甚至達(dá)70%以上[16]。隨著我國雜糧特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，該病害發(fā)生面積及發(fā)病程度有逐漸增長的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著谷子產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，因此，挖掘谷子抗白發(fā)病基因及關(guān)鍵調(diào)控因子，加速抗白發(fā)病品種的選育，對(duì)于有效防控谷子白發(fā)病的發(fā)生發(fā)展具有十分重要的意義。WAK基因家族在擬南芥[17]、水稻[18]、棉花[19]、大麻[20]、馬鈴薯[21]、小麥[22]等植物中已被鑒定，但有關(guān)谷子WAK基因家族的研究還未見報(bào)道。

為挖掘谷子中WAK 基因的相關(guān)功能，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)谷子的WAK 基因進(jìn)行篩選及進(jìn)一步鑒定，對(duì)確定下的谷子WAK 基因家族進(jìn)行基因定位、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、進(jìn)化分析、保守基序分析、順式作用元件分析，同時(shí)對(duì)谷子WAK基因家族響應(yīng)禾生指梗霉早期侵染的表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在為探究WAK 基因家族在谷子生長發(fā)育和抗白發(fā)病代謝途徑中的功能提供理論依據(jù)，并為抗白發(fā)病分子育種提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 谷子WAK 基因家族成員鑒定

谷子基因組序列從Multi-omics Database forSetaria italica數(shù)據(jù)庫（http://foxtail-millet.biocloud.net/home）中獲取。利用TAIR數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/）下載14 條擬南芥WAK 蛋白序列，并通過國家水稻數(shù)據(jù)庫中心（http://www.ricedata.cn/index.htm）獲取9 條水稻W(wǎng)AK 蛋白序列，利用TBtools 中的BLAST GUI Wrapper 程序、以水稻與擬南芥的WAK 蛋白序列作為探針序列對(duì)谷子的全基因蛋白序列進(jìn)行搜索比對(duì)，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為Evalue＜0.01，根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Batch-CD-Search 功能進(jìn)行結(jié)構(gòu)域確定。

1.2 谷子WAK 基因家族蛋白理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞預(yù)測(cè)及定位

利用在線工具ExPASY-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析谷子WAK 基因家族蛋白的理化性質(zhì)，主要有氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等。利用在線網(wǎng)站（https://wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)谷子WAK 基因家族的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。基因定位根據(jù)谷子的基因組注釋gff3 文件，利用TBtools 對(duì)定位結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.3 谷子WAK 基因家族進(jìn)化分析

使用MEGA 7.0 軟件對(duì)水稻、擬南芥、谷子WAK 基因家族的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，采用Neighbor joining 法（bootstrap 值設(shè)定為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 谷子WAK 基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

谷子WAK 基因家族的保守基序借助MEME在線工具（http://meme-suite.org/tools/meme）進(jìn)行分析，后通過TBtools 對(duì)谷子WAK 基因家族的保守基序進(jìn)行可視化做圖。

1.5 谷子WAK 基因家族順式作用元件鑒定

利用TBtools 軟件的Gtf/Gff3 Sequences Extract 程序提取WAK 基因上游2 000 bp 的起始密碼子，使用Plantcare 數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）將WAK 基因家族的啟動(dòng)子序列提交至此數(shù)據(jù)庫中，分析谷子WAK 基因家族的順式作用元件。

1.6 WAK 基因家族響應(yīng)禾生指梗霉侵染的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

試驗(yàn)材料為晉谷21 號(hào)（JG21）及晉谷20 號(hào)（JG20），由雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。晉谷21 號(hào)對(duì)谷子白發(fā)病具有高感性，晉谷20 號(hào)對(duì)谷子白發(fā)病具有高抗性。

以JG21 和JG20 的2 日齡胚芽鞘為材料，用4×105個(gè)/mL 的禾生指梗霉病菌游動(dòng)孢子懸浮液接種2日齡胚芽鞘。分別于接菌前0 h，接菌后12、24、48、96 h 不同時(shí)間段取受侵染的胚芽鞘，放于液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩? 次重復(fù)，共計(jì)30 份樣品，后委托百邁克生物科技有限公司進(jìn)行RNA 測(cè)序。

運(yùn)用RStudio 在線工具，對(duì)谷子WAK 基因響應(yīng)禾生指梗霉侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)繪制熱圖并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子WAK 基因家族篩選、理化性質(zhì)和基因定位分析

谷子WAK 基因結(jié)構(gòu)域如圖1 所示。

利用BLASTP 在xiaomi基因組中共鑒定得到41 個(gè)WAK 候選基因，再通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Batch-CD-Search功能進(jìn)行結(jié)構(gòu)域確定。其中，41個(gè)WAK 候選基因都具有GUB_WAK_bind 結(jié)構(gòu)域（圖1），最終篩選得到谷子WAK 基因共41 個(gè)。谷子WAK 基因家族編碼590～1 131 個(gè)氨基酸，平均為800個(gè)；其蛋白分子質(zhì)量為65.62～123.36 ku，等電點(diǎn)為5.18～8.49；Si3g36660、Si7g23280、Si8g19780蛋白親水性均值均為正值，表現(xiàn)為疏水性；除此之外，其他基因的蛋白親水性均值均為負(fù)值，則其蛋白表現(xiàn)為親水性。41 個(gè)基因中，28 個(gè)基因定位于質(zhì)膜，6 個(gè)基因定位于葉綠體，其他基因定位于高爾基體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)（表1）。在基因定位中，谷子WAK 基因在9 個(gè)染色體上均有分布。其中，Chr3 上所包含基因最多，為7 個(gè)；Chr2 上的WAK 基因最少，僅有1 個(gè)（圖2）。

圖2 谷子WAK 基因定位Fig.2 WAK gene location in foxtail millet

2.2 谷子WAK 家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，谷子、擬南芥和水稻的WAK 基因家族可分為五大類（圖3）。其中，I、IV、V 類中僅含有水稻與谷子這2 個(gè)物種的WAK 同源基因，I、IV、V 類分別包括6 個(gè)谷子WAK 基因及2 個(gè)水稻W(wǎng)AK 基因、9 個(gè)谷子WAK 基因及3 個(gè)水稻W(wǎng)AK 基因、10 個(gè)谷子WAK 基因及2 個(gè)水稻W(wǎng)AK基因；在II 類中僅包含擬南芥的WAK 同源基因；第III 類中同時(shí)包含谷子、擬南芥、水稻的WAK 同源基因，其中，Si1g24650與Os01g26174、Si1g12300與Os02g02120的同源關(guān)系最近。

圖3 谷子WAK 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic evolution analysis of WAK gene family in foxtail millet

2.3 谷子WAK 基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)41 個(gè)谷子的WAK 基因進(jìn)行保守基序分析，經(jīng)分析鑒定其具有8 個(gè)基序，命名為Motif 1～Motif 8。其中，Motif 3、Motif 1、Motif 6、Motif 4、Motif 5 在41 個(gè)谷子的WAK 蛋白序列中均存在，因此，這5 個(gè)基序均較為保守，且這5 個(gè)基序都以Motif 3、Motif 1、Motif 6、Motif 4、Motif 5 的先后位置排布（圖4-A）。保守基序的序列分析表明，Motif1中的保守序列為ZIDZFINEVAILSQINHRNVVKL LGCCLETEVPLLVYEFISNGTLYELLH，Motif3中的保守序列為KTKIFSLEELEKATNNFDKTR VLGRGGHGTVYKGIL（圖4-B）。

圖4 谷子WAK 基因家族保守基序分析Fig.4 Conservative motif analysis of WAK gene family in foxtail millet

2.4 谷子WAK 基因家族順式作用元件分析

谷子WAK 基因家族順式作用元件分析結(jié)果如圖5 所示。

圖5 谷子WAK 基因家族順式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements of WAK gene family in foxtail millet

順式作用元件預(yù)測(cè)表明（圖5），WAK 基因家族順式作用元件中，與光響應(yīng)有關(guān)的元件較多，說明WAK 基因家族可能參與光合作用并發(fā)揮重要作用；同時(shí)，赤霉素、茉莉酸甲酯、水楊酸、脫落酸的響應(yīng)元件也分布較多，表明WAK 基因家族在谷子中可能與激素信號(hào)緊密相關(guān)；在多個(gè)谷子WAK 基因家族中都有防御和脅迫響應(yīng)元件的分布，這說明谷子WAK 基因家族在發(fā)揮寄主抗病性、抵御病菌侵染等方面具有重要作用。

2.5 WAK 基因家族響應(yīng)禾生指梗霉侵染的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

谷子WAK 基因家族響應(yīng)禾生指梗霉侵染的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析顯示（圖6），共有2 類表達(dá)模式，在class Ⅰ中基因Si4g02780、Si7g23280、Si8g19220在JG21 中受到禾生指梗霉侵染48、96 h 表達(dá)量顯著高于JG20 中的表達(dá)量，并在96 h 差異表達(dá)最顯著，差異倍率分別為4.36、5.64、3.42（圖7）。

圖7 基因表達(dá)量分析Fig.7 Gene expression analysis

class Ⅱ在感病品種JG21 中的表達(dá)量整體低于在抗病品種JG20 中的表達(dá)量，Si6g20040在JG20中受到禾生指梗霉侵染48、96 h 表達(dá)量高，分別為10.39、10.73；Si7g08090和Si8g19780在JG21 和JG20 的表達(dá)量均隨侵染時(shí)間的增加而增加，且在JG20 的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均高于JG21 中的表達(dá)量，并在48 h 差異表達(dá)最顯著，差異倍率分別為10.46、2.04（圖7）。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白激酶（Wall-associated kinases，WAKs）是一類特殊的類受體蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和防御脅迫反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。WAKs/WAKL 在植物對(duì)真菌病害的防御反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[23]。低聚半乳糖苷（OGs）作為胞壁多糖的降解產(chǎn)物，被AtWAK1 所識(shí)別[24]。在擬南芥中過表達(dá)AtWAK1可以增強(qiáng)對(duì)灰霉病的抗性[25]。位于黑穗病數(shù)量抗性基因（qHSP1）上的ZmWAK基因的高表達(dá)有效地抑制了絲黑穗病菌在中胚軸中的生長[12]。水稻OsWAK14、OsWAK91和OsWAK92正向調(diào)控稻瘟病菌的防御反應(yīng)，而OsWAK112d則負(fù)調(diào)控防御反應(yīng)[26]。本研究共鑒定到41 個(gè)谷子WAK 基因家族成員，與其他植物中WAK/WAKL 基因啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果相類似[27]，本研究谷子WAK 基因啟動(dòng)子區(qū)域檢測(cè)到大量與光響應(yīng)、植物激素和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基序。Si1g25040、Si3g10590、Si3g32650、Si4g01670、Si4g02770、Si4g02780、Si5g09950、Si7g06570、Si7g08090都含有防御和脅迫響應(yīng)元件，表明這9 個(gè)谷子WAK 基因在發(fā)揮寄主抗病性、抵御病菌侵染等方面具有調(diào)控作用。與未侵染0 h相比，Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在抗病品種晉谷20 號(hào)的4 個(gè)不同侵染時(shí)間中基因上調(diào)表達(dá)；同時(shí)，3 個(gè)基因在晉谷21 號(hào)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均低于晉谷20 號(hào)中的表達(dá)量，且在48 h 時(shí)表達(dá)量差異均最顯著，推測(cè)Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780在阻礙禾生指梗霉侵染方面發(fā)揮作用。由于Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在晉谷21 號(hào)與晉谷20 號(hào)中表達(dá)量差異均在48 h 最顯著，因此，推測(cè)48 h的侵染時(shí)間點(diǎn)可能是一個(gè)關(guān)鍵侵染時(shí)間點(diǎn)。在接下來的研究中，需要進(jìn)一步研究和挖掘Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在谷子抗感品種的差異表達(dá)的原因。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究谷子的抗病機(jī)制及生長發(fā)育等提供一定的參考依據(jù)。