吳曉云,李思龍,刁飛燕,李啟艷,冉金鳳,劉春霖

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化妝品原料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250101)

植物原料及其提取物由于安全性高、作用溫和等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),因此在化妝品行業(yè)有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。甘草提取物主要包括黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)和多糖類(lèi)等活性成分,具有美白、防曬、抗氧化、抗炎和抗菌等功效[1-4],被廣泛應(yīng)用于護(hù)膚類(lèi)、美白類(lèi)、防曬類(lèi)等多種化妝品中。目前,涉及化妝品中甘草類(lèi)化學(xué)成分的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有3個(gè),國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 35954-2018 化妝品中10種美白祛斑劑的測(cè)定高效液相色譜法》、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 1500-2004化妝品中甘草酸二鉀的檢測(cè)方法液相色譜法》與團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《T/CAFFCI 1-2018 化妝品用原料甘草酸二鉀》,且以上標(biāo)準(zhǔn)只涉及甘草酸二鉀的檢測(cè)。甘草提取物中除含甘草酸二鉀,還含有甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A和光甘草定等多種化學(xué)活性成分,本文建立多波長(zhǎng)高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)法可同時(shí)測(cè)定以上8種甘草化學(xué)成分。

文獻(xiàn)報(bào)道甘草成分檢測(cè)方法有高效液相色譜法[5-6]、超高效液相色譜法[7]、液相色譜-質(zhì)譜法等[8-10],主要涉及中藥材及其提取物研究?；瘖y品領(lǐng)域甘草化學(xué)成分的測(cè)定方法主要為高效液相色譜法[11-12],文獻(xiàn)[13]在237 nm波長(zhǎng)下測(cè)定化妝品中的4種甘草成分,陸軍等[14]在237 nm波長(zhǎng)下測(cè)定7種甘草成分。筆者未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道化妝品中甘草查爾酮B和異甘草素的測(cè)定,單一檢測(cè)波長(zhǎng)很難兼顧每個(gè)組分的最佳檢測(cè)靈敏度,且同一提取方法可能不適用于多種復(fù)雜的化妝品基質(zhì)。本方法在優(yōu)化乳液類(lèi)、膏霜類(lèi)、水劑類(lèi)和凝膠類(lèi)4種基質(zhì)前處理方法基礎(chǔ)上,建立多波長(zhǎng)HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定8種甘草化學(xué)成分,該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度和準(zhǔn)確度高,為產(chǎn)品質(zhì)量提供保障。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備LC-40D高效液相色譜儀(日本島津公司),配DAD檢測(cè)器;Mettler Toledo MS電子天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司);Universal 320R高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司);KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q型超純水儀(美國(guó)密理博公司)。

1.2 材料與試劑乙腈、甲醇(色譜純,霍尼韋爾貿(mào)易上海有限公司);磷酸(優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品:甘草苷(批號(hào):Z10J8X39611,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);異甘草苷(批號(hào):Y15A10H95344,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);甘草查爾酮B(批號(hào):W10S10Z96953,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);甘草素(批號(hào):T4890010,含量99.0%,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);甘草酸二鉀(批號(hào):F12M6Z1,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);異甘草素(批號(hào):38640010,含量99.9%,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);甘草查爾酮A(批號(hào):P21O8F46473,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);光甘草定(批號(hào):K27A9R59960,含量98%,上海源葉生物科技有限公司)。30批美白類(lèi)化妝品均為市售產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱:Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣體積:10 μL。流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0～4 min,24%A;4～27 min,24%A →80%A;27～30 min,80%A →24%A;30～33 min,24%A)。檢測(cè)波長(zhǎng):231 nm(甘草苷、甘草素和光甘草定)、249 nm(甘草酸二鉀)、365 nm(異甘草苷、甘草查爾酮B、異甘草素、甘草查爾酮A)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備分別精密稱(chēng)取甘草苷12.01 mg、異甘草苷10.65 mg、甘草查爾酮B 7.85 mg、甘草素9.50 mg、甘草酸二鉀12.04 mg、異甘草素10.19 mg、甘草查爾酮A 10.29 mg、光甘草定10.83 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.0 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋并定容至刻度作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 乳液類(lèi)和膏霜類(lèi)準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g樣品(精確至0.000 1 g)于25 mL具塞比色管中,加入0.5 mL飽和氯化鈉水溶液,震蕩混勻,再加入10 mL 70%甲醇,渦旋混勻5 min后,超聲提取20 min,4 000 r·min-1離心4 min后,取上清液于比色管中,殘?jiān)偌?0 mL 70%甲醇重復(fù)上述步驟,合并兩次提取液,用氮?dú)獯蹈芍? mL左右,再加入甲醇溶解定容至10 mL,-18 ℃冷凍1 h后,4 ℃下6 000 r·min-1離心10 min,取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。

2.3.2 水劑類(lèi)和凝膠類(lèi)準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g樣品(精確至0.000 1 g)于10 mL具塞比色管中,加入適量70%甲醇溶液,渦旋混勻5 min至樣品完全分散,超聲提取20 min,冷卻后定容至10 mL,-18 ℃冷凍1 h后,4 ℃下6 000 r·min-1離心10 min,取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)精密量取“2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,將上述溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果,在231 nm波長(zhǎng)下8種成分分離度均大于2.5,達(dá)到基線分離,理論板數(shù)均大于7 000。

2.5 線性關(guān)系考察精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用甲醇分級(jí)稀釋,按照上述色譜條件分別進(jìn)樣,以溶液濃度(X)為橫坐標(biāo),色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明,8種成分在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.6 回收率試驗(yàn)取4種不同化妝品空白基質(zhì)(水劑類(lèi)、膏霜類(lèi)、凝膠類(lèi)和乳液類(lèi))各0.5 g,分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,使添加水平分別為低、中和高3個(gè)水平,每個(gè)水平平行制備3份樣品,按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液后進(jìn)樣測(cè)定,得到8種成分平均加樣回收率范圍為88.3%～96.2%,RSD為0.9%～3.5%,回收率良好,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 8種成分的平均回收率和RSD(n=3)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取回收率試驗(yàn)制備的低濃度供試品溶液(水劑類(lèi)、膏霜類(lèi)、凝膠類(lèi)和乳液類(lèi)),按上述色譜條件分別在0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣分析,分別記錄8種成分峰面積,計(jì)算RSD在1.1%～2.0%之間(n=2),表明8種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 精密度試驗(yàn)取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)所制備的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,分別記錄8種待測(cè)物峰面積,計(jì)算RSD在0.7%～1.4%之間,表明儀器精密度良好,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8種成分精密度考察

2.9 檢出限與定量限逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液,把信噪比(S/N)為 3∶1時(shí)的濃度作為最低檢出濃度,信噪比(S/N)為10∶1時(shí)的濃度作為最低定量濃度,按稱(chēng)取0.5 g樣品定容至10 mL進(jìn)行計(jì)算,得到樣品檢出限和定量限,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 8種成分檢出限與定量限

2.10 樣品測(cè)定對(duì)30批美白類(lèi)化妝品進(jìn)行測(cè)定,4批樣品含甘草酸二鉀,含量在6.75～312 mg·kg-1之間;5批樣品含光甘草定,含量在1.93～23.9 mg·kg-1之間;其余6種成分未檢出。典型樣品色譜圖見(jiàn)圖1?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

1.甘草苷;2.異甘草苷;3.甘草查爾酮B;4.甘草素;5.甘草酸二鉀;6.異甘草素;7.甘草查爾酮A;8.光甘草定

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇8種成分最大吸收波長(zhǎng)有差異,用單一檢測(cè)波長(zhǎng),很難兼顧每個(gè)成分的最佳檢測(cè)靈敏度,故利用DAD檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn),設(shè)置多個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè),使各成分均在最佳靈敏度下被檢測(cè)。試驗(yàn)對(duì)8種化合物在190～400 nm全波長(zhǎng)范圍掃描,在不考慮有較大干擾的末端吸收下,根據(jù)各成分的紫外吸收譜圖來(lái)確定檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果表明:甘草苷在231 nm波長(zhǎng)處有最大吸收、甘草素和光甘草定在231 nm波長(zhǎng)附近有較強(qiáng)吸收,故選擇231 nm為檢測(cè)波長(zhǎng);甘草酸二鉀在249 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,故選擇249 nm為檢測(cè)波長(zhǎng);其余4種成分,異甘草苷在361 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,甘草查爾酮B在340～370 nm有最大吸收,異甘草素和甘草查爾酮A在360～380 nm有最大吸收,綜合考慮靈敏度及化妝品中防腐劑等基質(zhì)的干擾,其余4種成分選擇365 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。不同波長(zhǎng)下8種成分的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1。

3.2 流動(dòng)相的選擇試驗(yàn)考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)8種成分在相同色譜條件下的分離效果。結(jié)果顯示,采用乙腈-0.1%磷酸溶液流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí),基線平穩(wěn),分離度和峰形均較好,故選擇該流動(dòng)相系統(tǒng)?？疾觳煌荻认疵摮绦?結(jié)果顯示在最終確定的色譜條件下,8種成分在較短的洗脫時(shí)間內(nèi)分離度良好。

3.3 色譜柱的選擇對(duì)比Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Kromasil 100-5-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)3種不同品牌色譜柱的分離效果。結(jié)果表明,使用Phenomenex C18柱,待測(cè)組分分離度均較好,分離時(shí)間較短且峰形良好,故選擇該色譜柱進(jìn)行分析。

3.4 前處理方法的研究

3.4.1 提取溶劑的選擇本研究考察了甲醇濃度分別為90%、70%、50%、30%時(shí),對(duì)4種不同基質(zhì)樣品的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)90%與70%甲醇的提取效率較高,由于70%甲醇提取的供試品溶液中干擾物質(zhì)較少,且待測(cè)組分的峰形較好,故選用70%甲醇溶液作為提取溶劑。

乳液和膏霜類(lèi)基質(zhì)中,比較加入與不加入0.5 mL飽和氯化鈉水溶液,再進(jìn)行超聲提取,結(jié)果顯示加入后提取效率顯著提高。由于先加入飽和氯化鈉水溶液,震蕩混勻使樣品變成流動(dòng)狀態(tài),樣品能夠完全分散利于待測(cè)成分的釋放,加速進(jìn)入提取溶劑中。水劑和凝膠類(lèi)基質(zhì)加入飽和氯化鈉水溶液后的提取效率,與不加無(wú)顯著差異。

3.4.2 提取方式與時(shí)間的選擇以70%甲醇溶液作為提取溶劑,分別比較超聲提取(5、10、20、30 min)和震蕩提取(0.5、1、2、3 h)對(duì)同一樣品的提取效率。試驗(yàn)結(jié)果表明,超聲提取優(yōu)于振蕩提取;超聲提取20 min 時(shí),各目標(biāo)成分提取量最高,主要因?yàn)槌曁崛±贸暡óa(chǎn)生的強(qiáng)烈震動(dòng)及擴(kuò)散效應(yīng),增加了溶劑穿透力,加速目標(biāo)物擴(kuò)散和溶解。最終試驗(yàn)選用超聲提取20 min。

3.4.3 供試品溶液純化方式的選擇供試品溶液提取、濃縮與定容之后,再用0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣,樣品圖譜中干擾峰較多,背景噪聲干擾較大,且有些供試品溶液在靜置2 h后會(huì)析出絮狀沉淀。考慮到化妝品成分的復(fù)雜性,本研究采用低溫樣品純化,選擇將供試品溶液-18 ℃冷凍1 h,在低溫4 ℃下6 000 r·min-1離心10 min后過(guò)濾進(jìn)樣,可以有效降低基質(zhì)類(lèi)成分的干擾。

3.5 結(jié)論本研究建立了多波長(zhǎng)HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定化妝品中8種甘草化學(xué)成分的方法,方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高,適用于化妝品中8種甘草化學(xué)成分的分析及定量檢測(cè),為化妝品原料和產(chǎn)品的監(jiān)管提供技術(shù)支持。