張榮霜,游飄雪,朱美玲,范世明*,許文,2*,黃鳴清

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院,福建 福州 350122;2.福建中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心,福建 福州350122)

沉香為瑞香科植物白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Gilg]含有樹脂的木材,《中國藥典》2020年版記載其可行氣止痛,溫中止嘔,納氣平喘。用于胸腹脹悶疼痛,胃寒嘔吐呃逆,腎虛氣逆喘急[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明,沉香具有神經(jīng)活性、胃腸調(diào)節(jié)作用、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、治療哮喘、抗氧化、降血糖、抗腫瘤活性[2-8]等作用。

沉香在市場上流通存有沉香片、沉香勾絲、沉香蟲漏3種規(guī)格,沉香片是白木香含有樹脂的片狀木材。沉香勾絲是用鉤刀鉤剃沉香木取香時,往往要剃到白木和沉香油脂的交界處,在剃香過程中,白木屑上或多或少都附有一些沉香。這種含沉香油脂極少的沉香木屑叫“勾絲”[8]。沉香蟲漏(Chong-Lou agarwood)為瑞香科植物白木香樹體受到天牛、木蠹蛾或白蟻等蛀干類昆蟲蛀蝕傷害形成的含有樹脂的木材,具有圓形或者橢圓形的蟲孔、彎曲交錯的蟲道(木蠹蛾、天牛幼蟲等蛀食)或者大小各異、形狀不規(guī)則的蟲孔(白蟻等蛀食),蛀蝕面具有腐木[9]。三者使用方向不同,沉香片多用于中藥飲片藥用,價格高昂;沉香蟲漏和沉香勾絲多用于沉香制燃“香”,但是三者打粉后外觀類似,不易區(qū)分,甚至影響沉香優(yōu)質(zhì)優(yōu)價,然而目前文獻關(guān)于三者的化學對比鮮有報道。

近年來超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)已廣泛應用于中藥材的化學成分研究[10],并且基于質(zhì)譜的定性鑒定結(jié)果利用化學計量學技術(shù)可以有效尋找不同規(guī)格間差異性成分,通過UPLC等技術(shù)定量驗證可以找到有效區(qū)分定量手段,因此本研究擬基于UPLC-Q-TOF-MS鑒定并比較沉香片、沉香蟲漏、沉香勾絲之間的化學成分差異性,同時對3者中差異指標性成分沉香四醇和8-四氫色酮(8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羥基-5,6,7,8-四氫色酮)的含量進行測定,為沉香藥材的優(yōu)劣的判斷提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Xevo G2飛行時間質(zhì)譜儀(美國Waters公司);ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司);ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司);CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司);KQ-500E臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Cascada I超純水機(美國PALL公司);MM400研磨儀[德國萊馳(RETSCH)公司]。

A.沉香片;b.沉香蟲漏;c.沉香勾絲

1.2 試藥甲醇、乙腈(質(zhì)譜純,德國Merck公司);甲酸(色譜純,阿拉丁試劑上海有限公司);沉香四醇對照品(批號:111980-201904,中國食品藥品檢定研究院);8-四氫色酮(批號:HR11166W2,Herbest Bio-Tech Co.,Ltd.);沉香片、沉香蟲漏、沉香勾絲樣品由福建中醫(yī)藥大學黃鳴清教授收集,并經(jīng)范世明正高級實驗師鑒定,均為瑞香科白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Gilg],見圖1;15批沉香藥材(S1～S5為沉香片、S6～S10為沉香蟲漏、S11～S15為沉香勾絲)用于UPLC-Q-TOF-MS分析;S16～S30為沉香片、S31～S45為沉香蟲漏、S46～S60為沉香勾絲,連同S1～15,用于UPLC含量測定。樣本存放于福建中醫(yī)藥大學藥學院標本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 UPLC-Q-TOF-MS色譜與質(zhì)譜條件Waters CORTECS UPLC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.6 μm);流動相乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫(0→0.5 min,15% A;0.5→1.0 min,15% A～25% A;1.0→6.0 min,25% A→35% A;6.0→7.5 min,35% A;7.5→9.0 min,35% A～40% A;9.0→12.5 min,40% A～58% A;12.5→13.5 min,58% A～85% A;13.5→14.0 min,85% A～95% A;14.0→16.0 min,15% A);流速0.30 mL·min-1;柱溫45 ℃;進樣量2 μL。飛行時間質(zhì)譜采用電噴霧負離子模式,毛細管電壓2.5 kV,噴霧器壓力0.2 MPa,碰撞能量10～40 eV。脫溶劑氣流:氮氣,流速800 L·h-1,脫溶劑溫度400 ℃,錐孔氣流:氮氣,錐孔電壓30.0 V,流速50 L·h-1,離子源溫度120 ℃,四極桿離子能量3.0 eV,碰撞氣體:氬氣。質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)采用全掃描負離子模式采集,數(shù)據(jù)采集范圍m/z50～1500。

2.1.2 UPLC含量測定色譜條件色譜柱為 Waters CORTECS UPLC C18(2.1 mm×100 mm,1.6 μm);以乙腈為流動相為A,以0.1%甲酸水為流動相B,梯度洗脫(0→5.5 min,10% A～12.0% A;5.5→12.0 min,12.0% A～14.0% A;12.0→16.0 min,14% A～20% A;16.0→21.0 min,20% A～25% A;21.0→26.0 min,25% A～35% A;26.0→31.0 min,35% A～50% A),流速為0.15 mL·min-1;檢測波長為252 nm;柱溫為30.0 ℃;進樣量為2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備分別精密稱取沉香四醇和8-四氫色酮對照品適量,分別置于5 mL量瓶中,用甲醇溶解稀釋至刻度,分別制成濃度為354 μg·mL-1沉香四醇和254 μg·mL-1的8-四氫色酮的單一對照品母液,其他不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液由對照品母液逐級稀釋,即得。

2.2.2 供試品溶液的制備取各沉香粉末(過三號篩)0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入95%乙醇10 mL,密塞,稱定重量,浸泡0.5 h,超聲處理1 h(功率250 W,頻率40 kHz),放冷,再次稱定重量,用95%乙醇補足減失的重量,用高速離心機10 000 r·min-1離心10 min,取上清液,用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液,用于UPLC含量測定。精密移取供試品溶液1 mL,置于25 mL量瓶中,用10%甲醇稀釋定容至刻度,搖勻,即得,用于UPLC-Q-TOF-MS成分鑒定。

2.3 沉香的化學成分鑒定結(jié)果

2.3.1 UPLC-Q-TOF-MS成分鑒定沉香樣品在“2.1.1”項下色譜條件及質(zhì)譜條件進行分析,沉香的乙醇提取液的UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖(TIC)(見圖2)。

化合物的鑒定方法是:首先,通過查閱國內(nèi)外沉香化學成分研究相關(guān)文獻,建立沉香化學成分數(shù)據(jù)庫。其次,根據(jù)UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖上各個色譜峰所得到的化合物分子離子峰信息,通過Masslynx V4.2軟件在±10 ppm的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)計算其精確分子式,與前期已建立的化學成分數(shù)據(jù)庫進行比對,對各個色譜峰化合物進行初步鑒定;第三,為了進一步確認化學結(jié)構(gòu),UPLC-Q-TOF-MS采用MSE模式對各個分子離子峰進行碰撞誘導解離(collision induced dissociatin,CID),通過二級質(zhì)譜的裂解,獲得化合物相應的碎片離子,根據(jù)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)信息推測質(zhì)譜裂解情況。共鑒定出沉香中27個化學成分(見表3)。以峰2為例,Q-TOF-MS給出分子離子峰317.100 4,為一級質(zhì)譜離子[M-H]-,Masslynx V4.2質(zhì)譜軟件計算出化學分子式C17H18O6,與沉香化學成分數(shù)據(jù)庫比對,與文獻報道的沉香四醇分子式一致。再根據(jù)Q-TOF-MS二級碎片離子有m/z299,281,253,190,175,經(jīng)過裂解推測二級質(zhì)譜上m/z299峰為[M-H-H2O]-,m/z281為[M-H-2H2O]-,m/z190為[M-H-2H2O-C7H7]-,m/z253為[M-H-2H2O-CO]-,m/z175峰為[M-H-2H2O-C7H7-CH3]-,可能的裂解圖(見圖3)。其他化合物的推測使用了相似的策略,根據(jù)UPLC-Q-TOF-MS測得的分子離子峰、二級碎片離子信息,由Masslynx V4.2軟件計算出精確分子量,與對照品或文獻中報道的沉香化學成分數(shù)據(jù)進行比對,共推測鑒定出27個化合物,其中化合物12、20、22、23、25、26、27因為分子離子峰信息與數(shù)據(jù)庫無法匹配,但是二級裂解均具有m/z299,281碎片離子(見圖3)與sesquiterpene-2-(2-phenylethyl) chromone母核化合物二級碎片離子相一致,因此推測其是sesquiterpene-2-(2-phenylethyl) chromone的衍生物[11],結(jié)果見表1。

表1 3種不同類別沉香的化學成分鑒定結(jié)果

圖3 峰2(沉香四醇)可能的裂解圖

2.3.2 多元統(tǒng)計分析基于上述鑒定結(jié)果,將所采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)先通過Progenesis QI V 2.0軟件進行峰對齊、峰提取、峰鑒別、歸一化等預處理[12],將峰面積數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA),結(jié)果見圖4。將15批沉香中27種成分的峰提取結(jié)果繪制聚類熱圖,結(jié)果見圖5。

CXP為沉香片;CXCL為沉香蟲漏;CXGS為沉香勾絲

2.4 UPLC定量測定

2.4.1 專屬性試驗分別精密量取對照品溶液、供試品溶液各2 μL,按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析。供試品溶液與混合對照品溶液在相同位置具有相同色譜峰,專屬性良好,結(jié)果見圖6。

A.對照品;B.沉香片;C.沉香蟲漏;D.沉香勾絲 1.沉香四醇峰;2.8-四氫色酮峰

2.4.2 方法學考察

2.4.2.1 線性關(guān)系考察取“2.2.1”項下方法制備的對照品溶液,用10%甲醇稀釋配制系列梯度濃度的對照品混合液。按“2.1.2”項下色譜條件測定峰面積,用對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)進行回歸,繪制標準曲線,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù),結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.2.2 精密度取“2.2.1”項下制備的對照品溶液,按“2.1.2”項下色譜條件1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次測定,測定各成分的峰面積,分別計算其峰面積的RSD,其精密度結(jié)果(見表3),表明儀器精密度良好。

表3 各化合物的精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=6)

2.4.2.3 穩(wěn)定性按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液(S4批次),分別于0、2、4、6、10、12、24 h按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定,測定各成分的峰面積,求出峰面積的RSD。結(jié)果見表3,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2.4 重復性精密稱取同一批沉香樣品6份(S4批次),按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定,計算2個化合物的含量及其RSD,結(jié)果見表3,表明方法重復性良好。

2.4.2.5 回收率精密稱取“2.4.2.4”項下已測知含量的沉香樣品(S4批次)6份,約0.1 g,按照重復性試驗測得的結(jié)果近似1∶1加入近似等量的對照品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定待測成分的量,計算回收率,結(jié)果見表4。

表4 沉香樣品中2個待測成分的回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.4.3 含量測定分別精密稱取不同批次的沉香樣品粉末(過3號篩)0.2 g各2份,分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定峰面積,計算各批次沉香樣品中2種化合物的含量,結(jié)果見表5。

表5 60批沉香各成分的含量(mg·g-1,n=3)

2.4.4 箱型圖分析進一步用OriginPro 2021軟件根據(jù)不同品類的沉香UPLC的含量測定數(shù)據(jù)結(jié)果,分析生成沉香四醇和8-四氫色酮含量的箱型圖,如圖7所示。

圖7 沉香中沉香四醇(A)和8-四氫色酮(B)含量箱型圖(***P<0.001)

3 討論

色酮類成分是沉香的主要成分之一,且是沉香中具有特征性的一類成分。在不同規(guī)格沉香藥材(沉香片、沉香蟲漏、沉香勾絲)中,如何快速鑒定并尋找其差異性成分是本研究的關(guān)鍵技術(shù),因此本文首先基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)手段,對沉香片、沉香蟲漏、沉香勾絲3種規(guī)格樣品進行化學成分快速鑒定,由于色酮類成分結(jié)構(gòu)含有多個羥基,該類化合物在負離子模式下能表現(xiàn)出較高的響應。最終在UPLC-Q-TOF-MS負離子模式下,從沉香3種規(guī)格中鑒定27個化合物。在此基礎上,利用OPLS-DA法,即通過分析樣品經(jīng)Progenesis QI V 2.0軟件所得數(shù)據(jù)建立的一個對沉香樣品分類和預測的監(jiān)督方法,OPLS-DA參數(shù)R2X描述了X變量中有多少變化可以用所選的組件解釋,R2描述了模型的擬合程度,Q2表示X對Y的預測能力,R2和Q2的取值范圍為0～1,其中越接近1表示越適合度和預測能力[12]。不同批次的樣品經(jīng)OPLS-DA分析,沉香樣品根據(jù)3種規(guī)格聚成3類,擬合優(yōu)度R2X(cum)=0.831,預測優(yōu)度R2Y(cum)=0.979,Q2=0.945,說明沉香樣本在OPLS-DA得分圖上聚類良好,顯著分離。R2X為0.831,表明所選組件可以對數(shù)據(jù)集中83.1%的變化進行建模,又因為R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2參數(shù)數(shù)值接近1,表明此OPLS-DA模型的模型擬合良好且預測能力好,可用于區(qū)分3種規(guī)格的沉香。進一步通過分析OPLS-DA模型中27個變量的VIP值,由于VIP值與模型貢獻率呈正相關(guān),以VIP>1為標準篩選出引起不同批次間差異較大的化學成分,發(fā)現(xiàn)包括沉香四醇(2)、8-四氫色酮(6)以及化合物bi-2-(2-phenylethyl) chromone(17)、aquisinenone K(18)、6,8-dihydroxy-7-methoxy-2-(2-phenylethyl) chromone(11)、4′,4”-dime-thoxyaquisinenone K(16)、[(3-Benzyl-4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl) oxy]acetic acid(15)、sesquiterpene-2-(2-phenylethyl) chromone derivative(12,20)、6-hydroxy-2-[2-(4′-hydroxy-3′-methoxy phenyl) ethyl]chromone(7)、5,6,7,8-tetrahydroxy-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone(3) 、[(4-Butyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl) oxy]acetic acid(9)、6-hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl) ethyl]chromone(8)、6,8-dihydroxy-2-[2-(3′-hydroxy-4′-methoxyphenyl) ethyl]chromone(4)、6-hydroxy-2-[2-(4′-hydroxyphenyl) ethyl]chromone(13)、2-(4-Butoxybenzyl) succinic acid sesquiterpenoids(10)、qinanone D(14)共17個成分的VIP值均大于1分,提示這些化合物是造成不同批次沉香差異性的主要化學成分,并通過進一步的熱圖分析發(fā)現(xiàn)3種不同規(guī)格的沉香17個差異性成分的響應差異比較:沉香片中化合物2、3、8、11、13、14等響應最大,優(yōu)于沉香蟲漏和沉香勾絲,但化合物12、20的響應較小;沉香蟲漏中化合物6、7、12、15、16、17、20等響應值高于沉香片和沉香勾絲,但化合物2、3、4、8、9、13的響應值均較低;沉香勾絲中大部分化合物的響應值較低,僅有化合物21和12響應值相對較高。

從TOF-MS定性鑒定并分析篩選了沉香片、沉香蟲漏、沉香勾絲3種規(guī)格的差異性成分,如何進一步驗證其分析的可靠性,需要進一步的含量測定驗證,結(jié)合中國藥典中沉香指標性成分有沉香四醇(2)和8-四氫色酮(6),本文進一步利用UPLC技術(shù)對兩者含量進行測定,結(jié)果結(jié)合箱型圖發(fā)現(xiàn)沉香片中沉香四醇的含量顯著高于沉香蟲漏和沉香勾絲,沉香蟲漏和沉香勾絲沒有差別,沉香蟲漏中8-四氫色酮含量顯著高于沉香片和沉香勾絲,而沉香片和沉香勾絲的含量較為接近。UPLC測定含量結(jié)果與OPLS-DA和熱圖分析結(jié)果相一致,即從定量角度也驗證了沉香3種不同規(guī)格的差異性,并且提示基于UPLC測定沉香四醇和8-四氫色酮含量也可以作為不同規(guī)格沉香分類的參考依據(jù)之一。通過利用UPLC-Q-TOF-MS的快速鑒定以及化學計量學的差異分析,可以快速篩選中藥不同規(guī)格中的差異性成分,進一步的根據(jù)TOF-MS鑒定結(jié)果篩選合適的指標進行UPLC的定量驗證并構(gòu)建定量方法,可為從中藥復雜體系中發(fā)現(xiàn)其規(guī)格區(qū)分的差異性Q-marker提供技術(shù)參考。

綜上,本試驗建立了不同規(guī)格沉香藥材(沉香片、沉香蟲漏、沉香勾絲)UPLC-Q-TOF-MS鑒定化學成分的分析方法,并建立其化學計量學分析方法;UPLC-DAD法可同時測定沉香中沉香四醇和8-四氫色酮的含量,可作為區(qū)分不同品種沉香的質(zhì)量標志物,為沉香的質(zhì)量控制提供新的依據(jù)。