郭子雨,趙軍,姚雨含,李晨陽(yáng)

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830046;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830004)

酒精性肝損傷(alcoholic liver injury,ALI)是由于長(zhǎng)期或大量飲酒所導(dǎo)致的肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常和功能障礙性疾病[1-2]。若無(wú)有效的治療方法,ALI會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化。近年來(lái),ALI已成為肝臟損傷的第二大病因,僅次于病毒性肝炎[3-6]。睡蓮花(Nymphaeacandida)為睡蓮科睡蓮屬植物雪白睡蓮的干燥花蕾,具有清熱補(bǔ)心、濕腦安神、降熱養(yǎng)肝之功效,臨床用于心虛、肝虛以及熱性感冒等疾病的治療,是維吾爾抗肝炎復(fù)方制劑炎消迪娜爾糖漿的主要藥味之一。研究顯示,睡蓮酚(isostrictiniin)是該藥材的主要特征性化合物,對(duì)半乳糖胺、刀豆蛋白誘導(dǎo)的急性肝損傷以及四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化均顯示了較好的防治作用[7-11]。因此,本文通過(guò)小鼠急性ALI模型研究睡蓮酚對(duì)ALI的防治作用及其作用機(jī)制,以期可為睡蓮花的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性昆明種小鼠72只,體重18～22 g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心:生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(新)2018-0002,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK(新)2018-0002,倫理審查編號(hào):IACUC-20220314-2。飼養(yǎng)條件:溫度22～23 ℃,濕度40%～50%,換氣良好,環(huán)境清潔,無(wú)外來(lái)傳染源,自由飲食和飲水。

1.1.2 主要試劑睡蓮酚(自制,純度98.7%);52°二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司);聯(lián)苯雙酯滴丸(Bifendate Pills,DDB;H11020980,北京協(xié)和藥廠(chǎng));總超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、甘油三酯(TG)試劑盒(A001-3、 A003-1、A006-2-1、A110-2-1,南京建成科技有限公司);小鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)Elissa試劑盒(JR18442D、JR20268D、 JL10484D,上海江來(lái)生物科技有限公司);油紅O和HE染色試劑盒(G1261、G1120,北京索萊寶公司);其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器Caris 200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(廈門(mén)優(yōu)邁科醫(yī)學(xué)儀器);Varioskan Flash酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司);HZQ-C全濕恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);KDC-2046低速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理小鼠ALI造模參照文獻(xiàn)[12]方法。將健康雄性昆明小鼠72只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,根據(jù)體重隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照聯(lián)苯雙酯組(DDB,63 mg·kg-1)和睡蓮酚低中高劑量組(25、50、100 mg·kg-1),每組12只。每天按設(shè)定劑量灌胃給藥,正常組和模型組灌胃給予等量蒸餾水。每次給藥2 h后,除正常組外,其余各組小鼠灌胃給予52°白酒(13 mL·kg-1),連續(xù)7 d。末次給藥并禁食16 h后,摘眼球取血,靜置后,3 000 r·min-1離心20 min,分離血清,凍存于-80 ℃ 冰箱待檢。頸椎脫臼處死小鼠,摘取肝臟,稱(chēng)重,計(jì)算肝臟指數(shù):肝臟指數(shù)(mg·g-1)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。將部分肝組織以預(yù)冷生理鹽水沖洗,置于4%多聚甲醛中固定,用于病理學(xué)觀(guān)察;再以錫箔紙包裹剩余肝臟放入液氮中速凍后放入-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.2.2 血清生化指標(biāo)的測(cè)定采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠血清ALT、AST、TG和TC含量。

1.2.3 肝組織生化指標(biāo)的測(cè)定精密稱(chēng)取小鼠肝組織,按照重量體積比加入9倍體積的生理鹽水,剪碎組織,冰水浴中制備勻漿,3 500 r·min-1,離心10 min,取上清液按照試劑盒說(shuō)明,測(cè)定小鼠肝組織MDA、GSH、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β及TG水平。

1.2.4 病理組織學(xué)檢查常規(guī)石蠟包埋,切片,進(jìn)行HE及油紅O染色,在光鏡下觀(guān)察肝組織病理學(xué)變化。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)Keap1、Nrf2、NQO1的mRNA表達(dá)以離心柱法抽提肝臟組織中的總RNA。在冰上配制體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),以實(shí)時(shí)熒光定量PCR考察mRNA的表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列組成

2 結(jié)果與分析

2.1 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠血清AST、ALT水平及肝臟指數(shù)的影響在試驗(yàn)過(guò)程中,正常對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)狀況良好,食欲旺盛,毛發(fā)光澤,未發(fā)生死亡;而模型組小鼠隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),小鼠口唇發(fā)紺,糞便干硬偏黃,小鼠食量減少,體形消瘦,且死亡4只,說(shuō)明酒精對(duì)小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷,造模成功。此外,在試驗(yàn)期間,聯(lián)苯雙酯組小鼠死亡1只,睡蓮酚中高劑量組各死亡2只,其低劑量組死亡3只;死亡原因同模型組。如圖1所示,模型組小鼠的肝臟系數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明小鼠攝入酒精后出現(xiàn)肝臟腫大。睡蓮酚中、高劑量組(50、100 mg·kg-1)能明顯降低酒精升高的肝臟系數(shù)(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比較,模型組小鼠血清ALT、AST含量明顯增加(P<0.01),分別升高了81.9%、51.6%,說(shuō)明酒精造成了肝細(xì)胞損傷。與模型組相比,睡蓮酚高劑量組(100 mg·kg-1)能明顯降低小鼠血清ALT活性(P<0.01)。結(jié)果表明睡蓮酚具有改善肝功能的作用,能夠減輕酒精所誘導(dǎo)的肝損傷。

圖1 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠血清ALT、AST以及肝臟系數(shù)的影響

2.2 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠血清TG和TC水平及肝組織TG水平的影響由圖2所示,與正常組相比,模型組小鼠血清TG、TC水平以及肝組織TG水平顯著升高(P<0.01),說(shuō)明大量酒精攝入導(dǎo)致肝組織及血液中的脂肪含量增加。與模型組相比,睡蓮酚中、高劑量組(50、100 mg·kg-1)均能使小鼠血清TG、TC含量及肝組織TG含量顯著下降(P<0.01),且呈現(xiàn)出了劑量-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。結(jié)果表明睡蓮酚可以降低血液中的脂肪含量,具有較好的抗脂肪變性和脂肪沉積作用,可以防治酒精性脂肪肝的發(fā)生。

圖2 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠血清TG、TC及肝組織TG水平的影響

2.3 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠肝組織MDA、GSH、SOD水平的影響如圖3所示,與正常組相比,模型組小鼠肝組織中MDA含量明顯增加(P<0.01),說(shuō)明酒精導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化,損傷了肝細(xì)胞。睡蓮酚低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg-1)能顯著降低酒精損傷致小鼠肝組織MDA的升高(P<0.01)。與正常組相比,模型組小鼠肝組織GSH和SOD活性顯著降低(P<0.01),說(shuō)明酒精導(dǎo)致的氧化損傷加快了抗氧化物質(zhì)的消耗。與模型組相比,睡蓮酚低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg-1)小鼠肝組織GSH和SOD活性明顯升高(P<0.01)。結(jié)果說(shuō)明睡蓮酚可通過(guò)抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化以及提高抗氧化物水平減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷。

圖3 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠肝組織GSH、MDA、SOD水平的影響

2.4 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響由圖4可見(jiàn),與正常組相比較,模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著增加(P<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比,睡蓮酚中、高劑量組(50、100 mg·kg-1)均能明顯降低小鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明,睡蓮酚可通過(guò)促炎細(xì)胞因子的調(diào)控發(fā)揮肝保護(hù)的作用。

圖4 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

2.5 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠肝組織病理學(xué)的影響HE染色結(jié)果見(jiàn)圖5,正常肝細(xì)胞邊界清晰有序,細(xì)胞核和靜脈毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)清晰,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和體細(xì)胞轉(zhuǎn)化。模型組小鼠肝組織有顯著改變,肝細(xì)胞變大,排列不整齊,而且有不規(guī)則脂肪空泡產(chǎn)生,肝血竇充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型相比,睡蓮酚劑量組的小鼠肝組織病理?yè)p傷均得到不同程度的改善,且有顯著的劑量-效應(yīng)趨勢(shì)。睡蓮酚低劑量組與模型組小鼠相近,但肝細(xì)胞腫脹和體細(xì)胞之間的邊界仍然存在,而中、高劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)較為正常,雖可見(jiàn)散在脂滴,但細(xì)胞間有著清晰的界限,不規(guī)則脂肪空泡減少,未見(jiàn)明顯炎癥。

A.HE染色;B.油紅O染色

油紅O染色結(jié)果與HE染色結(jié)果是相同的,在模型組小鼠肝細(xì)胞中,可以看到很多紅色脂滴,聯(lián)苯雙酯組和各劑量睡蓮酚組紅色脂滴下降顯著,而且睡蓮酚組均呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)趨勢(shì),聯(lián)苯雙酯組與睡蓮酚高劑量組程度相近。

2.6 RT-PCR法檢測(cè)ALI小鼠肝臟組織Keap1、Nrf2和NQO1的mRNA表達(dá)如表2所示,與正常組比較,模型組小鼠肝組織Nrf2、NQO1 mRNA的表達(dá)顯著減弱(P<0.01),Keap1顯著增強(qiáng)(P<0.01),說(shuō)明酒精灌胃促進(jìn)了Keap1/Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,提示酒精肝損傷可能與其激活Keap1信號(hào)通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。與模型組比較,睡蓮酚低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg-1)小鼠肝組織中Nrf2、NQO1 mRNA的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P<0.05,P<0.01),Keap1顯著降低(P<0.01),提示受試藥物及聯(lián)苯雙酯對(duì)肝損傷小鼠的保護(hù)作用,可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2通路實(shí)現(xiàn)的。

表2 睡蓮酚對(duì)ALI小鼠肝組織Keap1、Nrf2、NQO1 mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,多種途徑參與其中,但氧化應(yīng)激已被認(rèn)為在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。當(dāng)肝臟功能不全或是大量飲酒時(shí),超過(guò)機(jī)體的代謝能力,乙醇氧化分解的速度變慢,則容易發(fā)生肝臟損傷。酒精的過(guò)量飲用可抑制肝組織中GSH及SOD等抗氧化酶的合成,同時(shí)會(huì)導(dǎo)致H2O2、·OH等自由基的大量產(chǎn)生,引起脂肪過(guò)氧化,產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷,AST、ALT和MDA水平升高。作為脂肪代謝及檢測(cè)脂肪氧化的重要指標(biāo),在酒精引起的肝損傷中,TG、TC水平也顯著增加。睡蓮酚能降低AST、ALT、TG、TC水平及肝組織MDA水平,說(shuō)明睡蓮酚確有明顯的保肝降酶作用(TG、TC是血脂指標(biāo))。

細(xì)胞因子代謝異常是ALI的一個(gè)主要特征,在ALI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要作用。ALI小鼠的血清中,促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β顯著升高,這些因子的表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[13]。睡蓮酚給藥后,TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯降低,顯示睡蓮酚通過(guò)抗炎活性發(fā)揮肝保護(hù)作用。病理學(xué)觀(guān)察也證實(shí)了這一點(diǎn)。

氧化應(yīng)激通路中的相關(guān)蛋白Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)各種氧化應(yīng)激反應(yīng)中下游基因的編碼解毒酶和抗氧化蛋白[14]。生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1結(jié)合,其活性受到抑制。酒精刺激引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致Keap1和Nrf2分離,Nrf2解離后進(jìn)入細(xì)胞核,與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后,再與抗氧化反應(yīng)原件(ARE)結(jié)合,啟動(dòng)超醌氧化還原酶1(NQO1)等下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用[15-16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)睡蓮酚預(yù)防性給藥后,Nrf2和NQO1 mRNA表達(dá)較模型組顯著上升,抗氧化通路被激活,加速了自由基的清除,改善了氧化應(yīng)激引起的肝損傷。以上研究結(jié)果說(shuō)明,睡蓮酚對(duì)ALI確有較好的防治作用,其機(jī)制與Keap1/Nrf2抗氧化通路的激活、促炎因子的調(diào)控相關(guān)。