徐張揚,蔣蓓爾,張建,劉光盛,3,王楊凱,閔天驕,何穎

(1.海軍特色醫(yī)學(xué)中心海洋生物醫(yī)藥與極地醫(yī)學(xué)研究室,上海 200433;2.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,上海 200433;3.海軍軍醫(yī)大學(xué)研究生院,上海 200433)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性的炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD),其臨床癥狀主要以腹痛、腹瀉和血便為主,常伴有發(fā)熱、腫脹、惡心、嘔吐等癥狀[1]。隨著生活壓力的增大以及飲食結(jié)構(gòu)的改變,該病在我國的發(fā)生率不斷增高。UC的發(fā)病機(jī)制尚不明確,涉及環(huán)境因素、遺傳、免疫平衡失調(diào)及腸屏障缺陷等多個方面[2-3]。近年來,多項研究表明,腸道微生物與機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡失調(diào)在UC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[4-7]。腸道微生物的組成差異不僅影響了腸上皮屏障的完整性,且對腸道內(nèi)各種代謝物的產(chǎn)生起重要作用[8]。因此,調(diào)控UC患者紊亂的腸道微環(huán)境將成為治療UC的新型治療手段[9]。

目前,UC的臨床治療以西醫(yī)為主,主要包括糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸類藥物和免疫抑制劑等,但這類藥物長期使用具有明顯的毒副作用,且療效不盡人意[10-12]。近年來,中醫(yī)藥治療UC效果顯著,不良反應(yīng)較少且復(fù)發(fā)率低[13-15]。本研究基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論,認(rèn)為UC的病機(jī)多為本虛標(biāo)實,以脾虛、腎虛為本,濕熱為標(biāo)[14,16]。因此參考王長洪教授提出的治療UC的學(xué)術(shù)思想[17],即溫中健脾、清熱祛濕和活血化瘀,自擬了由山藥、焦山楂、陳皮、炒薏苡仁四味藥食同源的中藥組成的,具有健脾止瀉、緩解胃腸功能紊亂的健脾化濕方,探究其對UC的治療效果,并通過16S rRNA測序技術(shù)研究其對UC小鼠腸道菌群的影響,為健脾化濕方治療UC的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗動物SPF級C57BL/6雄性小鼠32只,6～8周齡,體重18～20 g[上海靈暢生物科技有限公司,許可證號為SCXK(滬)2013-0018]。飼養(yǎng)于海軍特色醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心,許可證號為SYXK(滬)2017-0019。溫度18～22 ℃,相對濕度50%～60%。試驗前小鼠正常飲食、飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。本研究中所有動物實驗均經(jīng)過海軍特色醫(yī)學(xué)中心動物倫理實驗委員會批準(zhǔn)實施。

1.2 藥品與試劑葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium,DSS)(美國MP Biomedicals公司,批號:02180139);TNF-α ELISA試劑盒(批號:YX-201407M)、 IL-6 ELISA試劑盒(批號:YX-091206M)、IL-1β ELISA試劑盒(批號:YX-091203M)均上海百艦生物科技有限公司;美沙拉嗪緩釋顆粒(上海愛的發(fā)制藥);健脾化濕方:山藥15 g、焦山楂7 g、陳皮3 g和炒薏苡仁15 g組成,由北京康仁堂藥業(yè)制備成健脾化濕方免煎顆粒,相當(dāng)于含生藥6.065 g·kg-1。

1.3 主要儀器與設(shè)備高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司);生物顯微鏡(德國Leica公司);Multiskan FC全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);ABI ViiATM實時熒光定量PCR(美國Applied Biosystems公司);NanoDrop2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及給藥將32只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組,每組8只,分別為正常對照組、模型組、美沙拉嗪組(600 mg·kg-1)和健脾化濕組(800 mg·kg-1)。各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,正常對照組給予正常飲用水,其余3組替換成含3%DSS的飲用水,自由飲用7 d,誘導(dǎo)小鼠UC模型,第8～9天均給予正常飲用水。自造模第1天起同步進(jìn)行灌胃給藥,正常對照組和模型組每天給予0.2 mL生理鹽水,其他各組每天給予0.2 mL相應(yīng)藥物溶液,每天給藥1次,連續(xù)給藥9 d。每日觀察并記錄實驗小鼠的一般情況、體質(zhì)量、攝食量和飲水量,以及大便性狀和便血情況(見表1)。

表1 糞便狀態(tài)和便血情況評分

1.4.2 樣本采集與處理于實驗第9天,采用頸椎脫臼法處死所有小鼠,分離整段結(jié)腸,測量各組小鼠結(jié)腸長度并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。縱行剖開整段結(jié)腸,取結(jié)腸內(nèi)糞便顆粒(2～3粒)于凍存管中,迅速放入液氮內(nèi),并于-80 ℃冰箱保存。用預(yù)冷PBS多次沖洗結(jié)腸組織。取各組小鼠相同位置的結(jié)腸組織(1 cm)放入10倍體積的4%多聚甲醛溶液中,室溫靜置24 h進(jìn)行固定。另取1 cm結(jié)腸組織于EP管,加入5倍體積生理鹽水勻漿,靜置離心后取上清液于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)分析取4%多聚甲醛溶液固定后的結(jié)腸組織進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋、切片、HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸組織的形態(tài)學(xué)變化(見表2)。

表2 病理學(xué)組織評分

1.4.4 結(jié)腸組織中炎癥因子檢測取低溫保存的結(jié)腸組織勻漿上清液,快速復(fù)蘇,并按ELISA試劑盒方法檢測各組小鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6水平。

1.4.5 糞便中細(xì)菌DNA的提取及檢測用E.Z.N.A.Stool DNA Kit試劑盒提取糞便中的總DNA,用紫外分光光度計檢測DNA的濃度,并通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 提取質(zhì)量。

1.4.6 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物回收以細(xì)菌16S rRNA的V3～V4可變區(qū)序列為靶標(biāo),使用帶Barcode序列的特異引物(338F-806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得PCR產(chǎn)物并用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物。

1.4.7 文庫構(gòu)建和高通量測序通過Agilent 2100生物分析儀(Agilent,美國)和Illumina(Kapa Biosciences,Woburn,MA,美國)的文庫定量試劑盒分別評估擴(kuò)增子文庫的大小和數(shù)量。在NovaSeq PE250平臺上對庫進(jìn)行排序。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 27和Graphpad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析并制圖。其中體重下降率采用兩因素重復(fù)測量資料的方差分析;糞便黏稠度和便血程度采用非參數(shù)檢驗克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(Kruskal-Wallis test);多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,并使用圖基檢驗(tukey test)進(jìn)行事后檢驗。腸道菌群樣本結(jié)構(gòu)差異分析采用主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)、相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM)和置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)進(jìn)行組間差異檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般體征情況如圖1所示,正常對照組小鼠狀態(tài)良好,攝食和飲水正常,體重沒有明顯變化;模型組自造模開始后,攝食飲水逐日減少,活動能力下降,毛色黯淡無光澤,從造模第6天起,體重下降較正常對照組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),美沙拉嗪組和健脾化濕組小鼠體重也有一定的降低,但下降幅度小于模型組,于第7天起同模型組比較呈顯著性差異(P<0.05)。造模第3天開始,模型組小鼠排便次數(shù)增加,出現(xiàn)軟便、稀水樣便等情況,第5天出現(xiàn)糞便隱血、膿血便等情況,兩個給藥小鼠組同樣也出現(xiàn)水便、血便等癥狀,但癥狀均輕于模型組。因此,健脾化濕方能有效改善實驗小鼠結(jié)腸炎癥狀。

A.體重變化量;B.平均糞便黏稠度評分;C.平均便血程度評分

2.2 小鼠結(jié)腸長度變化如圖2所示,與正常對照組相比,模型組小鼠結(jié)腸長度顯著縮短(P<0.001),腸管充血出現(xiàn)不同程度的水腫,腸腔內(nèi)存留大量稀便;與模型組相比,美沙拉嗪組和健脾化濕組小鼠結(jié)腸長度增加,且健脾化濕組與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)。

圖2 健脾化濕方對DSS誘導(dǎo)的UC結(jié)腸長度的影響

2.3 HE染色及病理組織學(xué)評分如圖3A所示,正常對照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整,腸腺上皮細(xì)胞形態(tài)正常,排列緊密,黏膜未見炎性細(xì)胞浸潤;模型組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完全被破壞,黏膜層腸腺排列不規(guī)則甚至消失,并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤;健脾化濕組小鼠給藥后結(jié)腸組織完整性明顯改善,腺體結(jié)構(gòu)相對完整,炎性細(xì)胞浸潤減少,其藥效優(yōu)于陽性藥美沙拉嗪。病理組織學(xué)評分結(jié)果如圖3B所示,模型組小鼠結(jié)腸病理評分顯著高于正常對照組(P<0.001);與模型組相比,健脾化濕組評分顯著降低(P<0.001),結(jié)果表明健脾化濕方能有效改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸損傷。

A.結(jié)腸組織HE切片染色情況(×40);B.HE切片病理組織評分情況

2.4 結(jié)腸組織中炎癥因子檢測結(jié)果如圖4所示,與正常對照組相比,模型組小鼠結(jié)腸組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高(P<0.001)。與模型組相比,美沙拉嗪組及健脾化濕組的3個炎癥因子表達(dá)均顯著降低(P<0.001)。因此,健脾化濕方與美沙拉嗪都能有效抑制UC小鼠局部結(jié)腸組織促炎因子的表達(dá)。

A.TNF-α含量;B.IL-1β含量;C.IL-6含量

2.5 腸道菌群測序結(jié)果

2.5.1 UC小鼠結(jié)腸組織菌群多樣性分析α多樣性反應(yīng)微生物菌群的豐富度和均勻度,常用于比較不同分組中物種多樣性的差異。我們采用2個指標(biāo)分別進(jìn)行評價:Chao1和Shannon,其中Chao1反映樣本中菌群豐富度,但不考慮細(xì)菌群落每個物種的豐度情況,而Shannon指數(shù)則反映物種的豐富度和均勻度,Shannon值越高,說明物種多樣性越高。結(jié)果如圖5所示,DSS誘導(dǎo)的UC小鼠腸道菌群多樣性顯著降低(P<0.001),經(jīng)美沙拉嗪和健脾化濕方治療后,2組小鼠腸道菌群多樣性有了一定提高,但給藥組和模型組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。為了進(jìn)一步比較不同分組間微生物群落整體組成的相似性和差異情況,我們進(jìn)行了加權(quán)的主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA),基于weighted_unifrac距離計算物種的距離并排序,根據(jù)排序計算前兩軸的坐標(biāo)位置而得到圖6。同時進(jìn)行相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM),比較組間和組內(nèi)差異的大小。R值為0.693 7,趨向于1,提示組間差異大于組內(nèi)差異,且P=0.001<0.05,表示不同的干預(yù)措施下的組間物種組成差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

A.腸道菌群多樣性Chao1指數(shù);B.腸道菌群多樣性Shannon指數(shù)

圖6 健脾化濕方對DSS誘導(dǎo)的UC小鼠腸道菌群β多樣性的影響(n=5)

為進(jìn)一步明確不同處理方式兩兩之間對物種組成差異的影響,我們進(jìn)行了pairwise.adonis配對檢驗,如表3所示,健脾化濕組與模型組、健脾化濕組與正常對照組和美沙拉嗪組與正常對照組的組間微生物物種組成具有顯著差異(P=0.01),而健脾化濕組與美沙拉嗪組的微生物物種組成無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.094),提示與模型組相比,健脾化濕方與美沙拉嗪的干預(yù)處理對微生物群落組成的影響具有相似或統(tǒng)計學(xué)一致性,但仍與正常對照組存在顯著差異。因此,健脾化濕方能有效調(diào)節(jié)并在一定程度上恢復(fù)UC小鼠腸道菌群的多樣性。

表3 配對ADONIS分析結(jié)果(n=5)

2.5.2 UC小鼠結(jié)腸組織菌群結(jié)構(gòu)和差異分析采用QIIME 2分析流程,將feature(特征)數(shù)據(jù)與16s數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對,鑒定各組在門和屬水平的物種組成差異。結(jié)果顯示,在正常對照組中,擬桿菌門(79.26%)、厚壁菌門(16.40%)、變形菌門(1.01%)、Epsilonbacteraeota(0.63%)為4大主要細(xì)菌門類。S24-7菌、Alloprevotella、Muribaculum、Alistipes是正常對照組屬水平上的主要構(gòu)成。在模型組中,厚壁菌門(60.23%)、Epsilonbacteraeota(15.55%)、擬桿菌門(13.91%)、變形菌門(8.44%)為4大主要的細(xì)菌門類。相較正常對照組而言,模型組厚壁菌門、Epsilonbacteraeota和變形菌門比例有所上升,而擬桿菌門比例顯著下降。在健脾化濕組中,擬桿菌門(41.38%)、厚壁菌門(32.02%)、疣微菌門(11.67%)和變形菌門(6.66%)為4大主要的細(xì)菌門類,其中擬桿菌門和厚壁菌門的占比與正常對照組相似,而疣微菌門首次出現(xiàn)在主要菌種中,提示該菌在緩解UC過程中可能發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步通過LEfSe(LDA值>4)進(jìn)行菌群差異分析。結(jié)果顯示,擬桿菌門、f_Muribaculaceae、g_Alloprevotella是正常對照組主要的顯著差異菌;模型組中顯著性最高的為f_Helicobacteraceae、p_Epsilonbacteraeota、c_Campylobacteria、f_Ruminococcaceae;健脾化濕組的差異菌群主要是p_Proteobacteria、c_Gammaproteobacteria、f_Enterobacteriaceae、g_Akkermansia。以上結(jié)果表明,健脾化濕方給藥干預(yù)后,擬桿菌門比例顯著增高、厚壁菌門和變形菌門比例顯著降低,此外Akkermansia、Alloprevotella等益生菌比有所上升,提示菌群結(jié)構(gòu)和組分的改變可能在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

3 討論

UC的臨床癥狀主要以腹痛、腹瀉和血便為主,病程長,病情遷延反復(fù),在中醫(yī)里屬“腸澼”“痢疾”“泄瀉”等范疇[18]。其病機(jī)多以脾虛為本,濕熱為標(biāo),血瘀貫穿疾病始末。在脾虛的基礎(chǔ)上因外感濕邪或情志不遂,熱毒內(nèi)蘊,久蘊成毒。脾胃受損,濕熱內(nèi)蘊,清濁不分,混雜而下,并走腸間,以致UC[19]。本研究基于此,創(chuàng)立了具有健脾止瀉、緩解胃腸道功能紊亂的健脾化濕方。該方由四味藥食同源的中藥組成,其中山藥可補脾養(yǎng)胃,用于脾胃虛弱,食少體倦或便溏、泄瀉[20-21];焦山楂活血化瘀、消食導(dǎo)滯[22];陳皮理氣調(diào)中,燥濕化痰[23-24];炒薏苡仁利水勝濕而健脾。本研究結(jié)果證明,健脾化濕方能顯著改善小鼠體重,減輕腹瀉和便血癥狀,組織病理學(xué)結(jié)果顯示,腸道炎細(xì)胞浸潤減少,腸黏膜狀態(tài)恢復(fù)良好。

盡管UC的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚,但腸道菌群與UC的關(guān)系是近年來的研究熱點[25-28]。一系列臨床研究發(fā)現(xiàn),UC患者和健康對照者腸道細(xì)菌存在顯著差異。Mafarlane等[29]通過16S rRNA熒光探針原位雜交法探究UC患者直腸活檢樣本中的菌群組成,發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌比正常組減少約30倍;多中心臨床研究結(jié)果顯示,UC患者大腸桿菌數(shù)量顯著高于正常正常對照組,但雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量低于正常組[30]。腸道菌群在UC中發(fā)揮重要作用,多表現(xiàn)為正常菌群破壞、細(xì)菌多樣性降低和致病菌增加等[4]。此外,腸道菌群對腸道通透性的改變具有一定影響。正常生理環(huán)境下,不同菌群相互制約、互為依存,形成相對復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。但在UC病理條件下,腸道通透性增高,腸腔內(nèi)微生物進(jìn)入腸粘膜固有層,破壞腸黏膜的免疫屏障作用,過度激活免疫系統(tǒng),腸道免疫力降低。因此,UC遺傳易感性的患者,其維持腸道微環(huán)境的能力往往較弱,腸道菌群狀態(tài)不穩(wěn)定。糞便微生物菌群移植(fecal microbiota transplantation,FMT)近年來已被用于多種與腸道菌群相關(guān)的疾病。臨床結(jié)果顯示,UC患者接受FMT治療后,其癥狀緩解率顯著高于安慰劑組,且未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)[31]。因此通過調(diào)控UC患者紊亂的腸道微環(huán)境是治療UC的新型治療手段。

本研究經(jīng)菌群分析發(fā)現(xiàn),UC小鼠腸道菌群多樣性降低,健脾化濕方在一定程度上能改善和恢復(fù)菌群多樣性。已有研究表明,與健康人群相比,UC患者厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門和Epsilonbacteraeota相對豐度顯著提高,而擬桿菌門的相對豐度顯著下降。在本研究中,模型組厚壁菌門、Epsilonbacteraeota和變形菌門顯著升高,擬桿菌門顯著下降,與上述臨床結(jié)果一致。在屬水平上,DSS誘導(dǎo)后,各組UC小鼠乳酸菌相對豐度均有所降低,健脾化濕方干預(yù)后,Akkermansia等益生菌比例有所上升。乳酸菌能調(diào)節(jié)腸道免疫平衡,抑制致病菌的黏附與侵襲,維護(hù)腸黏膜屏障穩(wěn)定[32],而DSS誘導(dǎo)導(dǎo)致乳酸菌降低,削弱腸黏膜對各致病因素的防御作用。益生菌能夠改善腸黏膜屏障和免疫系統(tǒng)功能,從而促進(jìn)抗炎因子的分泌,抑制腸道中有害細(xì)菌的生長。益生菌也能夠外源性地補充UC患者腸道中減少的菌群種類,改善和恢復(fù)腸道菌群平衡。Akkermansia是一個潛在的益生菌,能夠抑制腸道炎癥,促進(jìn)局部炎癥環(huán)境下腸上皮細(xì)胞的增殖和遷移,參與調(diào)節(jié)腸道黏膜的宿主免疫穩(wěn)態(tài),改善腸道屏障功能[33]。在本研究中,由于樣本量較低,盡管試驗結(jié)果顯示健脾化濕方給藥后能夠在一定程度上改善和恢復(fù)菌群多樣性,但該結(jié)果并未體現(xiàn)出顯著性差異。因此,腸道菌群的變化趨勢僅為我們下一步研究提供了方向與思路,需深入試驗以精確找到具有生物學(xué)意義的差異菌群供后續(xù)分析,為健脾化濕方臨床治療UC提供進(jìn)一步的實驗依據(jù)。

綜上,健脾化濕方可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成,加快菌群恢復(fù),改善菌群結(jié)構(gòu)發(fā)揮治療UC的作用,對于指導(dǎo)中藥治療UC具有重要意義。