張虎,黃欣,李妍,韓毅,李羚

(山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院<山東省千佛山醫(yī)院>臨床藥學(xué),山東省兒童藥物臨床評價與研發(fā)工程技術(shù)研究中心,山東省醫(yī)藥衛(wèi)生臨床藥學(xué)重點實驗室,山東 濟南 250014)

肺癌是全球癌癥死亡的首要原因,同時也是中國高發(fā)癌癥之一[1]。近年來肺癌的治療取得了較大的進展,比如新的治療藥物免疫檢查點抑制劑的療效已經(jīng)得到了證實[2-3],但仍有患者面臨著耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和個體差異等問題,限制了現(xiàn)有藥物的使用[4]。因此有效控制肺癌的發(fā)展及改善患者的總體生存期仍面臨巨大的挑戰(zhàn),尋找新的治療靶點和新的治療藥物也變得尤為重要。

通過整合基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫,可以更深入的研究腫瘤相關(guān)基因、分子機制,在基因?qū)用鏋槟[瘤的治療尋找新的生物標志物。開發(fā)一種新的藥物需要大量資金,時間和各種資源的投入,并且伴有一定的風(fēng)險,而藥物重定位是一種非常規(guī)的方法來識別已批準或?qū)嶒炈幬锏男逻m應(yīng)證[5],Connectivity Map(CMap)數(shù)據(jù)庫是基于基因表達譜的藥物研究平臺,該數(shù)據(jù)庫通過大量細胞系實驗將基因、藥物和疾病聯(lián)系起來[5]。通過CMap數(shù)據(jù)庫,可篩選逆轉(zhuǎn)肺癌的基因表達變化的藥物。本研究通過生物信息學(xué)和CMap數(shù)據(jù)庫分析,篩選出肺癌的關(guān)鍵致病基因和候選治療藥物,為肺癌的治療提供了新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的下載和DEGs的篩選從GEO(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中獲得基因表達譜數(shù)據(jù)集,GSE89039采用GPL17077平臺,其包括8個肺癌組織樣本和8個正常組織樣本,GSE118370采用GPL570平臺,其包括6個浸潤性肺腺癌組織樣本和6個正常組織樣本,GSE136043采用GPL13497平臺,其包括5個肺癌組織樣本和5個正常組織樣本。采用R軟件篩選DEGs,所篩選的條件為|log2FC|≥1.0,P<0.05[6],將篩選出的差異基因通過R語言(v4.2.3)可視化為火山圖。

1.2 GO和KEGG的分析通過DAVID(v2021)進行GO(Gene Ontology,GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析[7]。將差異基因在GO數(shù)據(jù)庫進行細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)三方面的富集分析,在KEGG數(shù)據(jù)庫進行細胞相關(guān)通路的富集分析。使用Benjamini-Hochberg方法調(diào)整P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率,將調(diào)整后的P<0.05的富集設(shè)定為顯著富集的臨界標準[8],并且通過R語言來可視化DAVID的分析結(jié)果。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析和樞紐基因篩選將3個數(shù)據(jù)集中的交集基因放入相互作用基因/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(STRING)中,高于0.4的相互作用評分設(shè)定為截止值[9]。使用Cytoscape軟件(v3.9.1)構(gòu)建DEG編碼蛋白的網(wǎng)絡(luò),并將其可視化,展現(xiàn)重疊DEG之間潛在的相互關(guān)系[6]。

通過插件CytoHubba基于度的拓撲算法來分析網(wǎng)絡(luò),將具有高相互作用的前10個基因鑒定為樞紐基因。MCODE(分子復(fù)合物檢測)插件來可視化和鑒定來自PPI網(wǎng)絡(luò)的重要模塊,參數(shù)設(shè)置設(shè)為默認值:degree=2,node score=0.2,k-core=2,maximum depth=100[10]。

1.4 樞紐基因的生存分析使用基因表達譜交互分析(GEPIA)中的箱形圖比較每個樞紐基因在肺癌組織和正常組織之間的差異表達譜[11]。使用Kaplan-Meier分析樞紐基因上調(diào)或下調(diào)患者的總生存期(overall survival,OS)[12]。

1.5 CMap數(shù)據(jù)庫篩選候選藥物利用Cytoscape計算差異基因中PPI得分前100的基因集合,包括27個上調(diào)基因和73個下調(diào)基因。將這100個差異基因輸入CMap(https://clue.io/)數(shù)據(jù)庫,所得結(jié)果按照Score大小進行排序,篩選負相關(guān)的候選藥物。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析Kaplan-Meier的生存分析,采用對數(shù)秩和檢驗,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。在線數(shù)據(jù)庫分析應(yīng)用系統(tǒng)默認的統(tǒng)計學(xué)方法。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因的篩選在本研究中,共有38個樣本,包括19個肺癌組織樣本和19個正常肺部組織樣本(GSE89039:8T/8N;GSE118370:6T/6N;GSE136043:5T/5N)。在基因表達測定及數(shù)據(jù)處理和標準化之后,使用Limma包對每個數(shù)據(jù)集篩選DEGs,篩選標準為:|log2FC|≥ 1.0且P值< 0.05。最終我們從GSE89039數(shù)據(jù)集中篩選了2 708個DEGs,包括1 093個上調(diào)和1 615個下調(diào)的基因(見圖1A);在GSE118370中篩選了1 887個DEGs,包括814個上調(diào)和1 073個下調(diào)的基因(見圖1B);在GSE136043中篩選了2 352個DEGs,包括1 164個上調(diào)和1 188個下調(diào)的基因(見圖1C)。接下來,我們分別取3個基因數(shù)據(jù)集上調(diào)基因和下調(diào)基因中的重疊基因,得到150個共有上調(diào)基因和380個共有下調(diào)基因,共計530個DEGs(見圖1D、E)。

2.2 差異基因的功能富集分析我們將530個DEGs進行GO和KEGG的富集分析。結(jié)果顯示KEGG通路富集主要是ECM-受體相互作用,這些相互作用導(dǎo)致細胞活動的直接或間接控制,如黏附、遷移、分化、增殖和凋亡(見圖2A)。對于GO_BP富集分析,它們在細胞黏附,細胞外基質(zhì)組織,血管生成,細胞分化等富集,細胞黏附分子與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),起至關(guān)重要的作用。對于GO_MF分析,它們富集在鈣離子結(jié)合,細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分,信號受體活性等分子功能方面。GO_CC分析顯示,它們在細胞質(zhì)膜的組成成分,細胞表面,轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等部位富集(見圖2B)。

A.KEGG富集分析;B.GO富集分析,自上而下分別為生物過程(BP)、細胞成分(CC)、分于功能(MF)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)模塊分析將530個DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),由圖3A可知,PPI網(wǎng)絡(luò)由527個節(jié)點蛋白和1298個相互作用組成。通過Cytoscape的MCODE插件將整個網(wǎng)絡(luò)聚類為12個模塊,對模塊得分前二進行富集分析。由圖3B可知,模塊1包含10個上調(diào)基因和10個下調(diào)基因,主要富集于PI3K-Akt 信號通路,該通路某些因素的突變導(dǎo)致的功能獲得或功能缺失,引起細胞轉(zhuǎn)化,同時可調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和存活,并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)。模塊2包含3個上調(diào)基因和15個下調(diào)基因,顯著富集于癌癥通路,RNA聚合酶Ⅱ啟動子pri-miRNA轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等,與腫瘤密切相關(guān)。

A.肺癌相關(guān)網(wǎng)絡(luò);紅色表示常見的上調(diào)基因,藍色表示常見的下調(diào)基因;B.差異基因中的前兩個基因模塊;C.肺癌相關(guān)差異基因的前10個樞紐基因模塊

通過Cytoscape的CytoHubba插件在重疊DEGs中選擇樞紐基因。篩選前10個基因作為樞紐基因,包括IL-6、PECAM1、VWF、FGF2、CAV1、MMP9、CDH5、SDC1、SPP1和PPARG,10個樞紐基因之間的PPI連接見圖3C。

2.4 樞紐基因的鑒定接下來,我們使用GEPIA比較10個樞紐基因的差異表達(見圖4)。在這10個樞紐基因中,MMP9、SDC1和SPP1在肺腺癌(LUAD)和肺鱗狀細胞癌(LUSC)中均上調(diào)表達,其余7個基因在LUAD和LUSC均下調(diào)表達,與3組數(shù)據(jù)集中基因表達一致。為了檢驗這些基因的預(yù)后價值,我們通過GEPIA分析這些樞紐基因相關(guān)的總生存期(overall survival,OS),結(jié)果顯示SPP1對OS具有顯著影響(見圖5)。

圖5 SPP1的總生存期(OS)曲線

使用GEPIA中唯一的腫瘤數(shù)據(jù)對十個樞紐基因進行多基因比較分析。在十個基因中,SDC1和SPP1具有較高的表達水平,其次是CAV1、PECAM1、VWF、MMP9、CDH5、PPARG、IL-6、FGF2(見圖6)。

圖6 10個肺癌候選生物標志物的多基因比較分析

2.5 CMap數(shù)據(jù)庫篩選候選藥物CMap數(shù)據(jù)庫包含廣泛的小分子庫,藥物的高陽性評分表明藥物可以引起或加劇疾病狀態(tài),而高陰性評分表明藥物能夠減輕甚至逆轉(zhuǎn)該疾病狀態(tài)[12]。我們將27個上調(diào)基因和73個下調(diào)基因輸入CMap數(shù)據(jù)庫中,篩選FDA批準上市的得分前8的藥物,具體見表1。

表1 CMap篩選的抗肺癌候選藥物

3 討論

通過對肺癌細胞與正常細胞之間的基因測序,對肺癌作用機制的分析和理解更加深入,促進了分子診斷和靶向治療研究的進展,因此我們通過生物信息學(xué)分析來尋找肺癌組織樣本中有明顯差異的生物標志物,為肺癌的治療尋找新的思路與方案。在本研究中,我們建立了差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò),篩選出基因之間相互作用得分前十的差異基因作為與肺癌發(fā)生發(fā)展顯著關(guān)聯(lián)的樞紐基因,驗證樞紐基因在肺腺癌與肺鱗癌樣本組織中的表達情況,發(fā)現(xiàn)除了SDC1在肺腺癌樣本中無顯著差異外,其他樞紐基因均與正常肺部組織樣本基因表達量存在統(tǒng)計學(xué)差異。之后在基因的預(yù)后價值分析中,SPP1低表達患者的總生存期顯著高于SPP1高表達患者。另外,有報道表明[13],非小細胞肺癌中循環(huán)SPP1水平或腫瘤細胞中SPP1表達水平的升高與預(yù)后不良有關(guān)。Yi等[14]研究也發(fā)現(xiàn)SPP1通過上調(diào)COL11A1的表達促進細胞遷移和侵襲,將SPP1作為肺腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的潛在生物標志物,并且在化療治療的晚期非小細胞肺癌患者中,SPP1編碼的骨橋蛋白在血漿中低水平表達與臨床預(yù)后的改善顯著相關(guān)[15],這與我們的研究一致。

藥物治療療效的個體差異和耐藥性的出現(xiàn)限制了現(xiàn)有藥物的使用,且現(xiàn)有化療藥物不良影響較大,降低了癌癥患者的生活質(zhì)量,因此,這也增加了對新的候選藥物的需求。然而研究和開發(fā)一種全新的藥物需要大量的金錢和時間,需要廣泛的進行細胞和動物研究,以及在人體進行各種安全性和有效性的臨床試驗[16],而藥物重新定位具有成本低、風(fēng)險小、周期短等優(yōu)勢,現(xiàn)已成為國內(nèi)外各醫(yī)藥機構(gòu)藥物研發(fā)的重要策略[17]。在本研究中,我們將PPI中基因相互作用得分前100的基因輸入到CMap數(shù)據(jù)庫中,篩選出8種經(jīng)FDA批準上市的藥物,其中有7種為抗腫瘤藥物,分別為克拉屈濱、氯法拉濱、替尼泊苷、拓撲替康、阿糖胞苷、吉西他濱和放射菌素;剩余一種非抗腫瘤藥物為阿糖腺苷。拓撲替康和替尼泊苷為拓撲異構(gòu)酶抑制劑,前者適用于肺癌的治療[18],后者用于治療惡性淋巴瘤、膠質(zhì)母細胞瘤[19]。3種核糖核苷酸還原酶抑制劑分別為吉西他濱、氯法拉濱和阿糖胞苷,吉西他濱是治療非小細胞肺癌有效的一線藥物[20],氯法拉濱和阿糖胞苷共同適用于白血病的治療[21-22]?？死鼮I為腺苷脫氨酶抑制劑,適用于治療多發(fā)性硬化癥[23],也可以用于治療白血病[24]。RNA聚合酶抑制劑放射菌素,抗瘤譜較窄,用于尤文氏肉瘤、睪丸癌和橫紋肌肉瘤等[25],Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)放線菌素可以下調(diào)肺細胞中的Mcl-1,繼而促進細胞凋亡,可能有助于新的肺癌治療策略。

總之,通過整合GEO數(shù)據(jù)庫中肺癌的DEGs,構(gòu)建了一個關(guān)鍵樞紐基因網(wǎng)絡(luò)來評估肺癌與正常組織樣本的蛋白水平表達,并發(fā)現(xiàn)與肺癌相關(guān)的SPP1樞紐基因,為以后腫瘤基因水平的靶向治療提供了新的理論依據(jù)。與此同時,我們篩選了8種具有潛在肺癌治療作用的候選藥物,為下一步的體內(nèi)外實驗奠定了良好的基礎(chǔ),也為尋找肺癌的治療方案提供了新的思路。