張瑩,代春燕,田靜,田吉來

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,江蘇 南京 210008;2.夏津縣人民醫(yī)院內(nèi)分泌腎病科,山東 德州 253200;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,江蘇 南京 210023)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種主要累及外周關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病,早期主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)晨僵疼痛,若疾病不能有效控制,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、關(guān)節(jié)毀損,甚至致殘。盡管目前RA 治療方面取得很大進展,但仍有部分患者未能達到臨床緩解。RA 的主要病變在關(guān)節(jié),表現(xiàn)為滑膜炎、滑膜增生、血管翳形成、軟骨和骨破壞?；こ衫w維細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)是關(guān)節(jié)滑膜襯里層的重要細胞成分。RA患者FLSs獲得過度增殖、遷移和侵襲表型,是滑膜炎和血管翳形成的主要原因,是介導(dǎo)炎癥和骨破壞的“罪魁禍?zhǔn)住盵1]。目前臨床上針對FLS的治療方法有限[2-3]。

FLS主動參與RA關(guān)節(jié)局部的免疫炎癥,是分泌白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的主要細胞。IL-6與其特異性受體(IL-6R)結(jié)合,進而招募糖蛋白130(gp130),三者形成有活性的IL-6/IL-6R/gp130三元六聚體復(fù)合物,激活下游通路,如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的高度磷酸化,促進細胞增殖和侵襲[4]。針對IL-6R單抗或受體融合蛋白已成為臨床治療RA的重要藥物[5]。

選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogen receptor modulator,SERM)巴多昔芬(bazedoxifene,BAZ)被再定義為IL-6/gp130抑制劑已被廣泛認可[6]:其吲哚部分和七元氮雜環(huán)擬似IL-6的Trp157和Leu57基團,可有效結(jié)合gp130的D1區(qū)域(見圖1),從而發(fā)揮拮抗IL-6的作用[7-8]。本文擬采用小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,評估BAZ對CIA小鼠的治療作用,細胞水平評估BAZ對滑膜成纖維細胞MH7A增殖、侵襲遷移的影響,探討B(tài)AZ靶向gp130是否有可能成為治療RA的新藥。

左為BAZ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式;右為吲哚部分和七元氮雜環(huán)分別模擬IL-6的Trp157和Leu57和gp130的D1區(qū)域進行有效結(jié)合

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞DBA/1小鼠(雄性,8周)購自中國上海SLAC實驗室動物有限公司[動物使用許可證號:SYXK(蘇)2014-0052],并在南京鼓樓醫(yī)院實驗動物中心的無特定病原體(specific-pathogen-free,SPF)條件下飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境室溫度24～27 ℃,濕度50%,水食自由,12 h交替光照。所有動物實驗均在南京鼓樓醫(yī)院動物研究倫理委員會批準(zhǔn)的規(guī)程下進行(批準(zhǔn)編號:2019AE01044)。

A.動物實驗的免疫和藥物干預(yù)的時間安排;B.CIA小鼠在開始免疫后不同天數(shù)下的AI評分(n=6);C.第57天小鼠后足外觀的代表圖;D.CIA小鼠在開始免疫后不同天數(shù)下的后肢足厚度(n=12)(Mean±SD,*P<0.05)

A.H-E和SO-FG染色結(jié)果,其中p為血管翳,e為軟骨侵蝕,b為骨破壞,s為滑膜炎;B.對各組小鼠進行病理評分,其中a～d依次為骨質(zhì)破壞、滑膜炎、血管翳、關(guān)節(jié)軟骨的病理學(xué)評分;C.第60天小鼠后足Micro-CT的代表圖(Mean±SD,t檢驗,*P<0.05)

A.BAZ對MH7A細胞存活的影響;B.SC144對MH7A細胞存活的影響;C.RAL和BAZ對MH7A細胞的平板克隆實驗結(jié)果

MH7A細胞接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,置于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物試劑與儀器免疫用牛Ⅱ型膠原(CII,#20022)、完全弗氏佐劑(CFA,#7001)和不完全弗氏佐劑(IFA,#7002)均購于美國Chondrex公司;BAZ購于江蘇正濟藥業(yè)股份有限公司;泊洛沙姆188(Poloxamer 188,P188)購于巴斯夫(中國)有限公司;SC144購于上海源葉生物科技有限公司;鹽酸雷洛昔芬(Raloxifene,RAL)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;基質(zhì)膠(#356234)購于美國Corning公司;Transwell小室(8 μm孔徑,Corning,USA);酶標(biāo)儀(M1000 Pro,Tecan,Switzerland);小動物活體Micro CT影像系統(tǒng)(Quantum GX,PerkinElmer,USA);倒置顯微鏡(CKX41,Olympus,Japan)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CIA小鼠模型的建立小鼠隨機分為正常對照組、膠原誘導(dǎo)組。取2 mL濃度為2 mg·mL-1的CII醋酸溶液與等體積的濃度為4 mg·mL-1的CFA置于冰上充分混合,得到CII乳化液。在膠原誘導(dǎo)組的小鼠尾根部進行皮內(nèi)緩慢注射所得的CII乳化液,注意避開血管,每只100 μL(含CII 100 μg)進行初次免疫,并設(shè)定為第0天。第21天,在小鼠尾根部1～2 cm處采用多點法再次注射100 μL/只同法新鮮配制的等體積CII醋酸溶液和IFA的混合乳化液進行增強免疫。自造模第21天開始,每3～4 d(每周2次)對免疫小鼠基于關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)評分表(見表1)進行四肢關(guān)節(jié)評分,四肢關(guān)節(jié)腫脹計分相加為關(guān)節(jié)炎的總評分。評分最高分為16,評分≥4為模型成功。

表1 小鼠AI評分

1.3.2 動物分組給藥將膠原誘導(dǎo)組的小鼠隨機分為兩組,即模型對照組(Vehicle組)和Bazedoxifene治療組(BAZ組),并在初次免疫的第14天開始給藥至第57天,每周6次,周日停藥。動物實驗的實施方案如圖2A所示。給藥劑量與方法如下:①正常組:生理鹽水,0.1 mL·(kg·d)-1灌胃;②Vehicle組:60 mg·mL-1的P188水溶液,灌胃;③BAZ組:BAZ藥物5 mg·(kg·d)-1灌胃。其中,BAZ藥物的配制方法如下:取濃度為20 μg·μL-1溶解于DMSO的BAZ溶液50 μL,加入950 μL濃度為60 mg·mL-1的P188水溶液中,渦旋混勻,即得BAZ濃度為 1 mg·mL-1的藥物溶液。

1.3.3 動物關(guān)節(jié)腫脹觀察與病理學(xué)評價增強免疫后每3～4天,使用游標(biāo)卡尺測量小鼠后肢足厚度,以此作為其關(guān)節(jié)腫脹的指標(biāo)。采用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin,H-E)觀察踝關(guān)節(jié)病理改變,番紅-固綠染色(safranine o and fast green,SO-FG)觀察軟骨破壞,并從滑膜細胞增生、細胞浸潤、關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞進行病理學(xué)評分[9]。采用micro-CT對小鼠踝關(guān)節(jié)進行掃描成像,觀察踝關(guān)節(jié)的損傷情況。

1.3.4 CCK-8法檢測BAZ對MH7A細胞存活率的影響取MH7A細胞并調(diào)整細胞密度為5×104mL-1,每孔100 μL接種于96孔板,貼壁生長過夜后,將原有培養(yǎng)基更換為含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,之后每孔加入10 μL CCK-8試劑,置于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測光密度值,并計算細胞存活抑制率。實驗獨立重復(fù)3次。

1.3.5 平板克隆法檢測BAZ對MH7A細胞增殖的影響MH7A細胞接種于6孔板中,過夜使其貼壁并使細胞融合度達到80%,第2天每孔更換為2 mL含藥培養(yǎng)基,24 h后消化各孔細胞并用無藥的完全培養(yǎng)基收集和重懸,然后以每皿500個細胞的密度接種于6 cm的平板培養(yǎng)皿中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)約15 d,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌,用冷甲醇固定0.5 h,1%結(jié)晶紫染色1 h,用水清洗后掃描所得平板培養(yǎng)皿。實驗獨立重復(fù)3次。

1.3.6 細胞劃痕法檢測BAZ對MH7A細胞遷移的影響MH7A細胞以每孔5×105細胞密度接種于6孔板中,并加入2 mL/孔的含血清培養(yǎng)基,至細胞長滿后,更換無血清培養(yǎng)基使其饑餓過夜。采用無菌槍頭進行劃痕,用PBS清洗2遍后給予含不同濃度BAZ的無血清培養(yǎng)基,使用倒置顯微鏡記錄劃痕處細胞遷移的情況。實驗獨立重復(fù)3次。

1.3.7 Transwell實驗檢測BAZ對MH7A細胞侵襲的影響MH7A細胞接種于6孔板,當(dāng)細胞融合度達60%時,加入含有不同BAZ濃度的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,之后棄去培養(yǎng)基并用PBS洗2遍,用胰酶消化細胞,并以無血清培養(yǎng)基重懸使其密度為6 000 μL-1,各組細胞取200 μL加入Transwell小室的上層(含基質(zhì)膠),下層則加入600 μL的含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。其中上層小室基質(zhì)膠需預(yù)先配制,具體方法是:基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)基按體積比1∶8在冰上進行稀釋,每孔40 μL加入小室的上層,37 ℃孵育4～6 h待基質(zhì)膠凝固。細胞在Transwell中培養(yǎng)48 h后取出小室,固定,染色,在顯微鏡下拍照,評價細胞侵襲的能力。實驗獨立重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件,所有數(shù)據(jù)以Mean±SD表示,采用t檢驗比較兩組之間的差異,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Graphpad Prism 7軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 BAZ對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥和腫脹的影響正常組小鼠無關(guān)節(jié)發(fā)紅和腫脹,Vehicle組即CIA模型組的小鼠在兩次免疫后出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、趾端發(fā)紅、足趾增厚等狀況,嚴(yán)重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動受限,在病情后期部分小鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)強直樣改變。與Vehicle組相比,BAZ治療組AI評分顯著降低(見圖2B,P<0.05),后足厚度也較Vehicle組明顯下降,并在第32天出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05,見圖2D)。各組小鼠后肢關(guān)節(jié)外觀如圖2C所示(第57天)。由于CIA模型的自限性,小鼠后肢腫脹厚度在實驗后期出現(xiàn)輕度消退(見圖2D)。

2.2 BAZ減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎如圖3A所示,正常小鼠踝關(guān)節(jié)未見炎性細胞浸潤,滑膜增厚、骨和軟骨破壞。與模型對照組相比,BAZ治療組能緩解小鼠踝關(guān)節(jié)的滑膜炎(見圖3As)、血管翳(見圖3Ap)、軟骨侵蝕(見圖3Ae)和骨破壞(見圖3Ab),其各項評分均顯著性低于CIA模型組(見圖3B)。以上表明BAZ可減輕小鼠關(guān)節(jié)病理損傷。Micro-CT的結(jié)果顯示,與CIA模型組相比,BAZ治療組后肢關(guān)節(jié)間隙狹窄和骨破壞明顯改善(見圖3C)。上述結(jié)果表明,BAZ對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎有治療作用。

2.3 BAZ對MH7A細胞存活和增殖的作用結(jié)果如圖4A所示,隨BAZ濃度的增加,MH7A的細胞存活率明顯降低。SC144是gp130的抑制劑[10],該藥對MH7A的細胞存活率具有濃度依賴性的抑制作用(見圖4B)。BAZ和SC144對MH7A細胞的IC50值分別是12.96、11.55 μmol·L-1,說明靶向gp130可以抑制滑膜細胞存活。圖3C的平板克隆實驗結(jié)果進一步證實BAZ濃度依賴性抑制MH7A細胞增殖,在BAZ 20 μmol·L-1組未見明顯的MH7A細胞增殖。RAL和BAZ均是ER調(diào)節(jié)劑,但RAL在抑制gp130方面較BAZ弱[7],RAL不能有效抑制MH7A的增殖(見圖4C)。

2.4 BAZ對MH7A細胞劃痕愈合的作用如圖5所示在MH7A細胞劃痕24 h后,與未接受藥物的細胞組相比,BAZ給藥組劃痕的愈合明顯受到抑制,其中15 μmol·L-1給藥組最為明顯,劃痕依然可見。未給藥組愈合修復(fù)接近100%融合,10 μmol·L-1組的劃痕處部分出現(xiàn)了遷移的細胞。所有各組在0時的劃痕一致(數(shù)據(jù)未列出)。以上說明了BAZ抑制細胞遷移的作用。

圖5 劃痕給藥24 h后MH7A細胞愈合圖(各組0時未列出)

2.5 BAZ對MH7A細胞侵襲的作用如圖6所示,BAZ給藥的10、20 μmol·L-1均能明顯減少細胞侵襲遷移到下室的數(shù)量。說明了BAZ對MH7A細胞侵襲和遷移的抑制作用。

圖6 MH7A細胞在接受BAZ作用24 h后接種于Transwell小室繼續(xù)培養(yǎng)48 h之后細胞侵襲檢測的各組代表

3 討論

CIA模型采用異源性CII免疫動物,誘導(dǎo)自身免疫性反應(yīng),從而產(chǎn)生類似類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)紅腫、滑膜增生、炎性細胞浸潤、血管翳形成、關(guān)節(jié)及周圍軟骨壞損。CIA模型是目前公認的RA最佳模型[11]。本研究以8周雄性CIA小鼠為研究對象,說明BAZ能有效降低AI評分,緩解小鼠后足腫脹,減輕RA病變,證實BAZ對RA的治療作用。在此基礎(chǔ)上,本研究以MH7A為模型細胞,發(fā)現(xiàn)BAZ具有抑制MH7A增殖、侵襲和遷移的作用,進而從BAZ干預(yù)FLS角度解釋了BAZ治療RA的具體機制。

BAZ最初是作為SERM聯(lián)合結(jié)合雌激素(conjugated estrogens)以組織選擇性雌激素復(fù)合物(tissue-selective estrogen complex,TSEC)的形式被美國FDA批準(zhǔn),用于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的治療。在骨組織,BAZ能作為雌激素受體(estrogen receptor,ER)-β的激動劑,具有調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換(bone turnover)的作用[12]。最近臨床報道,BAZ能有效預(yù)防絕經(jīng)后RA患者糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松[12]。在動物實驗水平,采用去卵巢(ovariectomized,OVX)的CIA(OVX-CIA)小鼠模型可模擬女性絕經(jīng)后的RA癥狀。基于此,因為雌二醇(17β-estradiol,E2)的抗炎作用,學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)BAZ聯(lián)合E2組(TSEC)發(fā)揮對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用與單用E2近似,但TSEC組更能有效降低骨髓中IL-6水平、抑制破骨前體細胞(preosteoclast)形成、減少血清中的抗膠原蛋白抗體(anti-CII IgG)[13]。以同為第三代SERM的拉索昔芬(lasofoxifene,LAS)做對照,發(fā)現(xiàn)BAZ和LAS都能降低OVX-CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的AI評分,抑制滑膜炎,減少軟骨及骨的侵蝕[14]。BAZ和LAS在OVX-CIA模型中表現(xiàn)出抗關(guān)節(jié)炎和骨保護作用的雙重作用,強調(diào)了SERM在應(yīng)用于絕經(jīng)后女性RA治療的價值。

事實上,BAZ是多靶點藥物,BAZ既充當(dāng)ER配體又是IL-6/gp130的抑制劑,干預(yù)IL-6信號通路發(fā)揮抗炎作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn),gp130抑制劑SC144和BAZ均能抑制滑膜細胞存活。有報道采用抗gp130單抗能抑制RA患者破骨細胞的分化和形成[16],說明了gp130作為RA治療靶點而充滿前景。無論小鼠是否OVX,BAZ都顯示了對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的治療作用,但BAZ對OVX-CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥的抑制能力弱于LAS和E2[13-14]。由于RA病理炎癥是由大量分子調(diào)控的,我們建議合理采用聯(lián)合用藥的策略,通過抑制多個靶點分子,更好的阻止或逆轉(zhuǎn)RA進展。