趙佳慧,葛修通,任文靜,周悅,張凡,2

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院,遼寧 大連 116600;2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心,遼寧 大連 116600)

黃柏是蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥樹皮,味苦,性寒,歸腎、膀胱經(jīng)。黃柏具有清熱燥濕、瀉火解毒、除骨蒸的功效[1],臨床多用于濕熱瀉痢、濕熱黃疸[2]。黃柏經(jīng)過鹽炙后增強滋陰降火、退虛火的作用[2]。腎陰是一身陰氣之本,是腎中物質(zhì)基礎的體現(xiàn)部分,有滋潤、濡養(yǎng)全身臟腑的作用。腎陰虛大多由于久病等因素,導致腎中陰液虧虛,虛火內(nèi)生所導致的病癥。

腸道菌群及其代謝物在維持腸道微生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮重要作用,并與多種疾病的發(fā)生密切相關。本文采用16S rRNA高通量測序方法,分析黃柏鹽炙前后對腎陰虛大鼠腸道菌群多樣性的影響,并篩選豐度具有顯著差異的菌群。并從腸道菌群角度探討黃柏鹽炙后滋腎陰效果的增強以解析黃柏鹽炙的炮制原理。

1 材料

1.1 動物成年健康雄性SD大鼠70只,體重(200±20)g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司提供,合格證號為 SCXK(遼)2020-0001。本研究的所有程序均按照遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動物倫理委員會(許可證號:2019YS[DW]-029-01)批準的方案進行。

1.2 試藥黃柏[購自四川雅安,經(jīng)鑒定為蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥樹皮];食鹽(大連鹽化集團有限公司);六味地黃丸(蘭州太寶制藥有限公司);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);氫化可的松注射液(2210191,天津金耀藥業(yè)有限公司);大鼠cAMP、cGMP酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購自上海科興有限公司(產(chǎn)品批號:22102445N、22102450N);測序儀(Illumina,美國,型號:Illumina Miseq);生物安全柜(HR1500-ⅡA2)。

2 實驗方法

2.1 黃柏及鹽黃柏制備

2.1.1 生黃柏制備取黃柏原藥材,除去雜質(zhì),噴淋清水,潤透,切絲,干燥,得生黃柏。

2.1.2 黃柏鹽炙品制備取凈黃柏絲,用鹽水拌勻(每100 kg黃柏絲,用食鹽2 kg),悶潤2 h,待鹽水被吸盡后,置炒制容器內(nèi),用文火加熱至160 ℃時炒6 min,取出晾涼,得黃柏鹽炙品。

2.2 供試品的制備分別稱取適量黃柏生品、黃柏鹽炙品飲片,加10倍量水浸泡30 min,煎煮60 min,過濾藥液,在藥渣中再加入8倍量水煎煮40 min,過濾,合并兩次濾液,濃縮至適宜濃度,黃柏生品和黃柏鹽炙品低、高劑量組給藥濃度分別為0.11、0.96 g·mL-1[1],取六味地黃丸作為陽性藥適量研磨成細粉,加入適量水溶液,溶解至濃度為0.02 g·mL-1[1]。給藥組大鼠的給藥量為1 mL/100 g。

2.3 動物分組及給藥造模將70只SD級雄性大鼠隨機分為7組,即空白對照組、模型對照組、陽性對照組、黃柏生品低劑量組、黃柏生品高劑量組、黃柏鹽炙品低劑量組、黃柏鹽炙品高劑量組,每組10只大鼠。

每天灌胃給藥1次,空白對照組、模型對照組給予相同劑量的生理鹽水,各組連續(xù)給藥10 d。灌胃給藥的第11 天開始,除空白對照組外,其他組灌胃氫化可的松造模,氫化可的松濃度為50 mg·L-1,模型組大鼠的給藥量為1 mL/100 g,空白對照組給予相同劑量的生理鹽水,連續(xù)灌胃4 d。

2.4 大鼠體重測定給藥期間(前10 d)每3 d稱量1次大鼠體重,造模期間(11～14 d)每天稱量1次大鼠體重,并做好記錄。

2.5 大鼠糞便樣品的采集最后1次造模給藥12 h后,采用提尾刺激法刺激大鼠排出糞便,將糞便放入無菌的EP管中,立即放入液氮中迅速凍存,保存在-80 ℃冰箱中。用于腸道菌群多樣性的分析。

2.6 大鼠胸腺形態(tài)大鼠麻醉后迅速取出胸腺組織,用預冷的生理鹽水清洗2遍,濾紙吸干水分。

2.7 大鼠腎臟指數(shù)大鼠麻醉后迅速取出腎臟組織,用預冷的生理鹽水清洗2遍,濾紙吸干水分,使用萬分之一天平稱量各自重量,根據(jù)下面公式計算腎臟臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器重量(g)/體重(g)

2.8 16S rRNA高通量測序技術檢測大鼠腸道菌群

2.8.1 DNA提取和PCR擴增根據(jù)DNA提取試劑盒提取糞便中的總DNA,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量,使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度。對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。

2.8.2 Illumina Miseq測序?qū)⑼粯颖镜腜CR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行回收產(chǎn)物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用QuantusTMFluorometer對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫,首先進行鏈接接頭;再使用磁珠進行篩選;利用PCR擴增的方法進行文庫模板的富集;最后使用磁珠回收PCR產(chǎn)物得到文庫。利用Illumina公司的61 Miseq PE300平臺進行測序。

2.8.3 數(shù)據(jù)處理使用Fastp軟件對原始測序序列進行質(zhì)控,使用FLASH軟件進行拼接:過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基;根據(jù)PE reads之間的overlap關系,將成對reads拼接(merge)成一條序列,并篩選不符合序列,調(diào)整序列方向。使用UPARSE軟件,根據(jù)相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋,比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫。

3 實驗結果

3.1 腎陰虛模型大鼠建立結果與空白組相比,模型組cAMP含量明顯增加(P<0.01);與模型組相比,各給藥組cAMP含量明顯降低,鹽黃柏高劑量組cAMP含量最低,其次陽性組(P<0.01)。與空白組相比,模型組cGMP含量明顯降低(P<0.01);與模型組相比,各給藥組cGMP含量均增加,其中生黃柏高劑量組含量顯著性升高(P<0.01)。與空白組相比,模型組cAMP/cGMP比值明顯升高(P<0.05);與模型組相比,各給藥組cAMP/cGMP比值均降低,鹽黃柏高、低劑量組cAMP/cGMP比值明顯降低(P<0.01),結果見圖1。

圖1 各組大鼠血清中cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值圖

3.2 大鼠體重變化結果空白組大鼠14 d內(nèi)體重平穩(wěn)增長,其余各組前10 d體重平穩(wěn)增長,造模給予氫化可的松的第1天(即第11 天)開始體重明顯降低,模型組大鼠體重降低趨勢最為顯著,鹽黃柏高劑量組大鼠體重降低趨勢最小,結果見圖2。

圖2 各組大鼠體重變化趨勢圖

3.3 大鼠胸腺形態(tài)結果空白組大鼠胸腺形態(tài)完整,組織肥厚,顏色偏淡;模型組大鼠胸腺萎縮不成形,布滿紅點,顏色偏紅;其余各給藥組大鼠胸腺形態(tài)均有明顯改變,其中鹽黃柏高劑量組大鼠胸腺形態(tài)優(yōu)于其他給藥組大鼠胸腺形態(tài)。

3.4 腎臟指數(shù)結果與空白組相比,模型組大鼠腎臟指數(shù)顯著性增加(P<0.01);與模型組相比,各給藥組腎臟指數(shù)均降低,陽性組大鼠腎臟指數(shù)顯著性降低(P<0.01),鹽黃柏高劑量組大鼠腎臟指數(shù)明顯降低(P<0.05),生黃柏高、低劑量組大鼠腎臟指數(shù)也有所降低但無統(tǒng)計學差異,結果見圖3。

圖3 各組大鼠腎臟臟器指數(shù)圖

3.5 腸道菌群多樣性結果

3.5.1 組間物種OTU分析通過分析樣本物種組成,并繪制稀釋曲線圖,發(fā)現(xiàn)樣本16000Reads左右時曲線逐漸趨于平坦,說明測序數(shù)據(jù)量合理,樣本量增加只會產(chǎn)生少量的新物種;基于樣本不同測序深度并選取Shannon-Wiener圖作為多樣性指數(shù)的OTU數(shù),繪制曲線,可知樣本在4000Reads左右時曲線逐漸趨于平坦,說明測序數(shù)據(jù)量足夠大,能夠反映樣本中絕大多數(shù)微生物多樣性信息(見圖4)。

圖4 樣本物種組成分析圖

OTU聚類分析為物種組成分析的一部分,以便進一步分析腸道菌群的組成。根據(jù)Veen圖(見圖5)能夠直觀地看出5組樣本中物種的重疊情況及其相似性,并統(tǒng)計出其共有及特有的OTU數(shù)目?；诟鹘M腸道菌群樣本,空白組特有OTU 40個,模型組特有OTU 18個,陽性組特有OTU 10個,鹽黃柏高劑量組特有OTU 9個,生黃柏高劑量組特有OTU 16個;五組共有OTU 317個。

圖5 OTU在不同處理組分布的Veen圖

3.5.2 組間物種Beat多樣性分析主坐標分析(PCoA)見圖6,結果發(fā)現(xiàn)PC1和PC2對總體方差解釋的百分比分別為19.74%和15.31%?？瞻捉M與腎陰虛模型組大鼠菌群完全分開,與空白組比較,腎陰虛模型組大鼠菌群結構具有明顯差異;各給藥組樣本距離空白組更近,鹽炙品高劑量組距離空白組更近,幾乎重疊,其次是陽性藥組和生黃柏高劑量組,二者幾乎重疊。黃柏及其鹽炙品能夠明顯改善腎陰虛大鼠腸道菌群的結構,鹽黃柏效果明顯優(yōu)于生黃柏。

圖6 各組大鼠腸道菌群的PCoA得分分布

3.5.3 腸道菌群結構的門、科水平分析門水平下,不同組別大鼠腸道菌群的組成情況見圖7,厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度最高,擬桿菌門(Bacteroidota)和放線菌門(Actinobacteriota)相對豐度次之。與空白組相比,腎陰虛模型組Firmicutes相對豐度明顯減少(P<0.05),Bacteroidota、Actinobacteriota相對豐度增加(P<0.05)。與模型組相比,各給藥組Firmicutes均明顯升高(P<0.05),鹽黃柏組相對豐度均高于生黃柏組,同種飲片下低劑量組效果優(yōu)于高劑量組;各給藥組中Bacteroidota明顯降低(P<0.05),鹽黃柏組中Bacteroidota低于生黃柏組,鹽黃柏低劑量組Bacteroidota相對豐度最低;各給藥組中Actinobacteriota明顯降低(P<0.05),鹽黃柏高劑量組Actinobacteriota相對豐度最低。

BC為空白組;MC為模型組;PC為陽性對照組;LD-RP為黃柏生品低劑量組;HD-RP為黃柏生品高劑量組;LD-SP為黃柏鹽炙品低劑量組;HD-SP為黃柏鹽炙品高劑量組

科水平下,不同組別大鼠腸道菌群的組成情況見圖8,乳酸菌科(Lactobacillaceae)相對豐度最高,其次是S24-7科(Muribaculaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)。與空白組相比,模型組Lactobacillaceae、Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae相對豐度明顯降低(P<0.05),Muribaculaceae相對豐度明顯增加(P<0.05)。與模型組相比,各給藥組Lactobacillaceae相對豐度明顯增加(P<0.05),生黃柏低劑量組豐度增加最為明顯;各給藥組Lachnospiraceae明顯增加(P<0.05),鹽黃柏低劑量組Lachnospiraceae增加最為明顯;各給藥組Enterococcaceae顯著增加(P<0.01),鹽黃柏高劑量組Enterococcaceae相對豐度遠遠高于其他給藥組。

BC為空白組;MC為模型組;PC為陽性對照組;LD-RP為黃柏生品低劑量組;HD-RP為黃柏生品高劑量組;LD-SP為黃柏鹽炙品低劑量組;HD-SP為黃柏鹽炙品高劑量組

3.5.4 差異菌群篩選應用LEfSe軟件根據(jù)分類學原理,對不同組別進行線性判別分析,并找出對樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種。分析在門、綱、目、科、屬分類水平上具有顯著性差異的菌群,如圖9。LDA判別柱形圖(見圖10)統(tǒng)計多組中有顯著差異的微生物類群,通過LDA分析(線性回歸分析)獲得的LDA分值,該分值越大,代表物種豐度對差異效果影響越大,并以此進行分析,將各組別的優(yōu)勢菌群按照LDA分值由大到小的順序進行排列,得到以下結果。

BC為空白組;MC為模型組;PC為陽性對照組;LD-RP為黃柏生品低劑量組;HD-RP為黃柏生品高劑量組;LD-SP為黃柏鹽炙品低劑量組;HD-SP為黃柏鹽炙品高劑量組

BC為空白組;MC為模型組;PC為陽性對照組;LD-RP為黃柏生品低劑量組;HD-RP為黃柏生品高劑量組;LD-SP為黃柏鹽炙品低劑量組;HD-SP為黃柏鹽炙品高劑量組

與空白組相比,腎陰虛模型組大鼠糞便中桿菌綱(c_Bacilli)、梭菌目(o_Clostridiales)、梭菌科(f_Clostridiaceae)、梭菌屬(g_Clostridium_sensu_stricto_1)、異桿菌屬(g_Allobaculum)等顯著高于空白組。與模型組相比,生黃柏組中消化鏈球菌目(o_Peptostreptococcales-Tissierellales)、顫螺菌目(o_Oscillospirales)、瘤胃球菌科(f_Ruminococcaceae)、消化鏈球菌科(f_Peptostreptococcaceae)、羅斯氏菌屬(g_Romboutsia)為優(yōu)勢菌群。與模型組相比,鹽黃柏組中厚壁菌門(p_Firmicutes)、乳酸桿菌目(o_Lactobacillales)、腸球菌科(f_Enterococcaceae)、腸球菌屬(g_Enterococcus)為優(yōu)勢菌群。模型組中的優(yōu)勢菌群在生黃柏組和鹽黃柏組豐度明顯降低。

4 討論

本研究采用糖皮質(zhì)激素類藥物(氫化可的松)建立腎上腺皮質(zhì)功能亢進型腎陰虛大鼠模型,空白組大鼠體重平穩(wěn)增長,毛發(fā)柔順,精神狀態(tài)良好;腎陰虛大鼠外觀表征發(fā)生改變,體重明顯降低,毛發(fā)失華,扎堆拱背,精神萎靡;各給藥組大鼠腎陰虛癥狀明顯得到改善。胸腺是人體重要的免疫器官,大劑量氫化可的松損傷機體器官,抑制機體的免疫功能,模型組胸腺形態(tài)的明顯改變提示其對機體免疫系統(tǒng)損傷尤為迅速,各給藥組大鼠胸腺形態(tài)有所改善。腎陰虛模型大鼠腎臟指數(shù)明顯升高,給藥組大鼠腎臟指數(shù)均降低,鹽黃柏組作用效果優(yōu)于生黃柏組。

腸道菌群包括一系列復雜的微生物,并占有一定的比例,能夠維持腸道內(nèi)微生物的生態(tài)平衡,其組成變化對人體健康有一定的影響,研究證明腸道菌群與多種疾病均有密切聯(lián)系。PCoA圖(見圖8)可以看出腎陰虛大鼠腸道菌群組成與正常大鼠明顯不同。

腎陰虛由腎中陰液虧虛導致,在臨床上其主要病癥表現(xiàn)為糖尿病。中醫(yī)認為糖尿病屬于消渴病,由陰虛燥熱引起,黃柏具有明顯的降糖作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者Firmicutes的比例明顯下降,Actinobacteriota的比例明顯上升[4]。結合在門、綱、目、科、屬分類水平上的差異菌群篩選的結果,與健康大鼠相比,黃柏及其鹽炙品在門水平上能夠上調(diào)Firmicutes比例,下調(diào)Actinobacteriota的比例,鹽炙品效果更佳。Firmicutes豐度降低是腸道內(nèi)微生物失調(diào)的重要特征之一[5],大多有益菌屬于Firmicutes,其中o_Lactobacillales能夠維持腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定[6]。在科水平上,與模型組相比,鹽黃柏組中Lactobacillaceae、Lachnospiraceae、Enterococcaceae相對豐度均有明顯差異。Lactobacillaceae是腸道內(nèi)的有益菌群,能夠維持腸道內(nèi)微生物環(huán)境穩(wěn)態(tài)[7],鹽黃柏通過增加Lactobacillaceae相對豐度,改善腸道菌群微生態(tài)環(huán)境。Lachnospiraceae能發(fā)酵代謝葡萄糖,產(chǎn)生甲酸、乙酸和丙酸等短鏈脂肪酸,并加快毒素的排泄[8];還能代謝色氨酸,其代謝產(chǎn)物能夠保護腸道上皮屏障[9],鹽黃柏組Lachnospiraceae相對豐度明顯增加,黃柏鹽炙品有緩解腸道炎癥,保護腸道的潛力。Enterococcaceae的聚集物質(zhì)能夠促進損傷上皮細胞和內(nèi)皮細胞的黏附,并促進腸內(nèi)轉(zhuǎn)運和糖化蛋白,體外實驗中能夠增強腎小管上皮細胞的黏附[10];Enterococcaceae和g_Enterococcus為鹽黃柏組的優(yōu)勢菌群,可能與其聚集物質(zhì)增強腎小管上皮細胞的黏附有關。

近年來,腸道菌群已被證實與多種疾病的發(fā)生都有密切聯(lián)系,實驗結果表明,腎陰虛模型大鼠腸道菌群與正常大鼠腸道菌群相比,在不同水平下物種組成及相對豐度都具有明顯差異,大劑量氫化可的松改變腸道微生態(tài),增加有害菌群定殖,減少有益菌群增殖,黃柏鹽炙前后均能調(diào)節(jié)腎陰虛大鼠腸道內(nèi)菌群的相對豐度,進而改善腸道微生態(tài)環(huán)境,且黃柏鹽炙后調(diào)節(jié)腎陰虛大鼠腸道菌群的效果更好。