畢瑩瑩 楊雙 張舒紅 唐艷紅

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430060)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)會(huì)誘發(fā)各種室性心律失常如室性心動(dòng)過速和心室顫動(dòng),這是導(dǎo)致MI高死亡率的重要原因[1]。研究[2-3]表明交感神經(jīng)過度激活在MI后室性心律失常發(fā)生中起重要作用。因此抑制MI后交感神經(jīng)過度激活能有效減少室性心律失常的發(fā)生。

嘌呤能配體門控離子通道3受體(purinergic ligand-gated ion channel 3 receptor,P2X3R)是嘌呤能受體家族中的一員[4],主要位于Aδ和C類神經(jīng)纖維上,與配體ATP結(jié)合后,引起大量陽離子內(nèi)流,改變神經(jīng)細(xì)胞興奮性。P2X3R激活與交感神經(jīng)活動(dòng)密切相關(guān)。之前的研究[5-6]表明,P2X3R拮抗劑可降低動(dòng)脈血壓、心率和腎交感神經(jīng)活動(dòng)。Xue等[7]發(fā)現(xiàn)下調(diào)頸動(dòng)脈體P2X3R可通過調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活動(dòng)降低高血壓模型犬的血壓。此外,心肌缺血時(shí),頸上神經(jīng)節(jié)P2X3R的上調(diào)與交感神經(jīng)興奮性反射的激活有關(guān)[5]。但P2X3R是否通過影響交感神經(jīng)活動(dòng)在MI后室性心律失常的發(fā)生中發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。因此,本研究旨在探究P2X3R拮抗劑A317491在MI后室性心律失常發(fā)生中的作用及可能的機(jī)制。

1 方法與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

本研究選用40只成年雄性SD大鼠(體重180～220 g),均在保證充足飼料、水和室溫( 24 ℃±2 ℃)的條件下飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將SD大鼠隨機(jī)分成3組:(1)假手術(shù)(Sham)組(n=12);(2)MI組(n=14);(3)MI+A317491(MI+A)組(n=14)。通過結(jié)扎左前降支構(gòu)建MI模型,心電圖ST段抬高和病理性Q波出現(xiàn)表示建模成功。MI+A組腹腔注射A317491[0.5 mg/(kg·d)],Sham組和MI組大鼠分別腹腔注射等量的生理鹽水,共7 d。

1.2 血壓測(cè)量和心臟超聲

MI后第7天,采用無創(chuàng)動(dòng)物血壓測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量尾動(dòng)脈血壓。每只大鼠平均測(cè)量3次收縮壓(systolic blood pressure,SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure,DBP),均由同一操作人員在同一環(huán)境下進(jìn)行測(cè)量。血壓測(cè)量結(jié)束后腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠,使用經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖于仰臥位測(cè)量各組大鼠與心臟功能和結(jié)構(gòu)相關(guān)的指標(biāo),如左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)等。

1.3 心電圖和心率變異性

MI后第7天,采用PowerLab系統(tǒng)記錄麻醉狀態(tài)下大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖,記錄時(shí)長(zhǎng)為10 min,并用LabChart 8.0軟件進(jìn)行分析。選取250～300個(gè)周期計(jì)算心率變異性(heart rate variability,HRV)[8-9],HRV參數(shù)包括全部RR間期的標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation of normal RR intervals,SDNN)和相鄰RR間期之差的均方根值(the square root of the mean squared differences of successive RR intervals,RMSSD)。此外,還分析了可以反映自主神經(jīng)活動(dòng)的平均心率(heart rate,HR)和所有RR間期的平均值(the mean value of all normal RR intervals,mean RR)。

1.4 程序化電生理刺激

MI后第7天,于麻醉狀態(tài)下打開胸腔,進(jìn)行程序化電生理刺激。動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration,APD):采用S1S1刺激程序記錄APD,在起搏周長(zhǎng)(paced cycle length,PCL)為100 ms情況下連續(xù)刺激10次。然后使用Labchart 8.0計(jì)算90%的APD復(fù)極化時(shí)間(APD90)。有效不應(yīng)期(effective refractory period,ERP):采用S1S2刺激程序記錄ERP,在PCL=100 ms的情況下連續(xù)進(jìn)行8次S1刺激,然后提前給予S2刺激。S1S2間期從100 ms開始,以10 ms幅度依次遞減,當(dāng)S2不能下傳奪獲心室時(shí),從上一個(gè)間期以2 ms幅度遞減至S2不能下傳奪獲心室時(shí),S1S2間期即為心室ERP。室性心律失常誘發(fā)率:用頻率50 Hz、持續(xù)時(shí)間2 s、重復(fù)10次的Burst電刺激脈沖誘發(fā)室性心律失常,室性心律失常定義為連續(xù)2 s及以上的不規(guī)則電活動(dòng),室性心律失常誘發(fā)率=各組誘發(fā)室性心律失常大鼠數(shù)/各組大鼠總數(shù)。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

通過下腔靜脈采血,靜置1 h后以3 500 r/min的速度離心后吸取血清置于-80 ℃冰箱保存,同時(shí)收集左心室心臟組織。使用大鼠去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)試劑盒(ELK biotechnology,ELK8956)檢測(cè)血清和梗死周邊組織NE濃度,檢測(cè)步驟依據(jù)生產(chǎn)廠家說明書進(jìn)行,NE檢測(cè)濃度范圍為78.13～5 000 pg/mL。

1.6 天狼星紅染色和免疫熒光染色

收集的心臟組織用4%多聚甲醛固定24 h,將固定的心臟組織用石蠟包埋,切片厚度為3 μm。天狼星紅染色:病理切片進(jìn)行天狼星紅染色,使用光學(xué)顯微鏡采集圖像后用Image J軟件進(jìn)行分析。免疫熒光染色:心臟病理切片分別用P2X3R抗體(1：150,Immunoway), 酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗體(1：300,Servicebio)和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)抗體(1：200,Novus)在4 ℃冰箱孵育過夜,用熒光素耦聯(lián)的二抗(CoraLite488/CY3)在室溫下避光孵育40 min,經(jīng)PBS清洗3次后使用DAPI(1：1,Sigma)孵育,然后進(jìn)行干燥和封片。用熒光顯微鏡拍攝圖像,并用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法

蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)提取心臟總蛋白,BCA試劑盒進(jìn)行定量。定量蛋白通過SDS-PAGE凝膠分離并電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h,洗膜,4 ℃下將膜分別置于P2X3R(1：1 000,Servicebio)、TH(1：1 000,Servicebio)、GAP-43(1：500,Servicebio)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(1：10 000,Abcam)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)(1：10 000,Abcam)、纖維連接蛋白(1：500,Abcam)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(1：10 000,Abcam)一抗工作液孵育過夜。洗膜后,室溫下將膜與對(duì)應(yīng)二抗(1：2 000)孵育1 h,洗膜,滴加ECL試劑顯影,通過Image J軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8.01軟件分析和處理數(shù)據(jù)。連續(xù)變量以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析(ANOVA)。各組室性心律失常誘發(fā)率以百分比表示,并使用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A317491對(duì)MI后心功能、血壓和P2X3R表達(dá)的影響

如表1所示,MI導(dǎo)致LVEF和LVFS降低,LVEDD和LVESD增加,A317491可以改善MI大鼠的上述變化(P<0.05)。間接血壓測(cè)量結(jié)果顯示3組血壓間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。MI組P2X3R的表達(dá)較Sham組明顯上調(diào)。而與MI組相比,MI+A組P2X3R表達(dá)減少 (P<0.05)(圖1A～D)。

表1 3組大鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)和血壓比較

注:A圖為MI 7 d后梗死周邊區(qū)P2X3R的免疫熒光染色,B圖為Western blot數(shù)據(jù)顯示梗死周邊區(qū)P2X3R蛋白的表達(dá),C和D圖為P2X3R的免疫熒光定量分析和蛋白表達(dá)比。所有數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每組n=6,??表示P<0.01,?表示P<0.05。

2.2 A317491對(duì)MI后HRV和NE含量的影響

與Sham組相比,MI組大鼠HR顯著升高,其他HRV變量,包括mean RR、SDNN和RMSSD均顯著降低。經(jīng)A317491處理后,上述指標(biāo)均有所改善(P<0.05)(圖2 A～D)。此外,MI組大鼠血清和梗死周邊區(qū)NE濃度明顯高于Sham組大鼠,但與MI組相比,MI+A組明顯降低(P<0.01)(圖2 E～F)。

注:A～D圖為HR、mean RR、SDNN、RMSSD的HRV參數(shù),每組n=12;E和F圖為梗死周邊區(qū)及血清NE濃度,每組n=6。所有數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,??表示P<0.01,?表示P<0.05。

2.3 A317491改善梗死周邊區(qū)交感神經(jīng)重構(gòu)

與Sham組相比,MI組大鼠TH陽性神經(jīng)纖維顯著增加,而MI+A組大鼠TH陽性神經(jīng)纖維減少。與TH結(jié)果相似,MI+A組大鼠GAP-43陽性神經(jīng)纖維密度較MI組大鼠明顯減小(P<0.05)(圖3A、C、D)。與Sham組相比,MI組梗死周邊區(qū)TH和GAP-43蛋白表達(dá)明顯增加。使用A317491后,TH和GAP-43蛋白表達(dá)減少(P<0.05) (圖3B、E、F)。

2.4 A317491減輕梗死周邊區(qū)結(jié)構(gòu)重構(gòu)

天狼星紅染色顯示MI組大鼠梗死周邊區(qū)出現(xiàn)大量膠原纖維,而MI+A組梗死周邊區(qū)膠原纖維明顯減少(圖4 A)。Western blot條帶顯示,相較于Sham組,MI組大鼠α-SMA、纖維連接蛋白、TGF-β1表達(dá)升高,A317491處理使MI大鼠相應(yīng)指標(biāo)表達(dá)減少(P<0.01)(圖4 B～E)。

2.5 A317491對(duì)梗死周邊區(qū)心室電重構(gòu)的影響

圖5A和圖5D為APD和Burst的典型刺激方案。圖5B和圖5C顯示與Sham組大鼠相比,MI組大鼠APD90和ERP顯著降低,而A317491給藥后APD90和ERP顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。Sham組室性心律失常誘發(fā)率為8.3%(1/12),MI組為75%(9/12),MI+A組為33%(4/12)(Sham組 vs MI組,P<0.01;MI 組vs MI+A組,P<0.05;圖5E),且MI組室性心律失常持續(xù)時(shí)間較Sham組長(zhǎng),使用A317491后,室性心律失常持續(xù)時(shí)間明顯縮短(P<0.05) (圖5F)。

注:A圖為PCL=100 ms時(shí)APD的代表性記錄;B圖為PCL=100 ms時(shí)的APD90,每組n=12;C圖為ERP,每組n=12;D圖為Burst誘發(fā)的代表性心室顫動(dòng)發(fā)作;E圖為室性心律失常誘發(fā)率,每組n=12;F圖為室性心律失常持續(xù)時(shí)間。n≥3的數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,??表示P< 0.01,?表示P<0.05。

3 討論和結(jié)論

MI可導(dǎo)致心力衰竭和心律失常等一系列并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅人類的健康。惡性室性心律失常是MI患者恢復(fù)期致死的主要原因之一。

MI會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死、心室重塑以及電重構(gòu),在正常心肌和梗死周邊區(qū)極易形成折返環(huán),因此MI患者易發(fā)生室性心律失常[10-11]。交感神經(jīng)過度激活和重構(gòu)可導(dǎo)致心臟電傳導(dǎo)紊亂,增加心電不穩(wěn)定性,誘導(dǎo)MI后心律失常[12]。抑制交感神經(jīng)可有效緩解MI誘發(fā)的心律失常[13]。心肌纖維化可改變電生理和心肌結(jié)構(gòu),包括離子通道異常(如鉀離子通道和鈣離子通道)、傳導(dǎo)異質(zhì)性和心室擴(kuò)張[14-16]。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)心臟去交感神經(jīng)可以通過減少TGF-β受體信號(hào)通路的激活,改善MI大鼠左心室非梗死區(qū)域的心肌纖維化。本文主要研究P2X3R抑制劑A317491對(duì)MI后交感神經(jīng)重構(gòu)、心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)以及室性心律失常的影響。

在本研究中, MI組大鼠梗死周邊區(qū)P2X3R的表達(dá)上調(diào),而MI+A組大鼠P2X3R表達(dá)下調(diào)。這與前人在高血壓、糖尿病和心肌缺血損傷模型大鼠中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)或傳入神經(jīng)上P2X3R表達(dá)增加的研究一致[6,18-20]。此外,Wang等[21]發(fā)現(xiàn)心肌缺血損傷模型大鼠心臟P2X3R表達(dá)上調(diào),A317491可降低P2X3R表達(dá)。本研究中,經(jīng)超聲檢查各組心臟功能相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn),MI組LVEF、LVFS、 LVEDD和LVESD指標(biāo)均較Sham組明顯惡化,說明MI大鼠的心臟功能受損,而MI+A組LVEF、LVFS、LVEDD和LVESD指標(biāo)均較MI組有明顯改善,提示A317491可明顯改善MI大鼠的心臟功能。與此同時(shí),A317491能顯著降低MI大鼠梗死周邊區(qū)纖維化水平,改善HRV,降低血清和梗死周邊區(qū)NE濃度。新近研究[22]表明,P2X3R抑制劑AF-130可減少M(fèi)I后心力衰竭大鼠外周化學(xué)感受器放電,恢復(fù)自主神經(jīng)平衡,改善HRV,保護(hù)心臟功能,這與本文的研究結(jié)果一致。TH和GAP-43是心臟交感神經(jīng)過度激活和重構(gòu)的標(biāo)志物[23],通過檢測(cè)TH和GAP-43評(píng)估交感神經(jīng)重構(gòu)情況,發(fā)現(xiàn)MI大鼠TH和GAP-43陽性神經(jīng)纖維密度和蛋白表達(dá)水平明顯升高,而使用A317491處理組大鼠的相關(guān)蛋白則減少,提示A317491可以減輕MI大鼠心臟交感神經(jīng)過度激活和交感神經(jīng)重構(gòu)。MI后心肌電生理特性發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為缺血區(qū)心肌ERP和APD縮短,室性心律失常易感性增加[24]。本文通過程序性電刺激證實(shí)A317491可延長(zhǎng)APD和ERP,降低室性心律失常誘發(fā)率,說明A317491具有室性心律失常保護(hù)作用。

綜上所述,A317491可能通過抑制P2X3R改善MI后的交感神經(jīng)重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu),進(jìn)而降低MI后室性心律失常的易感性。