丁華杰 楊紹石 李莎 史華寧 龔雪 那磊

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是目前較多見的惡性腫瘤之一,且在中國乃至全球發(fā)病率有逐年上升的趨勢[1,2],雖預(yù)后較好,但早期容易發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴轉(zhuǎn)移或術(shù)后復(fù)發(fā),約1/4的PTC腫瘤患者在術(shù)后隨訪中復(fù)發(fā)[3,4]。BRAFV600E目前被認(rèn)為是甲狀腺乳頭狀癌特異性較高的腫瘤標(biāo)志物,研究表明其在甲狀腺乳頭狀癌中突變率約40%～70%,其特異性較高,但靈敏度較低[5,6],因此迫切需要尋找新的腫瘤標(biāo)志物。近幾年隨著分子生物基因診斷技術(shù)不斷提高,進(jìn)一步研究與探討PTC組織中特異性的腫瘤標(biāo)志物,應(yīng)用于PTC的診斷治療及手術(shù)方式的選擇具有重要意義。Circular RNA大約發(fā)現(xiàn)于40年前[7],但近幾年才被廣泛關(guān)注。circRNAs作為一種ncRNA,最初被當(dāng)做pre-mRNA剪接出現(xiàn)錯(cuò)誤的副產(chǎn)物[8]。與其他種類ncRNA對比,其可形成共價(jià)及閉合的連續(xù)環(huán),既無5′至3′極性,也無polyA尾巴,另外還對核酸酶消化不靈敏,所以circRNAs更保守、穩(wěn)定[9,10]。伴隨新測序技術(shù)迅猛發(fā)展,在哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組和多種癌中發(fā)現(xiàn)大量circRNAs的存在。如Li等[11]利用PTC組織對circRNA進(jìn)行微陣列分析,結(jié)果顯示:與良性甲狀腺組織比較,PTC中約有383種circRNAs的表達(dá)存在差異[12],以往與PTC相關(guān)的circRNAs研究可能為PTC的診斷和治療提供了新的思路的研究方向。而circ_0015278,是一種新發(fā)現(xiàn)的RNA,可抑制多種癌的進(jìn)程,如非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌[13,14]。之前的一項(xiàng)研究中是使用微陣列分析,所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)與甲狀腺良性腫瘤對比,PTC組織中的circ_0015278表達(dá)量顯著降低[15]。綜合以上研究信息,本研究探討circ_0015278是否有作為PTC腫瘤標(biāo)志物的潛能,當(dāng)前國內(nèi)未查詢到有相關(guān)的研究及探索。本研究回顧性分析已經(jīng)接受手術(shù)切除的甲狀腺PTC腫瘤患者200例,旨在探討circ_0015278與PTC腫瘤及其臨床特征的相關(guān)性。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016年1月至2021年1月在我院已行甲狀腺手術(shù)切除的PTC患者200例,全部患者病理結(jié)果為PTC,符合以下入選條件:(1)手術(shù)后切除腫瘤及其旁組織保存完整良好,用于RNA的分離,臨床及病理資料完全;(2)術(shù)前已行PTC手術(shù)或伴有其他癌癥史患者排除在外。

1.2 數(shù)據(jù)收集與樣本采集 回顧性分析PTC腫瘤患者的臨床資料,從PACS中獲取患者性別、年齡、腫瘤大小、有無甲狀腺外侵、pTNM分期及是否術(shù)后接受輔助放射性碘治療等資料研究分析。從病理庫中提取各個(gè)對應(yīng)患者腫瘤及其旁組織,全部組織經(jīng)過冷藏,用于circular RNA測定。

1.3 方法 采用逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)來檢驗(yàn)PTC及其旁組織circ_0015278。RNA的分離、逆轉(zhuǎn)錄及qPCR程序如前述研究程序進(jìn)行[15]。每個(gè)樣本qPCR檢測循環(huán)3次。條件:95℃,2 min(1個(gè)循環(huán));95℃,5 s,60℃,10 s(40個(gè)循環(huán))。RT-qPCR中采用下面試劑盒:TRIzol試劑(Thermo,Fisher Scientific,USA);RNase R iScriptTMcDNA合成試劑盒(隨機(jī)引物)(Bio-Rad,USA); QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(QiaGen,Germany)。GAPDH作內(nèi)控基因?qū)嵤┓蛛x。采用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0015278的表達(dá),引物:circ_0015278正向引物(5’->3’):TGGCTGTGGCTGTGTTAGG,反向引物(5’->3’):TTCATTGGTCTGTGGATCATATCG。GAPDH正向引物(5’->3’):GACCACAGTCCATGCCATCAC,反向引物(5’->3’):ACGCCTGCTTCACCACCTT。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件及圖形板棱鏡7.02,PTC腫瘤及其旁組織中的circ_0015278表達(dá)為非正態(tài)分布,用中位數(shù)四分位數(shù)M(Q1,Q3)表示,使用非參數(shù)檢驗(yàn),用Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)對PTC與其旁組織circ0015278統(tǒng)計(jì)分析;利用受試者操作特征曲線(ROC)分析circ_0015278在PTC及 旁組織中的鑒別價(jià)值;采用Mann-whitney U檢驗(yàn)分析PTC組織中circ_0015278表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床特征 入選的PTC腫瘤患者:其中女性153例(76.5%),男性47例(23.5%),平均年齡(43.8±11.3)歲。腫瘤平均大小(3.50±1.55)cm。無甲狀腺外侵120例(60.0%),有甲狀腺外侵80例(40.0%)。pN0 69例(34.5%),pN1 131例(65.5%)。pTNM Ⅰ+Ⅱ期123例(61.5%),pTNM Ⅲ+Ⅳ期77例(38.5%)。輔助放射性碘治療55例(27.5%),沒有接受者145例(72.5%)。見表1。

表1 PTC患者的臨床特征 n=200

2.2 PTC腫瘤與其旁組織circ_0015278表達(dá)的比較 PTC腫瘤組織中circ_0015278表達(dá)[中值:0.345(0.226,0.573)]與其旁組織表達(dá)[中值:1.004(0.765,1.362)]對比顯著降低(Z=-12.122,P<0.001),兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ROC顯示,以相對表達(dá)量0.743為截?cái)嘀禃r(shí),circ_0015278在鑒別PTC腫瘤及旁組織方面具有較高的價(jià)值(AUC:0.903,95%CI:0.873～0.933)。見圖1。

圖1 PTC腫瘤與鄰近組織Circ_0015278表達(dá)的ROC曲線

2.3 Circ_0015278與PTC臨床特征的相關(guān)性 PTC腫瘤中Circ_0015278的高水平表達(dá)與患者年齡<45歲(Z=-2.319,P=0.020)、無甲狀腺外侵犯(Z=-2.042,P=0.041)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Z=-2.494,P=0.013)及低pTNM分期(Z=-3.719,P=0.001)具有相關(guān)性(P<0.05)。而未發(fā)現(xiàn)與性別(Z=-1.323,P=0.186)、腫瘤大小(Z=-1.273,P=0.203)具有相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 Circ_0015278表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性 M(Q,Q3)

3 討論

Circ_0015278是種目前新發(fā)現(xiàn)的RNA,可以阻止多種惡性腫瘤的進(jìn)程及發(fā)展[13,14]。如在非小細(xì)胞肺癌中,circ_0015278的高表達(dá)是通過microRNA-1228[13]來降低細(xì)胞的增殖;如在卵巢癌中,circ_0015278是通過miR-1228/p53/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)信號[14]來阻止細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。與甲狀腺良性腫瘤對比PTC腫瘤中的circ_0015278有降低[15],但是這一研究結(jié)果仍待更多樣本去驗(yàn)證。

因此,本研究對PTC腫瘤患者200例的相關(guān)資料進(jìn)行回顧研究,所得結(jié)果證實(shí)了PTC腫瘤中的circ_0015278表達(dá)水平與癌旁組織對比明顯降低,ROC結(jié)果顯示,以相對表達(dá)量0.743為截?cái)嘀禃r(shí),circ_0015278在鑒別PTC腫瘤及旁組織方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。其可能解釋為:circ_0015278高表達(dá)有可能充當(dāng)miR-1228海綿從而加強(qiáng)野生型p53活性,后者為甲狀腺惡性腫瘤發(fā)展的主要抑制因素[16]。對于circ_0015278表達(dá)與惡性腫瘤特征的相關(guān)探討,之前有研究指出:circ_0015278與非小細(xì)胞性肺癌淋巴轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)[13]。

本研究中發(fā)現(xiàn),在PTC患者中高circ_0015278表達(dá)和患者年齡<45歲、無甲狀腺外侵犯、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低pTNM分期有相關(guān)性,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而未發(fā)現(xiàn)與性別、腫瘤大小具有相關(guān)性(P>0.05)。可能的解釋是:(1)circ_0015278高表達(dá)可阻止PTC腫瘤的發(fā)展及外侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,從而降低腫瘤的病理分期。(2)circ_0015278通過miR-1228減低PTC的EMT,和無甲狀腺外侵、轉(zhuǎn)移有關(guān)。(3)circ_0015278通過調(diào)節(jié)miR-1228/p53/EMT信號通路來阻止PTC腫瘤細(xì)胞繁殖和侵襲,從而抑制PTC腫瘤的進(jìn)程和發(fā)展。

本項(xiàng)研究的局限性:(1)本研究的研究周期較短,circ_0015278在PTC腫瘤中的長期預(yù)后價(jià)值待研究。(2)本研究中只探討了circ_0015278與PTC腫瘤及其臨床特征的相關(guān)性,而PTC腫瘤的外周循環(huán)血、尿液等中的circ_0015278表達(dá)的臨床價(jià)值待研究。(3)在本研究中未探討circ_0015278調(diào)控PTC進(jìn)程及發(fā)展的分子機(jī)制。

綜上,circ_0015278在PTC腫瘤中的表達(dá)明顯降低,其高表達(dá)和PTC腫瘤的無甲狀腺外侵犯、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低pTNM分期相關(guān)。本研究提示:circ_0015278有可能作為改善PTC腫瘤治療及預(yù)后的潛在腫瘤標(biāo)志物。