顏微微 鄧可斌

耳鳴是一種聽(tīng)覺(jué)幻覺(jué),是一種在沒(méi)有聲音刺激的情況下感知聲音的現(xiàn)象,其被認(rèn)為源于耳蝸和中樞神經(jīng)系統(tǒng),出現(xiàn)的原因可能與失眠、焦慮、抑郁、認(rèn)知功能障礙和壓力等衰弱狀況有關(guān)[1]。目前還沒(méi)有能夠治療耳鳴的醫(yī)學(xué)設(shè)備,僅可以通過(guò)藥物、膳食補(bǔ)充劑或者助聽(tīng)器來(lái)緩解,但治療效果并不顯著[2]。因此,研究耳鳴的潛在發(fā)病機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。SIN3A是SIN3/組蛋白脫乙酰酶(HDAC)轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物的中心支架蛋白,有研究發(fā)現(xiàn)SIN3A缺失會(huì)增加突觸支架Homer1的表達(dá),改變代謝型谷氨酸受體5(metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)對(duì)海馬體長(zhǎng)期記憶增強(qiáng)的依賴(lài)性[3,4]。Homer1是一種突觸后支架蛋白,位于突觸后密度區(qū),其在情緒障礙和抗抑郁治療中起著重要作用,有研究已經(jīng)證明了Homer1在耳鳴小鼠的聽(tīng)覺(jué)皮層中被上調(diào),而mGluR5抑制劑可以通過(guò)抑制Homer1表達(dá)而對(duì)耳鳴具有抑制作用[5,6]。東莨菪堿(Scopolamine,SPL)是一種莨菪烷型生物堿,它存在于茄科植物中,可用作中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑,用于誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)損傷[7]。已有研究發(fā)現(xiàn),SPL誘導(dǎo)的失憶癥與SIN3A的上調(diào)表達(dá)有關(guān),而SIN3A的失調(diào)與包括Homer1在內(nèi)的神經(jīng)元即刻早期基因的表達(dá)相關(guān)[8]。已知SPL可以選擇性地增強(qiáng)大鼠嗅覺(jué)皮層中氣味表征的泛化,但對(duì)大鼠聽(tīng)覺(jué)影響的研究還較少。因此,本研究通過(guò)水楊酸誘導(dǎo)大鼠耳鳴來(lái)探討SPL是如何調(diào)節(jié)SIN3A表達(dá)對(duì)耳鳴大鼠的mGluR5/Homer1信號(hào)通路產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠:SPF級(jí)SD大鼠50只,8周齡180～220 g,購(gòu)自于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(蘇)2021-0013。

1.1.2 主要試劑:氫溴酸東莨菪堿片(廣州白云山光華制藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H44020373);卡馬西平片(常州康普藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H32021277);Trizol試劑(貨號(hào):R401-01,南京諾唯贊生物科技股份有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒(貨號(hào):RR036A、RR820L,北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司);SIN3A、mGluR5、Homer1抗體(貨號(hào):ab307197、ab76316、ab184955,英國(guó)abcam公司);山羊抗兔IgG(貨號(hào):E-AB-1103,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備及分組:將所有大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性組、SPL低、高劑量組,每組10只。除對(duì)照組外,其余組均按照文獻(xiàn)[9]方法對(duì)大鼠腹腔注射200 mg/kg的水楊酸鹽,2次/d,連續(xù)注射14 d。陽(yáng)性組大鼠用劑量5 mg/kg的卡馬西平灌胃[10],SPL低、高劑量組分別以劑量為0.03 mg/kg、0.09 mg/kg的SPL灌胃給藥[11],對(duì)照組和模型組分別灌胃給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 驚跳反射前脈沖抑制(PPI)檢測(cè):先將大鼠置于65 dB聲壓級(jí)的白色背景噪聲中,且固定在裝有壓力感受器的平臺(tái)上。測(cè)試時(shí),先隨機(jī)給予大鼠10次115 dB聲壓級(jí)的脈沖刺激,然后利用揚(yáng)聲器再對(duì)大鼠進(jìn)行30次聲音刺激(10次115 dB的脈沖刺激,10次沒(méi)有脈沖的驚跳反射刺激,10次前脈沖驚跳反射刺激),前脈沖驚跳刺激分別用75 dB、80 dB、85 dB不同的聲強(qiáng),記為PPI2、PPI4、PPI8,每次聲音刺激時(shí)間間隔為27～32 s。根據(jù)儀器記錄每組實(shí)驗(yàn)大鼠的震驚反射幅度(ASR)以及PPI數(shù)值。計(jì)算PPI(%)=(1-PPI/ASR)×100%。

1.2.3 聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè):先用1%的戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)大鼠,然后將大鼠放置在隔音箱的加熱毯上,針狀電極插入皮下,探查電極插入顱頂,參考電極插入左耳垂下,接地電極插入右耳垂下,將揚(yáng)聲器按照校準(zhǔn)的距離放在小鼠耳間軸的前面,先進(jìn)行一個(gè)短聲刺激。然后開(kāi)始測(cè)試實(shí)驗(yàn),測(cè)試聲強(qiáng)從85 dB開(kāi)始,依次遞減5 dB,重復(fù)刺激,記錄各組大鼠的ABR閾值。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)大鼠聽(tīng)皮層組織中SIN3A的mRNA水平:將大鼠麻醉處死后,摘取大鼠大腦并分離聽(tīng)皮層,利用Trizol法提取部分聽(tīng)皮層的總RNA,然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA,反應(yīng)體系為:5× PrimeScript Mix 4 μl,Random 1 μl,RNA模板 1 μl,加水至總體系20 μl。然后利用試劑盒配制qPCR反應(yīng)體系:2×TB Green Premix Ex Taq II 10 μl,上下游引物各1 μl,cDNA模板1 μl,加水至總體系20 μl。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30 s;2步法:95℃變性10 s,60℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計(jì)算SIN3A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列:SIN3A:F-5’-TGTAGAGGGCCTGGTACCCT-3’,R-5’-ATGGGGACAGCATCTGGTTG-3’;β-actin:F-5’-GTCGTACCACTGGCATTGTG-3’,R-5’-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)大鼠聽(tīng)皮層組織中SIN3A、mGluR5、Homer1蛋白的表達(dá)水平:取大鼠聽(tīng)皮層組織加入蛋白裂解液提取總蛋白,并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜。然后將PVDF膜用5%脫脂牛奶在4℃封閉過(guò)夜,接著與一抗稀釋液(SIN3A、Homer1稀釋倍數(shù)1∶1 000,mGluR5稀釋倍數(shù)1∶5 000)在室溫中孵育1.5 h,再與羊抗兔IgG二抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)在室溫中孵育1.5 h,用顯影劑顯色。最后以β-actin為內(nèi)參蛋白,用凝膠成像儀和Image J軟件分析蛋白條帶及灰度值。

2 結(jié)果

2.1 SPL對(duì)耳鳴大鼠PPI的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠的PPI2、PPI4、PPI8均升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組和SPL處理組大鼠的PPI2、PPI4、PPI8均降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠3種前脈沖刺激的PPI抑制率 n=10,%,

2.2 SPL對(duì)耳鳴大鼠ABR的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠的ABR反應(yīng)閾值升高(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組和SPL處理組大鼠的ABR反應(yīng)閾值降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠的ABR反應(yīng)閾值 n=10,

2.3 SPL對(duì)耳鳴大鼠中SIN3A mRNA水平及蛋白的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠的組織中SIN3A mRNA水平及蛋白均降低(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組和SPL處理組大鼠的組織中SIN3A mRNA水平及蛋白均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表3。

圖1 5組大鼠組織中SIN3A蛋白條帶;A 對(duì)照組;B 模型組;C 陽(yáng)性組;D SPL低劑量組;E SPL高劑量組

表3 5組大鼠組織中SIN3A mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量 n=5,

2.4 SPL對(duì)耳鳴大鼠中mGluR5、Homer1蛋白的影響與對(duì)照組比較,模型組大鼠的組織中mGluR5、Homer1蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組和SPL處理組大鼠的組織中mGluR5、Homer1蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4,圖2。

圖2 5組大鼠組織中mGluR5、Homer1蛋白條帶;A 對(duì)照組;B 模型組;C 陽(yáng)性組;D SPL低劑量組;E SPL高劑量組

表4 5組大鼠組織中mGluR5、Homer1蛋白的相對(duì)表達(dá)量 n=5,

3 討論

耳鳴是一種幻覺(jué),是由于從耳蝸到大腦的聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)纖維輸入減少而在大腦內(nèi)產(chǎn)生的。在大多數(shù)情況下,這是由獲得性聽(tīng)力損失引起的,并且只有當(dāng)這種損失與聽(tīng)覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)外腦網(wǎng)絡(luò)中明顯的神經(jīng)元變化相結(jié)合時(shí)才會(huì)持續(xù)[12]。目前的治療方法包括教育和(或)咨詢(xún)、放松療法、耳鳴再訓(xùn)練療法和耳級(jí)發(fā)聲器或助聽(tīng)器,但不能治療潛在的感知[13]。因此,尋找針對(duì)耳鳴有效的治療方法依然是重中之重。

SPL是主要生物堿之一,存在于茄科的多種植物中,它們具有很強(qiáng)的抗膽堿能活性,并在中樞和外周毒蕈堿受體上作為乙酰膽堿的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑,并且在進(jìn)入體內(nèi)后可以穿透血腦屏障并與大腦皮層和皮層下區(qū)域的乙酰膽堿受體結(jié)合[14]。有研究發(fā)現(xiàn)低劑量的SPL能夠?qū)σ钟舭Y小鼠產(chǎn)生抗抑郁作用,也能夠促進(jìn)腦損傷后癲癇的緩解[11,15]。但對(duì)耳鳴大鼠的研究還較少,因此,本研究用水楊酸注射大鼠發(fā)現(xiàn),模型組大鼠的前脈沖抑制率以及ABR閾值顯著高于對(duì)照組,揭示了水楊酸鹽成功誘導(dǎo)了大鼠耳鳴模型;而陽(yáng)性藥物和SPL處理后,大鼠的前脈沖抑制率及ABR閾值低于模型組,表明SPL能夠抑制水楊酸誘導(dǎo)大鼠耳鳴,恢復(fù)大鼠聽(tīng)力。

SIN3是一種進(jìn)化上保守的核支架蛋白,作為基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有SIN3A和SIN3B兩個(gè)旁系同源物,其中SIN3A可以直接調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、存活、代謝和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的分子[16,17]。有研究證明SIN3A在神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞中均有表達(dá),且能夠調(diào)節(jié)SPL誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙[18]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠中SIN3A的mRNA和蛋白水平均降低,陽(yáng)性藥物和SPL處理后SIN3A的mRNA和蛋白水平均升高。揭示了SPL能夠提高SIN3A的表達(dá)水平。據(jù)了解,SIN3A的減少會(huì)增加Homer1的表達(dá)并影響mGluR下游的信號(hào)級(jí)聯(lián),從而調(diào)節(jié)海馬突觸的可塑性[4]。

Homer1是一種立即早期基因,隨著神經(jīng)元活動(dòng)的增加而表達(dá),在興奮性突觸傳遞的穩(wěn)態(tài)控制中起作用,可以很好地響應(yīng)視覺(jué)體驗(yàn)的變化[19]。mGluR5也是突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶的重要調(diào)節(jié)劑,與精神分裂癥、阿爾茨海默病及重度抑郁癥等多種腦部疾病有關(guān)[20]。有研究已經(jīng)指出Homer1在水楊酸鹽誘導(dǎo)的耳鳴大鼠中表達(dá)上調(diào),且mGluR5的抑制劑也可以抑制Homer1的表達(dá)[6]。

本研究的結(jié)果顯示,模型組中mGluR5和Homer1的蛋白表達(dá)升高,陽(yáng)性藥物和SPL處理組中mGluR5和Homer1的蛋白表達(dá)降低。揭示了SPL能夠抑制耳鳴大鼠中mGluR5/Homer1信號(hào)通路。我們推測(cè)可能是通過(guò)促進(jìn)SIN3A的表達(dá)來(lái)抑制水楊酸鹽誘導(dǎo)的耳鳴大鼠中mGluR5和Homer1蛋白的上調(diào)。

綜上所述,SPL可以通過(guò)促進(jìn)SIN3A的表達(dá),來(lái)抑制水楊酸誘導(dǎo)的耳鳴大鼠mGluR5/Homer1信號(hào)通路,從而緩解大鼠的耳鳴。本研究為治療耳鳴提供了新的藥物及研究思路。但本研究中SPL劑量太高可能會(huì)誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生認(rèn)知障礙,因此,針對(duì)該藥物在臨床上的治療劑量還需要進(jìn)一步深入研究。