閆娟 宋玉霞 薛穎 趙芳 金立娟 周莎莎

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,發(fā)病較為隱匿,且很早就會出現盆腔或者大腹腔內的擴散轉移,或者淋巴轉移。早期無明顯的癥狀和體征,因而難于早期發(fā)現,再加上現在可用于卵巢癌相關的早期篩查與診斷的生物標記物仍然缺乏,進而造成大多數患者就診時已屬晚期[1,2]。有研究表明>70%的卵巢癌患者直到發(fā)展到Ⅲ期或Ⅳ期時才被診斷發(fā)現,診斷為晚期的卵巢癌患者的5年生存率<30%,但早期診斷的卵巢癌患者5年生存率可高達92%[3],因此對于卵巢癌患者的早期診斷就顯得尤為重要,而目前對于卵巢癌的常用檢測方法如經陰道彩色多普勒超聲、血清癌抗原125等對于病變的早期診斷尚存在一定的局限性[4]。因此從分子生物學機制方面對卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制進行探究,進而尋找可用于早期診斷的生物標志物與治療靶點已經成為卵巢癌診斷與治療的新方向。長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA,lncRNA)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,能夠對染色質修飾、轉錄過程中或轉錄后調控下游基因的表達進行作用,進而對細胞增殖、侵襲和凋亡等生物學過程起作用[5]。因此,LncRNA成為腫瘤研究方向的熱點,越來越受到重視。linc00978又名miR4435-2HG,已有相關報道其在胃癌、肝癌、非小細胞肺癌、乳腺癌等腫瘤中存在高表達的情況,且與腫瘤患者的預后相關,linc00978高表達的患者生存情況較差[6-10],因此有可能作為這些腫瘤的診斷和預后預測的生物標志物,但筆者發(fā)現對于卵巢癌組織中l(wèi)inc00978的表達水平及其功能的相關研究在國內外尚未有相關文獻進行報道。因此,本研究通過qRT-PCR檢測 linc00978在卵巢癌中的表達水平,并探究其與卵巢癌患者臨床病例特征之間的相關性和對患者進行隨訪,進而分析linc00978表達與患者預后的關系,以期為卵巢癌的臨床診治提供新的潛在生物學標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年2月至2016年12月在石家莊市人民醫(yī)院婦產科行手術切除的卵巢癌組織共82例,選取同期因子宮脫垂于我科行全子宮加雙附件切除及術前BRCA基因檢測突變陽性行預防性雙附件切除者的卵巢組織43例。納入研究的卵巢癌患者年齡35～75歲,平均年齡(50.2±12.3)歲;其中年齡<50歲39例,年齡≥50歲的43例;根據FIGO分期標準進行區(qū)分:Ⅰ期10例,Ⅱ期14例,Ⅲ期49例,Ⅳ期9例;根據腫瘤的組織學分化程度進行區(qū)分:高分化12例,中分化50例,低分化20例;根據組織學分類進行區(qū)分:漿液性56例,黏液性15例,子宮內膜樣11例。正常卵巢組患者年齡39～70歲,平均年齡(52.4±11.6)歲。切除的卵巢組織于離體30 min內留存,經液氮冷凍處理后保存于-80℃冰箱內。本研究得到本院倫理委員會批準,且所有納入研究的患者均簽署知情同意書,并自愿參與本研究。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:①符合卵巢癌診斷標準且經過病理確診;②取得卵巢癌組織前未經過放化療等腫瘤治療措施;③臨床特征資料及隨訪記錄完整。

1.2.2 排除標準:①合并其他系統腫瘤的患者;②合并嚴重急慢性感染性疾病的患者;③合并心、肝、腎等實質性臟器嚴重功能不全的患者。

1.3 隨訪 隨訪方式主要為電話隨訪和門診復查,隨訪截止日期為2018年12月。隨訪截止時仍存活的患者、隨訪過程中失訪的患者均視為截尾數據,其生存期為確診至末次隨訪時間;隨訪過程中已死亡的患者視為完全數據,其生存期為確診至死亡的時間。

1.4 實時PCR檢測表達量

1.4.1 主要試劑:Trizol試劑購買自美國Gibco公司,cDNA逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司,熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司,CFX96 熒光定量PCR檢測系統購自美國 Bio-Rad公司。

1.4.2 實時定量 PCR:組織研磨器預冷,放入卵巢組織0.1 g,加入液氮研磨成粉狀,迅速放入裝有1 ml Trizol試劑的EP管中,按照Trizol試劑說明書提取組織RNA,于-80℃凍存過夜后,使用紫外分光光度計檢測總RNA濃度和純度(260/280在1.8～2.0為合格)。符合要求方可進行cDNA合成。cDNA合成:利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計,由上海英濰捷基公司進行引物的合成。linc00978檢驗以U6為內參基,linc00978上游引物序列為5’-AGGCCCCAGGGAATCTTTCA-3’,下游引物序列為5’-GCCTCTCCCTGAATAACTGGG-3’,內參基因U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。利用熒光定量PCR檢測試劑盒,以20 μl反應體系進行PCR反應。10 μl 2XSYRR Green PCR Master Mix,上下游引物(5 mmol/L)各0.3 μl,cDNA模板1.5 μl。反應程序設定:預變性94℃ 10 min,變性 94℃ 30 s,退火55℃ 30 s,延伸72℃ 30 s,收集熒光 83℃ 30 s,循環(huán)40次。每個樣本重復3次進行實驗。采用2-ΔΔCt法進行計算linc00978的相對表達量計算。

2 結果

2.1 linc00978在組織中的表達情況 qRT-PCR結果表明,與正常卵巢組織(1.13±0.32)比較,在卵巢癌組織(2.24±0.23)中l(wèi)inc00978的相對表達量高于正常卵巢組織(P<0.001)。見表1,圖1。

圖1 linc0097 在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達

表1 linc00978在組織中的表達情況

2.2 卵巢癌中l(wèi)inc00978的表達與臨床病理特征的關系 將卵巢癌組織中的linc00978表達量按照其中位數分為高表達(n=49)和低表達2組(n=33),并對表達水平和卵巢癌患者的臨床病理特征進行相關性分析。研究結果表明,linc00978表達與年齡無關(P>0.05),lin00978與FIGO分期、分化類型、病例類型存在相關(P<0.05)。見表2。

表2 卵巢癌患者不同臨床病理特征與linc00978表達的關系 例(%)

2.3 linc00978表達與患者預后的關系 Linc00978低表達組患者術后3年生存率為60.61%、5年生存率為30.30%,中位生存時間為49個月;linc00978高表達患者術后3年生存率為44.90%、5年生存率為14.29%,中位生存時間為27個月。經過Log-Rank檢驗,linc00978高表達組5年生存率低于低表達組的5年生存率(χ2=6.054,P=0.014)。見圖2。

圖2 linc00978 高表達組和低表達組患者生存率比較

3 討論

卵巢癌是發(fā)病率居第三位的婦科腫瘤但卻是最致命的惡性腫瘤。由于患者缺乏早期的典型臨床癥狀,因此大多數患者在就診時已屬晚期,早期卵巢癌的患者5年生存率較高,晚期患者的5年生存卵巢較差,目前對卵巢癌主要的治療以手術治療為主,并對患者輔助化療、放療、靶向治療等,但晚期患者遠期存活率并無明顯改善。因此對于卵巢癌患者的早期發(fā)現就顯得尤為重要。通過探究卵巢癌的發(fā)病機制,從而為卵巢癌患者提供新的早期診斷標志物和治療靶點已經成為研究者迫切需要解決的問題。

非編碼RNA是指沒有編碼蛋白質能力的RNA,其中長度超過200個堿基對的沒有編碼蛋白質能力的一類RNA成為LncRNA。研究表明,LncRNA表達常與鄰近基因表達相關,常參與到基因啟動子的增強活性、轉錄過程和轉錄本的剪接過程中,從而對基因的表達起到調控作用[11]。由于LncRNA在基因表達的過程中起著調控子的作用,因此LncRNA也可以參與到腫瘤的相關過程中,其異常表達導致了相應功能的改變,從而對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要的作用。研究表明,LncRNA可以通過轉錄或轉錄后的表達水平調節(jié)表觀遺傳調控子/修飾子來調控腫瘤細胞的生長、增值、轉移以及促進血管生成等過程,進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12,13]?，F有研究表明,多數LncRNA在卵巢癌中表達失調,其異常表達可以影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程,因此LncRNA可以作為卵巢癌早期診斷和治療的新靶點[14,15]。齊之迎[16]研究發(fā)現,LncRNA CCAT1在患者卵巢癌組織中的表達水平明顯升高,并與患者的臨床病理特征存在相關關系,可能通過抑制let-7、miR-218-5p的表達水平,上調c-myc與Bim1,并通過調節(jié)E-cadherin和N-cadherin的水平,從而促進上皮間質轉化的發(fā)生進而促進卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲,并抑制卵巢癌細胞的凋亡。王淼等[17]研究發(fā)現,長鏈非編碼RNA PVT1在卵巢癌組織中的表達水平與miR-31表達水平呈負相關,下調PVT1的表達水平可以促進miR-31的表達,從而抑制卵巢癌細胞的轉移侵襲能力。由于LncRNA可以參與到卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中,因此進一步研究并闡釋lncRNA在調控卵巢癌生物學行為中的作用,可以為卵巢癌的靶向治療及早期診斷提供新的靶點和理論支持。

linc00978定位于人類基因的Chr2q13.1。Yang等[18]首先發(fā)現了linc00978在肺癌組織及肺癌細胞中表達升高,是肺癌的致癌基因,經過基因敲除后,肺癌細胞的生存能力顯著降低,腫瘤的生存緩慢,表明與肺癌的發(fā)生及預后存在相關。后續(xù)的研究發(fā)現其在胃癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤中存在高表達,并與腫瘤患者的預后情況存在相關。Deng等[10]研究發(fā)現,linc00978在高轉移的乳腺癌細胞中的表達情況顯著高于低轉移的乳腺癌細胞,且與乳腺癌組織中的表達量顯著高于正常乳腺組織,表明linc00978可能是乳腺癌的致癌基因,linc00978與乳腺癌患者的生存情況存在相關,linc00978高表達的乳腺癌患者預后相較低表達患者差。Ke等[19]研究認為血漿中的linc00978的表達可作為胃癌的診斷標記。目前l(fā)inc00978在卵巢癌組織中的表達水平及其功能筆者尚未在國內外發(fā)現有相關文獻進行報道。本研究應用qRT-PCR 方法檢測linc00978在卵巢癌和正常卵巢組織中的表達水平,結果表明卵巢癌組織中的linc00978表達量(2.24±0.23)高于正常卵巢組織中的表達量(1.13±0.32),差異有統計學意義(P<0.05)。這與之前l(fā)inc00978在其他腫瘤中表達情況的的研究結果一致,因此,我們認為linc00978可能是潛在的致癌基因,其在卵巢中異常的高表達可能促進了腫瘤的發(fā)生。

本研究中,我們進一步分析了linc00978與卵巢癌患者的臨床病理特征之間的關系,結果顯示,linc00978的表達與卵巢癌患者的年齡無關,與分化程度、FIGO分期、病理類型存在相關。在中分化、低分化的卵巢癌患者中,高表達患者的比例高于低表達患者的比例,結果提示,linc00978的表達情況可能隨著分化程度的降低而升高。在FIGO分期中,Ⅲ期、Ⅳ期患者中l(wèi)inc00978高表達的比例高于Ⅰ期、Ⅱ期的卵巢癌患者。在病理類型中,漿液性和黏液性卵巢癌患者中,linc00978高表達比例高于低表達的比例。子宮內膜樣卵巢癌中,linc00978低表達的比例較高。由于患者的人數較少,需要進一步驗證,以增加結果的可靠性。Deng等[10]通過對linc00978的表達與乳腺癌患者的臨床特征關系的研究表明,linc00978的表達與患者的年齡不存在相關性,與激素受體存在相關,在ER陽性的乳腺患者中顯著高表達。黃振華等[9]通過對linc00978的表達與胃癌患者的臨床特征進行分析,結果表明,linc00978的表達與胃癌患者的年齡無關,與患者的淋巴結有無轉移、浸潤深度、TNM分期存在相關性。Wang等[20]研究表明,抑制linc00978的表達通過抑制miR-4288的表達,從而抑制膀胱癌細胞的增值、遷移和侵襲。Xu等[21]研究表明linc00978通過經由EZH2介導的表觀遺傳沉默抑制p21和E-鈣粘著蛋白表達來促進肝細胞癌的進展。目前l(fā)inc00978如何調控卵巢癌發(fā)生發(fā)展,相關的調控機制尚缺乏相關研究,因此需要進一步深入探討相關機制,為linc00978的實際應用提供更為充足的證據。現有研究已經闡明的linc00978在其他腫瘤中的作用機制可為其在卵巢癌中發(fā)揮作用的機制研究提供借鑒。

同時,在本研究中,我們對linc00978的表達情況與卵巢癌患者的生存情況進行了分析,結果表明,linc0078高表達的卵巢癌患者中位生存時間為27個月,5年生存率為14.29%;linc00978低表達患者的中位生存期為49個月,5年生存率為30.30%,經Log-Rank檢驗,差異有統計學意義(P<0.05)。linc00978高表達卵巢癌患者的生存較低表達患者差。這與之前Deng等[12]在乳腺癌患者中l(wèi)inc00978表達與生存狀況相關關系的研究結果相一致,linc00978高表達乳腺癌患者的無病生存期低于linc00978低表達患者的無病生存期。目前卵巢癌的診療過程中仍然缺乏較為有效的評價預后的生物標志物,進一步研究卵巢癌的發(fā)病機制可以為卵巢癌的診療過程及預后研究提供新的方向。

綜上所述,本研究的結果提示與正常卵巢組織相比,linc00978在卵巢癌中的表達明顯升高,linc00978與卵巢癌患者的年齡無關,與卵巢癌分化程度、FIGO分期、病理類型存在相關,并且與卵巢癌患者的預后相關,linc00978高表達的卵巢癌預后較差。linc00978可以作為預后判斷的獨立危險因素,具有潛在的臨床應用價值。目前針對linc00978在卵巢癌的機制研究尚未見報道,后續(xù)仍需要對其機制進行深入研究,如通過構建linc00978敲除的細胞和動物模型,探討其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中所起到的作用,明確其分子機制,為將來卵巢癌的臨床診斷、治療以及預后判斷提供詳細的理論依據。