李暢 范榮 李東波 周威 黃玉娥

骨折的修復(fù)是一個再生過程,包括血管生成、干細(xì)胞分化、成骨和軟骨形成[1]。而5%～10%的骨折會導(dǎo)致愈合延遲或不愈合[2],這兩種情況都需要反復(fù)治療,并且對生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。骨折的治療比骨折更困難。手術(shù)是主要的臨床治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種具有多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)作用和能進行自我更新的多能干細(xì)胞等[3]。其中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)能夠分化為成骨細(xì)胞、表皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞譜系[4,5]。外泌體(exosomes)是正常生理和病理條件下細(xì)胞間通訊的重要參與者,被證明在組織修復(fù)中具有重要作用[6]。這些30～150 nm的小顆粒被大多數(shù)細(xì)胞通過與質(zhì)膜融合而分泌到細(xì)胞外環(huán)境中[7]。當(dāng)將外泌體施用于異種動物時,它們不會誘導(dǎo)明顯的免疫反應(yīng)。脂質(zhì)體膜可以保護外泌體的內(nèi)容物免受破壞。外泌體上的特定表面配體可以與靶細(xì)胞結(jié)合,使外泌體將RNA、蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子傳遞到靶細(xì)胞中以刺激特定的生物學(xué)功能[8]。本實驗研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體對大鼠骨折是否具有促進骨愈合作用,并探究成骨作用的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:雄性Wistar大鼠(3周齡)和成年雄性Wistar大鼠(12周齡,250～300 g)由海南藥物研究所有限責(zé)任公司提供[動物使用合格證:SYXK(瓊)2013-0022]。實驗大鼠按照實驗標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于動物房中,實驗動物設(shè)計通過倫理委員會審查。

1.1.2 試劑:Percoll分離液、PBS、茜素紅S和油紅O購自美國Sigma公司。胎牛血清和DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。CD45-PE、CD29-FITC、CD90-FITC、CD45-PE、CD117-APC、CD63和CD81抗體購自美國BD Biosciences公司。BMP2、Smad1、Runx2、IgG和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。HE染色試劑盒購自北京凱瑞基生物科技公司。RIPA裂解液和BCA試劑盒購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞提取與培養(yǎng):腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死Wistar大鼠后,將大鼠用75%乙醇浸泡消毒,快速移入超凈工作臺,進行細(xì)胞提取相關(guān)操作。將大鼠固定,分離出大鼠股骨,將骨頭表面肌肉剔除,PBS清洗2次。將股骨兩端剪斷,用DMEM/F12培養(yǎng)基將骨頭中骨髓沖出并收集在離心管中,反復(fù)吹打,1 000 r/min離心5 min,棄上清收集沉淀,并使用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液加入到Percoll分離液中,并反復(fù)吹打,2 000 r/min,離心20 min。吸取中間白色渾濁狀骨髓基質(zhì)細(xì)胞層,1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞沉淀。重懸細(xì)胞并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基去掉,除去未貼壁細(xì)胞,再補充新鮮培養(yǎng)基,每3天換液1次。

1.2.2 BMMSCs的體外分化:①成骨分化:成骨分化的培養(yǎng)基條件:完全培養(yǎng)基補充0.05 mmol/ml抗壞血酸-2-磷酸、100 nmol/ml地塞米松和10 mmol/ml β-甘油磷酸酯。分離的BMMSCs在上述培養(yǎng)基條件培養(yǎng)4周,2%茜素紅S(pH值 4.1～4.3)染色評估成骨分化情況。②成脂分化:成脂分化的培養(yǎng)基條件:完全培養(yǎng)基補充10～6 mol/L地塞米松、0.5 mmol/ml異丁基-甲基黃嘌呤、200 μmol/ml吲哚美辛和10 mg/ml胰島素。分離的BMMSCs在上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)2周,0.5%油紅O染色細(xì)胞內(nèi)脂滴來評估脂肪分化情況。

1.2.3 細(xì)胞流式術(shù):用胰蛋白酶消化第3代BMMSCs,并重懸于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中。 用PBS洗滌細(xì)胞2次。隨后,將細(xì)胞與抗CD29-FITC抗體、抗CD90-FITC抗體、抗CD45-PE抗體、抗CD117-APC抗體、抗CD81抗體和抗CD63抗體孵育30 min。然后將細(xì)胞懸液以1 000 r/min,離心5 mim。最后,將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到新的檢測管中,然后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原。

1.2.4 外泌體的分離與鑒定:80% 融合的BMMSCs在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,然后將培養(yǎng)基移至新試管中,在4℃下以300 g離心10 min。然后將上清液在4℃下以16 500 g離心30 min,以消除細(xì)胞碎片。通過使用0.22 μm過濾器過濾細(xì)胞上清液,以去除整個細(xì)胞和多余的細(xì)胞碎片。之后,將上清液移至新試管中,在4℃下以100 000 g進行70 min超速離心,以沉淀外泌體。收集沉淀物后,再次進行超速離心,并收集沒有外泌體的上清液用于后續(xù)實驗。外泌體通過納米粒子跟蹤分析(NTA),透射電子顯微鏡(TEM)和流式細(xì)胞術(shù)進行鑒定。

1.2.5 大鼠骨折模型制備:腹腔注射3% 戊巴比妥鈉麻醉大鼠,在右股骨干附近進行手術(shù)。10 mm切口暴露右股骨干。首先將中段處股骨橫行切斷,隨后在骨折近端逆行插入髓內(nèi)固定針,并從股骨大轉(zhuǎn)子穿出,傷口用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗后縫合。手術(shù)結(jié)束后,大鼠在清潔級環(huán)境下單籠飼養(yǎng),并經(jīng)腹腔注射青霉素(100 000 U/ml,1 ml/kg)3 d。

1.2.6 分組及給藥:分組:60只Wistar大鼠按照1.2.5制備骨折模型,將大鼠隨機分為對照組(control組)、沒有外泌體的培養(yǎng)基組(CM-Exo)和外泌體組(Exo組),每組20只。大鼠經(jīng)造模24 h后,尾靜脈注射給藥500 μl。control組:PBS溶液;CM-Exo組:沒有外泌體的上清液500 μl;Exo組:外泌體500 μl(外泌體蛋白濃度為200 μg/ml)。42 d后,麻醉處死大鼠,取材,進行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.2.7 mirco-CT:4%多聚甲醛固定大鼠股骨24 h后,使用micro-CT系統(tǒng)以50 kV和200 μA的9 μm分辨率分析大鼠愈傷組織體積(CV)、骨體積(BV)與總體積(TV)的比值。

1.2.8 HE:固定、包埋的股骨組織切片后進行HE染色。切片經(jīng)二甲苯脫蠟后,使用不同濃度梯度乙醇(100%,5 min;95%,2 min;85%,2 min;75%,2 min)脫水。依次進行蘇木精染色5 min,伊紅染色3 min,染色后乙醇脫水(75%、85%、95%乙醇脫水,5 min/次),二甲苯透明,中性樹膠封片,切片制備完成。

1.2.9 Western blot:將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去后,加入RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白。蛋白樣本經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,4℃孵育一抗過夜:BMP2抗體(1∶1 000)、Smad1抗體(1∶1 000),Runx2抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶2 000)。TBST洗滌3次,再用IgG-HRP二抗(1∶5 000)孵育1 h,TBST洗滌3次后,顯影曝光,并用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1 BMMSCs的形態(tài)和分化鑒定 從Wistar大鼠股骨中提取的BMMSCs具有梭形形狀并顯示出渦旋分布。將第3代BMMSCs接種到6孔板中誘導(dǎo)成骨和脂質(zhì)分化:誘導(dǎo)21 d后,茜素紅S染色結(jié)果表明存在許多鈣化結(jié)節(jié),同樣,油紅O染色結(jié)果也顯示出大量的脂質(zhì)滴。見圖1。

圖1 BMMSCs的形態(tài)和分化鑒定;A BMMSCs的細(xì)胞形態(tài);B BMMSCs的成骨分化檢測(茜素紅S染色×400);C BMMSCs的成脂分化檢測(油紅O染色×400)

2.2 BMMSCs表面標(biāo)志物檢測 流式細(xì)胞術(shù)表明CD29、CD90在BMMSCs中高表達(dá),但CD45和CD117在BMMSCs不表達(dá),并且其表型在傳代中始終保持不變。見圖2。

圖2 BMMSCs表面標(biāo)志物檢測

2.3 外泌體的表征 TEM圖像表明,大多數(shù)顆粒為圓形;NTA結(jié)果表明外泌體的直徑范圍均為50～150 nm;流式細(xì)胞儀分析檢測到外泌體的特定表面標(biāo)記,包括CD81和CD63在外泌體中呈陽性。見圖3。

圖3 外泌體的表征;A TEM顯示外泌體的形態(tài);B NTA測定純化的外泌體中粒徑分布;C 流式細(xì)胞術(shù)檢測外泌體外泌體的特定表面標(biāo)記:CD81和CD63

2.4 外泌體對骨折愈合的影響 micro-CT檢查結(jié)果顯示,在control組和CM-Exo組觀察到明顯的骨折間隙,而Exo組骨折間隙中形成了新的骨形態(tài);Exo組的愈傷組織體積明顯高于control組和CM-Exo組(P<0.01);Exo組的BV/TV明顯高于control組和CM-Exo組(P<0.01)。見表1。

表1 外泌體對骨折愈合的影響

2.5 外泌體對3組大鼠股骨組織病理變化的影響 HE結(jié)果表明,control組和CM-Exo組股骨骨折處存在纖維組織;與control組和CM-Exo組比較,Exo組股骨的骨折部位編織骨形成增加。Exo干預(yù)可改善大鼠股骨骨折愈合情況。見圖4。

圖4 外泌體對3組大鼠股骨組織病理變化的影響(HE染色×200)

2.6 外泌體對BMP2/Smad1/RUNX2途徑的影響 Western blot結(jié)果顯示,與control組和CM-Exo組比較,Exo組中BMP2、Smad1和RUNX2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)。見圖5,表2。

表2 BMP2/Smad1/RUNX2途徑蛋白表達(dá)統(tǒng)計表

圖5 外泌體對BMP2/Smand1/RUNX2途徑蛋白表達(dá)的影響

3 討論

隨著老齡化社會的到來,與年齡有關(guān)的疾病盛行,其中老年人的骨折發(fā)生率明顯增加。骨折的愈合能力根據(jù)生物體的年齡而有很大不同。例如,在某些特定類型的骨折中,許多老年人因骨折愈合延遲或骨不連而感到痛苦[9]。骨折后延長康復(fù)過程可能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥,甚至可能導(dǎo)致死亡[10]。

研究發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞已成為治療骨折的另一種選擇[11]。MSCs由于具有骨再生潛力,被認(rèn)為是最適合自體治療的干細(xì)胞類型之一[12]。BMMSCs已被證明可有效增強成骨和血管生成[13]。Baker等[14]揭示MSCs的成骨作用是通過PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑發(fā)生的。干細(xì)胞的應(yīng)用仍然受到免疫排斥、惡性轉(zhuǎn)化、染色體變異等的限制[15],而且大多數(shù)用于臨床試驗的MSCs缺乏足夠的臨床前研究和制造質(zhì)量控制。

外泌體是重要的旁分泌因子,可以用作組織修復(fù)的治療手段,特別是在骨再生領(lǐng)域[16]。外泌體能誘發(fā)非免疫相容性動物也不會誘發(fā)明顯的免疫反應(yīng)[17]。Narayanan等[18]研究發(fā)現(xiàn)外泌體可在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)MSCs的特異性分化,并在骨折愈合過程中促進血管生成。本實驗中發(fā)現(xiàn),Exos組骨折間隙中形成了新的骨形態(tài),愈傷組織體積和BV/TV明顯增加。

BMP2/Smad1/Runx2信號軸在BMMS增殖和成骨分化中發(fā)揮重要作用[19]。Smad蛋白與RUNX2蛋白共同參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中膠原蛋白和其他表型蛋白表達(dá)和分化[20]。我們的研究表明,用BMMSC-Exos刺激愈傷組織,BMP2、Smad1和RUNX2的表達(dá)水平顯著增加,表明BMP2/Smad1/RUNX2途徑在BMMSC-Exos增強成骨作用的有效性中起重要作用。

綜上所述,BMMSC-Exos通過促進成骨作用對骨折的治療起關(guān)鍵作用,其可能與BMP2/Smad1/RUNX2信號通路的激活有關(guān)。因此,BMMSC-Exos在骨折的治療過程中起著至關(guān)重要的作用,為臨床上治療骨折提供新的治療方法。