馮麗 賀慧敏 程林

缺血性卒中發(fā)生時因腦血流不足而引起的腦組織缺血性壞死。在當下心腦血管疾病發(fā)病率不斷增加的的背景下缺血性卒中的發(fā)病率持續(xù)增高。由于腦對血液供給的敏感性,即使短期的血液閉塞也可導致對神經(jīng)元產(chǎn)生不可逆的損傷,并且大多數(shù)患者遭受隨之而來的神經(jīng)功能障礙和認知功能障礙[1]。雖然美國食品藥品監(jiān)督管理局證明重組組織型纖溶酶原激活劑(tPA)可用于缺血性卒中治療中閉塞血管的再通,但tPA介導的有效溶栓治療窗較短,80%的患者因缺乏最佳溶栓治療而出現(xiàn)嚴重后遺癥甚至死亡[2]。此外,溶栓治療也增加了患者顱內(nèi)出血的風險,極大地限制了其臨床應用。目前,卒中的預防和治療仍然具有挑戰(zhàn)性,有必要找到與之相適應的神經(jīng)保護藥物,確定合適和有效的治療策略,這對減輕腦缺血的神經(jīng)損傷具有重要意義。桔梗皂苷D(platycodin D,PLD),傳統(tǒng)中草藥的主要生物活性成分之一,是一種齊墩果烷型三萜皂苷,具有兩條糖鏈;在苷元的C-3位連接一個葡萄糖基,在C-28位連接其他4個糖殘基鏈[3]。已被證明調(diào)節(jié)許多涉及凋亡、炎癥、氧化應激的生物過程[4]。先前的研究證明了預處理桔梗皂苷D降低了低氧/復氧誘導的H9c2心肌細胞的損傷[5]。然而,桔梗皂苷D在預防和治療腦缺血損傷中的功效仍不清楚。因此,為了進一步確定桔梗皂苷D的用途,我們建立了局灶性腦缺血再灌注損傷模型,探討桔梗皂苷D的治療效果,并測定了神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積、學習記憶能力、鐵死亡通路蛋白的表達。我們的發(fā)現(xiàn)為桔梗皂苷D在腦缺血再灌注損傷中的潛在應用提供了線索。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 研磨機、立體顯微鏡(南京江南永新光學有限公司,SZ6100)、水迷宮(上海新軟信息技術有限公司)、SDS-PAGE電泳設備(Bio-Rad,Mini Protean 3)、濕轉(zhuǎn)移膜儀器(Bio-Rad,170-3930)、脫色搖床(金壇醫(yī)療儀器,電化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon,180-5001)、BCA蛋白檢測試劑盒(Beyotime,P0010)、桔梗皂苷D(瑞芬思生物科技有限公司;純度≥99%)、抗MAP2/GPX4/FTH1/TfR1抗體(Abcam),以及HRP抗兔抗體(Beyotime,A0208)。

1.2 分組和動物管理 60只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(年齡8周;體重220～250 g)購自上海Alac實驗動物有限公司(中國上海);許可證號:SCXK(上海)2020-09。所有實驗均按照《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南》(美國國家研究委員會)進行,并經(jīng)本單位實驗動物使用倫理委員會批準。所有的大鼠都喂以標準嚙齒動物食物,無菌超純水可自由獲取,飼養(yǎng)在22%～25℃的環(huán)境中,濕度為40%～70%,光照-黑暗周期為12 h。正式實驗前動物適應7 d。將總共60只SD大鼠隨機分成4組(n=15):偽手術組(SHAM)、急性腦梗死組(MCAO)、急性腦梗死低劑量桔梗皂苷D治療組(MCAO + 桔梗皂苷D 10 mg/kg, MCAO+PLD-L)、急性腦梗死高劑量桔梗皂苷D治療組(MCAO + 桔梗皂苷D 20 mg/kg, MCAO+PLD-H),并在后續(xù)研究中采取雙盲策略進行檢測。桔梗皂苷D溶于無菌0.9%氯化鈉溶液水中。實驗組大鼠每天腹腔注射10或20 mg/kg桔梗皂苷D,而假手術組和MCAO組每天給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液,持續(xù)10 d。桔梗皂苷D劑量的選取參考自之前的研究[6]。

1.3 MCAO大鼠模型的建立 采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型[7],首先通過腹膜內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉然后固定在仰臥位。頸部被剃光并消毒,用于常規(guī)皮膚準備。做一個中線頸部切口以分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,然后結(jié)扎頸外動脈及其遠端。暫時夾住頸總動脈和頸內(nèi)動脈的近端。在靠近頸總動脈分叉處的頸外動脈上做一個小切口,并插入涂有硅的縫合線。移除頸內(nèi)動脈上的夾子,將縫合線通過頸外動脈輕輕插入頸內(nèi)動脈,直到大腦中動脈的起點被堵塞?？p合線的長度為18～20 mm。將縫合線收緊,移除頸總動脈上的夾子。然后縫合頸部皮膚;缺血狀態(tài)后2 h,拆除縫線,使血液供應再灌注。在假手術組,只解剖頸內(nèi)動脈,不做任何其他手術。術后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射10萬U青霉素鈉預防感染。

1.4 TTC染色法 將TTC粉末(0.2 g)溶解在10 ml PBS中,制成2% TTC染料溶液。將每組大鼠斷頭,收集腦組織并在20℃冷凍30 min。冠狀切片是從額葉到半球背面(2 mm)制作的。將切片浸入TTC染料溶液中,在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min,每5分鐘翻轉(zhuǎn)1次并避光。清洗后,將切片在10%甲醛溶液中固定5～10 min,吸收多余的液體,將切片拍照。并記錄梗塞面積占總面積的百分比:梗塞面積百分比(%)=蒼白面積/腦切片面積。

1.5 神經(jīng)功能評估 采用Longa評分法對神經(jīng)功能進行評分。評分標準:0分,無神經(jīng)功能缺損;1分,左前肢不能完全伸展;2分,左轉(zhuǎn)圈;3分,走路時向左傾倒;4分,無法自行行走或意識喪失;5分,死亡。1～3分表示大鼠模型誘導成功。

1.6 學習和記憶評估 用桔梗皂苷D治療后,為評估大鼠學習和記憶能力的變化。給藥10 d后,大鼠接受Morris水迷宮訓練5 d,并在第6天進行測試,以評價它們的學習記憶能力。定位導航訓練持續(xù)5 d。大鼠每天在固定時間接受1次訓練。它們被依次放置在c、d、a和b象限的水中。將大鼠入水后120 s內(nèi)爬上平臺的時間記錄為該象限搜索平臺的潛伏期。如果大鼠不能在120 s內(nèi)爬上平臺,將它們帶到平臺,記錄潛伏期為120 s。所有大鼠完成第一象限訓練后,依次開始下一象限訓練,直到所有大鼠完成所有象限的訓練。訓練結(jié)束時,老鼠爬上或被帶到平臺上,休息30 s,然后回到它們的籠子里。記錄四象限潛伏期的平均值作為訓練的逃避潛伏期。第6天空間探索實驗:拆除平臺,將大鼠置于平臺與目標象限相對的象限。在120 s內(nèi)記錄在目標象限花費的時間和大鼠穿過平臺所在目標象限的次數(shù)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析 通過斷頭處死大鼠,用剪刀取出海馬組織并放入勻漿器中。將1 mg組織加入10 ml裂解溶液中,將勻漿置于冰上30 min。將裂解的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到4℃的1.5 ml離心管中,并以10 000 r/min的速度離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中,將提取的蛋白質(zhì)與上樣緩沖液以1∶4 的體積混合,然后置于金屬浴中,在100℃變性10 min。10% SDS-PAGE電泳后,將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用5%牛奶封閉緩沖液封閉膜1 h,用tris緩沖鹽水和吐溫20(TBST)洗滌3次,每次5 min,然后與目標抗體(1∶1 000)在4℃下孵育過夜。用TBST洗滌3次(每次5 min)后,將膜與相應的二抗(1∶5 000稀釋)在室溫下孵育1 h。用TBST洗滌3次(每次5 min)后,將膜與ECL檢測試劑一起孵育。使用化學發(fā)光成像儀拍攝圖像。Image J軟件用于定量分析蛋白質(zhì)條帶的光密度。

1.8 免疫熒光染色 將獲得的腦組織用4%多聚甲醛在室溫下固定24 h,并轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液中。切成30 μm冰凍切片后用0.01 mol/L PBS洗滌5 min,用5%山羊血清,然后與針對MAP-2的一抗(1∶500)孵育過夜。洗滌后,將樣品與山羊抗兔Alexa-Fluor IgG二抗(1∶300)在室溫下反應1 h。細胞核在室溫下用DAPI染色10 min。在高倍視野下觀察損傷海馬的圖像(放大倍數(shù)×200;奧林巴斯BX53)。

1.9 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件,使用方差分析(ANOVA)各組間差異。組間比較采用Tukey多重比較檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 桔梗皂苷D治療改善急性腦梗死引起的神經(jīng)功能缺陷 給藥10 d后,使用Longa評分法對大鼠的神經(jīng)功能缺損進行評分。桔梗皂苷D組的神經(jīng)功能缺損評分低于MCAO組,劑量桔梗皂苷D組與MCAO組間均存在差異(P<0.05)。然而,高劑量組差異更明顯,這些發(fā)現(xiàn)表明用桔梗皂苷D治療可以改善急性腦梗死引起的神經(jīng)功能缺陷。見表1。

表1 桔梗皂苷D對急性腦梗死大鼠模型神經(jīng)功能缺損的影響 n=7,分,

2.2 桔梗皂苷D治療減少了腦梗死面積 為探討桔梗皂苷D治療對腦梗死的影響,用Image J分析并記錄MCAO大鼠的梗死面積。TTC染色圖像上的白色區(qū)域表示梗塞區(qū)域。與假手術組比較,MCAO模型組腦梗死面積明顯增加(P<0.01)。給藥10 d后,與MCAO組比較,高劑量桔梗皂苷D組梗死面積減小明顯減少;高劑量藥物組比低劑量藥物組降低更顯著(P<0.01)。見圖1,表2。

表2 桔梗皂苷D對急性腦梗死大鼠模型腦梗死面積的影響 n=8,%,

2.3 桔梗皂苷D治療減輕了急性腦梗死引起的空間認知功能缺陷并促進了功能恢復 為了評估桔梗皂苷D治療對存活神經(jīng)元和腦功能狀態(tài)的作用,使用Morris水迷宮評估大鼠的學習和記憶。定位導航實驗中較長的逃脫潛伏期和空間探索實驗中較少的穿越平臺的情況表明學習和記憶能力的缺陷。訓練5 d后,目標象限中的平臺被移除后,假手術組在目標象限中花費的時間最長,而MCAO組最短。 桔梗皂苷D治療組花費在目標象限的時間顯著高于MCAO組。此外,假手術組大鼠穿越隱蔽平臺的次數(shù)最多,而MCAO組大鼠穿越隱蔽平臺的次數(shù)最少。 桔梗皂苷D組的平臺穿越次數(shù)明顯高于MCAO組,且以高劑量組效果最為明顯(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 桔梗皂苷D對MCAO大鼠模型水迷宮表現(xiàn)的影響

表3 桔梗皂苷D對急性腦梗死大鼠水迷宮學習認知功能影響 n=7,

2.4 桔梗皂苷D治療上調(diào)了海馬中軸突蛋白的表達 對軸突蛋白MAP2進行免疫熒光染色,結(jié)果顯示,與假手術組比較,MCAO海馬MAP2染色強度降低。與MCAO模型組比較,桔梗皂苷D低劑量組和高劑量組的MAP2表達明顯增加。見圖3。

圖3 桔梗皂苷D對MCAO大鼠模型海馬MAP2表達的影響(標尺=100 μm)

2.5 桔梗皂苷D治療調(diào)節(jié)海馬鐵死亡相關蛋白的水平 通過蛋白質(zhì)印跡法測定鐵死亡相關蛋白,即GPX4、FTH1、和TfR1的表達水平。結(jié)果顯示,與假手術組比較,MCAO組的GPX4和FTH1水平顯著降低(P<0.001),桔梗皂苷D治療逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。與假手術組比較,MCAO組的TFR1水平顯著升高(P<0.001),桔梗皂苷D低劑量組和高劑量組的TfR1表達明顯降低。與此一致的是,MCAO組海馬中鐵含量顯著增加,而桔梗皂苷D治療逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。見圖4,表4。

圖4 桔梗皂苷D對MCAO大鼠模型鐵死亡相關通路蛋白表達的影響

表4 桔梗皂苷D對急性腦梗死大鼠鐵死亡相關通路蛋白的定量分析 n=8,

3 討論

卒中是全球殘疾和發(fā)病的主要原因,全球有超過8 000萬人患有卒中,卒中是204個國家和地區(qū)≥50歲成年人殘疾調(diào)整生命年的首要原因[8]。與此同時,由于人口增長和老齡化,中國年齡≥40歲的成年人卒中患病率亦一直增加[9]。腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損和認知障礙是卒中后認知障礙的一個常見但被忽視的后果。研究表明,超過一半的卒中患者有認知障礙[10]。且其治療方案獲得的治療效果有限。因此,進一步明確卒中后病理生理的發(fā)展機制并開發(fā)更有效的治療方案是非常必要的。

在缺血/再灌注開始后,顯著的氧化應激和炎癥被顯著觸發(fā)[7],鐵死亡是一種最近被認識到的依賴于鐵和活性氧簇(ROS)的程序性細胞死亡形式,并被認為參與了再灌注損傷。因此,鐵死亡為理解和治療許多疾病提供了新的途徑[11]。鐵死亡在缺血性損傷中的研究已經(jīng)在許多器官中進行,包括心臟、腸和肝臟[12-14]。最近的研究揭示了鐵死亡和腦缺血的密切聯(lián)系,鐵死亡抑制劑成功地減少了腦的缺血性損傷[15]。抑制鐵死亡可能成為相關缺血性疾病的有效治療策略和起效方式。

缺血性卒中發(fā)生時,由于向大腦供應充足血液的動脈阻塞,氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡會激活過量的氧化應激、引起線粒體損傷并最終導致細胞死亡[16]。鐵是平衡大腦組織能量代謝的一把雙刃劍:一方面,鐵對于正常大腦功能催化產(chǎn)生大量ATP是不可或缺的;另一方面,大腦極易受到鐵依賴的氧化應激的影響[17]。鐵積累被廣泛的觀察到發(fā)生于缺血性卒中的臨床病例和動物模型中的神經(jīng)元上[18]。另一方面,鐵螯合劑被發(fā)現(xiàn)在腦出血性卒中的過程中科研改善腦水腫、減少神經(jīng)元死亡并阻止腦萎縮[19]。因此,針對鐵死亡靶點的保護策略,可潛在用于治療缺血性卒中患者。

作為一種可逆轉(zhuǎn)多種氧化應激損傷的單體物質(zhì),桔梗皂苷D已被發(fā)現(xiàn)在氧化應激損傷中發(fā)揮作用[12,20]。在心肌細胞缺氧/復氧模型中。結(jié)果表明,桔梗皂苷D被發(fā)現(xiàn)可通過誘導Akt/Nrf2/HO-1通路的激活發(fā)揮其保護作用[11]。此外,在高糖刺激的糖尿病腎病細胞模型中,GPX4表達下調(diào),桔梗皂苷D可通過調(diào)節(jié)GPX4的表達抑制了鐵死亡[21]。桔梗皂苷D可通過增加海馬中的突觸發(fā)生增強了小鼠的認知功能[22]。這些結(jié)果積極提示桔梗皂苷D可通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關通路發(fā)揮對卒中模型的保護作用。因此,我們在MCAO大鼠卒中模型中觀察了桔梗皂苷D對卒中后神經(jīng)癥狀及認知功能損傷的作用及鐵死亡相關蛋白水平的影響。正如預期的那樣,桔梗皂苷D顯著改善了卒中大鼠的神經(jīng)癥狀和認知功能,并通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關蛋白分子的表達參與了到了鐵死亡過程的調(diào)節(jié)中。桔梗皂苷D顯著逆轉(zhuǎn)了損傷導致的被抑制的FTH1和GPX4的表達,并降低了海馬中的鐵含量,這將有效阻斷鐵死亡進展。桔梗皂苷D治療可能部分地通過增加海緩解鐵死亡發(fā)生來促進相關癥狀的恢復。

綜上,本研究表明,桔梗皂苷D的治療減輕了大鼠缺血性卒中后的神經(jīng)和認知功能障礙,起到了明顯的神經(jīng)保護作用。我們的結(jié)果還證實桔梗皂苷D的作用是通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關途徑的表達實現(xiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)抗腦缺血和腦缺血/再灌注損傷的藥物提供了新的視角。