周洋 美麗巴努·玉素甫 陳婷妍

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種復(fù)雜的眼部疾病,是老年人群不可避免的眼部問題。ARMD多發(fā)于>50歲的老年人群,是導(dǎo)致老年人失明的重要原因之一。目前ARMD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,但是已有研究表明,ARMD發(fā)病與氧化應(yīng)激、炎癥、自噬、凋亡等相關(guān)[1-3]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)位于脈絡(luò)膜與視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層之間,容易受到氧化應(yīng)激的影響,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬再循環(huán)和降解減少,進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[4,5]。因此,改善RPE的病理狀態(tài)對(duì)于ARMD的治療至關(guān)重要。谷氨酰胺酶1(glutaminase1,GLS1)是谷氨酰胺-谷氨酸循環(huán)途徑中的限速酶,可通過分解谷氨酰胺而提供細(xì)胞快速增殖所需的重要能量[6]。Johmura等[7]研究表明,GLS1是抑制衰老的重要靶點(diǎn),GLS1分解谷氨酰胺產(chǎn)生的氨中和了衰老細(xì)胞中的酸中毒,使得衰老細(xì)胞死亡趨于正?；?。Liu等[8]研究表明,GLS1可調(diào)控腸癌的自噬。GLS1對(duì)ARMD的影響尚無探究,本文通過H2O2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19的氧化應(yīng)激,探究了GLS1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激、自噬和凋亡的影響,旨在為ARMD的臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù));過氧化氫H2O2(購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司);Lipofectamine 2000試劑盒(購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司);CCK-8試劑盒(購(gòu)自沈陽萬類生物科技有限公司);細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自沈陽萬類生物科技有限公司);活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(購(gòu)自購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Nrf2、HO-1、LC3-Ⅱ、p62、GAPDH、山羊抗兔IgG(購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)與H2O2誘導(dǎo)

1.2.1 取液氮保存的ARPE-19細(xì)胞,于37℃水浴鍋中迅速解凍,然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞沉淀,用10 ml的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中,細(xì)胞培養(yǎng)皿中置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,細(xì)胞隔天更換培養(yǎng)基,細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 H2O2誘導(dǎo)濃度篩選:使用 0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2分別誘導(dǎo) ARPE-19 細(xì)胞48 h,根據(jù)CCK-8法檢測(cè)各組 ARPE-19 細(xì)胞活力,選擇ARPE-19 細(xì)胞活力顯著下降為50%時(shí)的H2O2濃度作為本研究的H2O2誘導(dǎo)濃度。

1.3 分組 ARPE-19 細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+ Vector組、H2O2+ GLS1組,對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理,H2O2組使用200 μmol/L H2O2誘導(dǎo) ARPE-19 細(xì)胞48 h,H2O2+ Vector組ARPE-19 細(xì)胞轉(zhuǎn)染GLS1空白載體后使用300 μmol/L H2O2誘導(dǎo) 48 h,H2O2+ GLS1組ARPE-19 細(xì)胞轉(zhuǎn)染GLS1過表達(dá)載體后使用300 μmol/L H2O2誘導(dǎo)48 h。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù) Lipofectamine 2000試劑盒說明書,轉(zhuǎn)染前1 d將2×105個(gè)ARPE-19細(xì)胞接種至6孔板中,轉(zhuǎn)染前將6孔板中的培養(yǎng)基更換為800 μl無血清的DMEM培養(yǎng)基,5 μl GLS1空白載體或者GLS1過表達(dá)載體用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至125 μl,5 μl Lipofectamine 2000試劑稀釋至125 μl,然后將上述稀釋液混勻,室溫放置15 min,然后將混合液加入到6孔板中,37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后將6孔板中的培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后所得細(xì)胞進(jìn)行在進(jìn)行H2O2誘導(dǎo)。

1.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19 細(xì)胞稀釋至5×104個(gè)/ml,96孔板每孔接種100 μl,細(xì)胞完全貼壁后,將孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基更換為100 μl含0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2細(xì)胞培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK8溶液,37℃條件下培養(yǎng)2 h,然后使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值(OD值),細(xì)胞活力(%)=(OD加藥-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)×100%,細(xì)胞不加H2O2處理為對(duì)照組,空白孔不接種細(xì)胞,僅有100 μl培養(yǎng)基。

1.6 比色法測(cè)定 SOD、GSH和MDA濃度 消化并收集對(duì)照組、H2O2組、H2O2+ Vector組、H2O2+ GLS1組ARPE-19 細(xì)胞1×105個(gè)細(xì)胞,每組細(xì)胞用500 μl PBS重懸,細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲震蕩破碎,破碎液稀釋至5 ml,根據(jù) SOD、GSH、MDA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中 SOD、GSH和MDA含量。

1.7 透射電鏡觀察自噬小體 將各組ARPE-19細(xì)胞去除培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次后,用2.5%戊二醛固定過夜,然后用1%鋨酸固定2 h,依次用50%、70%、90%、100%的丙酮脫水,包埋,染色后,在透射電鏡下觀察各組細(xì)胞自噬小體的數(shù)量。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組ARPE-19細(xì)胞PBS漂洗細(xì)胞2次,并收集5×105個(gè)細(xì)胞,每組細(xì)胞加入500 μl Binding buffer重懸細(xì)胞,分別加入5 μl Annexin V-FITC混勻后,加入10 μl Propidium Iodide混勻,室溫避光反應(yīng)15 min,Annexin V-FITC熒光信號(hào)通過FL1通道檢測(cè),Propidium Iodide熒光信號(hào)通過FL2通道檢測(cè),每次檢測(cè)需要同時(shí)檢測(cè)Annexin V-FITC單陽性管、Propidium Iodide(PI)單陽性管,用于調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償數(shù)值。

1.9 Western blot 使用RIPA蛋白提取試劑盒提取對(duì)照組、H2O2組、H2O2+ Vector組、H2O2+ GLS1組ARPE-19細(xì)胞的總蛋白,取10 μg蛋白在80 V條件下進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳120 min,使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜90 min后,PVDF膜封閉1 h,然后將PVDF膜與GLS1、Nrf2、HO-1、LC3-Ⅱ、p62、GAPDH抗體4℃孵育過夜,TBST清洗3次后,用1∶2 000比例稀釋的山羊抗體IgG室溫孵育1 h,洗膜,使用ECL試劑盒顯影,拍照,使用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力的影響 ARPE-19細(xì)胞分別用0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2處理24 h后,細(xì)胞活力分別為(100.00±0.00)%、(93.28±2.70)%、(75.47±4.77)%、(51.33±2.89)%、(36.32±5.71)%、(23.56±3.93)%、(13.70±3.30)%,200、300、400、500、600 μmol/L H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活力均顯著下降(P<0.05),300 μmol/L H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活力為(51.33±2.89),選擇300 μmol/L H2O2濃度最為ARPE-19細(xì)胞的誘導(dǎo)濃度。見表1。

表1 不同濃度H2O2對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力的影響 n=5,%,

2.2 GLS1抑制H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激 與對(duì)照組比較,H2O2組和H2O2+ Vector組ARPE-19細(xì)胞中SOD、GSH濃度含量顯著下降(P<0.001),MDA濃度顯著增加(P<0.001),并且H2O2組和H2O2+ Vector組上述指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。與H2O2+ Vector組比較,H2O2+ GLS1組ARPE-19細(xì)胞中SOD、GSH濃度含量顯著增加(P<0.001),MDA濃度顯著下降(P<0.001),說明GLS1可抑制H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞SOD、GSH和MDA的變化,即抑制H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激。見表2。

表2 4組ARPE-19細(xì)胞SOD、GSH、MDA濃度比較 n=5,

2.3 GLS1抑制H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞自噬 透射電鏡觀察結(jié)果顯示,H2O2組ARPE-19細(xì)胞接受H2O2誘導(dǎo)后其自噬小體數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增加(P<0.001),P62表達(dá)顯著降低(P<0.05),H2O2+GLS1組ARPE-19細(xì)胞自噬小體顯著低于H2O2+Vector組(P<0.05),LC3-Ⅱ表達(dá)顯著降低(P<0.05),P62表達(dá)顯著增加(P<0.05),說明GLS1抑制H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞自噬水平。見表3、4,圖1、2。

圖1 透射電鏡下觀察各組細(xì)胞自噬小體的數(shù)目(×100 000)

表3 4組ARPE-19細(xì)胞自噬小體數(shù)比較 n=5,個(gè),

表4 4組ARPE-19細(xì)胞LC3-Ⅱ和P62表達(dá)比較n=5,

2.4 GLS1抑制H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,H2O2組ARPE-19細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05),說明H2O2可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞凋亡。H2O2+GLS1組ARPE-19細(xì)胞凋亡率顯著低于H2O2+Vector組(P<0.05),說明過表達(dá)GLS1可抑制H2O2所引起的細(xì)胞凋亡。見圖3,表5。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平

表5 4組ARPE-19細(xì)胞凋亡率比較 n=5,%,

2.5 GLS1激活Nrf2/HO-1信號(hào)軸 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,H2O2組ARPE-19細(xì)胞中Nrf2和HO-1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),H2O2組和H2O2+ Vector組Nrf2和HO-1表達(dá)無顯著差異,與H2O2+ Vector組比較,H2O2+GLS1組ARPE-19細(xì)胞Nrf2和HO-1表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),即Nrf2/HO-1信號(hào)通路顯著激活。見圖4,表6。

圖4 Western blot檢測(cè)4組ARPE-19細(xì)胞Nrf2和HO-1表達(dá)

表6 4組ARPE-19細(xì)胞Nrf2和HO-1表達(dá)比較 n=5,

3 討論

ARMD是世界性失明的主要原因之一,隨著年齡的增加,其發(fā)病率逐漸增加。目前ARMD的治療方式僅能緩解,但是并沒有治愈的有效手段。雖然ARMD發(fā)生發(fā)展的機(jī)制還不明確,但是有研究表明ARMD的發(fā)生與炎癥和氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[9,10]。在病理研究指出,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對(duì)于正常視網(wǎng)膜健康和功能是至關(guān)重要的,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對(duì)于損害和功能障礙高度敏感,因此是ARMD的首先起病理變化的位置[11,12]。氧化應(yīng)激是引發(fā)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能損傷的病理原因,氧化應(yīng)激引起的氮自由基和高活性分子氧自由基的激增導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡[13],因此,有研究指出,抑制氧化應(yīng)激是緩解視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的重要方法。由于黃斑僅存在于靈長(zhǎng)類的動(dòng)物,因此體內(nèi)ARMD的研究存在一定的困難,所以使用保持原代細(xì)胞的功能和形態(tài)學(xué)特征的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可作為ARMD研究的模型?；瘜W(xué)氧化劑、高氧環(huán)境和給予光感受器外節(jié)膜盤或脂褐質(zhì)均可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激,其中,H2O2是一種重要的活性氧,H2O2可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生Fenton 反應(yīng),使細(xì)胞內(nèi)單態(tài)氧、羥自由基等不斷堆積,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的損傷,H2O2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19可作為ARMD研究的細(xì)胞模型[14,15]。本研究使用0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞,300 μmol/L H2O2對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力的抑制率約為50%,因此,本研究選擇300 μmol/L H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的氧化應(yīng)激及損傷。

GLS1是谷氨酰胺-谷氨酸循環(huán)途徑中的限速酶,可為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供能量。有研究指出,GLS1可緩解酸中毒進(jìn)而減緩細(xì)胞的衰老,可作為改善衰老的重要靶點(diǎn)[6]。研究表明GLS1可調(diào)控腫瘤的自噬、凋亡以及氧化應(yīng)激[16],但是GLS1對(duì)ARMD的影響報(bào)道較少。本研究在ARPE-19細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GLS1后在以300 μmol/L H2O2誘導(dǎo),并且發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GLS1后,ARPE-19細(xì)胞中自噬小體數(shù)顯著減少,說明細(xì)胞自噬顯著減少;SOD、GSH濃度含量顯著增加,MDA濃度顯著下降,說明細(xì)胞氧化應(yīng)激被顯著抑制;細(xì)胞凋亡顯著減少。研究表明,細(xì)胞凋亡和自噬與氧自由基密切相關(guān),氧自由基可引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸結(jié)構(gòu)和功能,促使細(xì)胞凋亡[17]。說明GLS1可緩解氧化應(yīng)激引起的凋亡和自噬。亦有研究指出,細(xì)胞內(nèi)氧自由基堆積,可引起MDA的大量生成,SOD 作為細(xì)胞內(nèi)最重要的氧自由基清除劑,GSH是一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的重要過氧化物分解酶,二者均可抑制細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激[18,19],說明GLS1可通過影響細(xì)胞內(nèi)的SOD、GSH和MDA的表達(dá)而緩解細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

Nrf2/HO-1信號(hào)通路是與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的信號(hào)通路,在氧化應(yīng)激的條件下,激活的Nrf2可與 Keap-1解離,進(jìn)而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),與核內(nèi)抗氧化劑反應(yīng)元件相互作用,進(jìn)而調(diào)控HO-1,催化血紅蛋白降解,形成內(nèi)源性抗氧化保護(hù)系統(tǒng),減弱氧化應(yīng)激,同時(shí)抑制促凋亡蛋白酶[20]。并研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染GLS1后ARPE-19細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1表達(dá)顯著上調(diào),說明GLS1通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路而抑制氧化應(yīng)激引起的損傷。

綜上所述,GLS1可緩解H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激、自噬以及凋亡,其機(jī)制可能為激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路,但GLS1能否作為ARMD治療的新靶點(diǎn)還需進(jìn)一步探究。