岳楊 鄭露 雍丹 許海

鼻咽癌(NPC)是最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一,它具有非常獨(dú)特的分布模式,在東南亞更為普遍[1]。NPC患者的常規(guī)治療方法是化療和放療。雖然治療顯示出良好的療效,但高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率成為治療失敗的主要原因,且預(yù)后較差[2]。因此,制定有效的治療策略和尋找新的預(yù)后分子標(biāo)志物對(duì)于提高NPC患者的生存率是必要的。研究表明,CircRNA可作為癌基因或腫瘤抑制基因,因此,CircRNA的失調(diào)被確定參與癌癥發(fā)展的過(guò)程[3,4]。研究發(fā)現(xiàn),敲低CircTRAF3可抑制NPC的發(fā)生,是NPC治療的潛在治療靶點(diǎn)[5]。已有文獻(xiàn)表明CircRNA-miRNA-mRNA信號(hào)軸參與NPC的發(fā)展過(guò)程[6]。本研究通過(guò)TargetScan網(wǎng)站以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)CircTRAF3與miR-136-5p,miR-136-5p與NMT1存在結(jié)合位點(diǎn),且有研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-136-5p可以促進(jìn)NPC細(xì)胞的惡性增殖[7]。而上調(diào)NMT1可以促進(jìn)NPC細(xì)胞的遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)展[8]。本研究探究CircTRAF3對(duì)NPC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要材料 BALB/c小鼠體重(20±2)g[許可證號(hào):SCXK(粵)2021-0059]購(gòu)自廣州銳格生物科技有限公司;人鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HONE-1、CNE-2、HNE-1、鼻咽上皮細(xì)胞系NP69購(gòu)自上海烜雅生物科技有限公司;MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自浙江麥飛生物科技有限公司;si-NC、si-CircTRAF3、inhibitor NC、miR-136-5p inhibitor購(gòu)自上海生工;NMT1和GAPDH抗體購(gòu)自Abcam。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將購(gòu)買(mǎi)的5-8F、HONE-1、CNE-2、HNE-1細(xì)胞和NP69細(xì)胞均接種于RPMI-1640培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%胎牛血清)在37℃、5%CO2下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右,根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒將si-NC、si-CircTRAF3、si-CircTRAF3+inhibitor NC、si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor分別轉(zhuǎn)染至HONE-1細(xì)胞,記為si-NC組、si-CircTRAF3組、si-CircTRAF3+inhibitor NC組、si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor 組,另取未做任何處理的HONE-1細(xì)胞記為NC組。轉(zhuǎn)染48 h后,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)CircTRAF3、miR-136-5p、NMT1關(guān)系 構(gòu)建TRAF3野生型質(zhì)粒(TRAF3-WT)和突變型質(zhì)粒(TRAF3-MUT),將TRAF3-WT和TRAF3-MUT分別與mimic NC或miR-136-5p mimic共轉(zhuǎn)染于HONE-1細(xì)胞分別記為miR-NC+WT-TRAF3組、miR-136-5p mimic+WT-TRAF3組、miR-NC+MUT-TRAF3組、miR-136-5p mimic+MUT-TRAF3組;構(gòu)建NMT1野生型質(zhì)粒(NMT1-WT)和突變型質(zhì)粒(NMT1-MUT),將NMT1-WT和NMT1-MUT分別與mimic NC或miR-136-5p mimic共轉(zhuǎn)染于HONE-1細(xì)胞,分別記為miR-NC+WT-NMT1組、miR-136-5p mimic+WT-NMT1組、miR-NC+MUT-NMT1組、miR-136-5p mimic+MUT-NMT1組,48 h后評(píng)估HONE-1細(xì)胞的熒光素酶活性變化。

1.4 Western blot檢測(cè)NMT1蛋白表達(dá) 使用0.1 ml RIPA裂解緩沖液裂解轉(zhuǎn)染成功后的HONE-1細(xì)胞。使用二辛可寧酸測(cè)定試劑盒定量蛋白質(zhì),通過(guò)10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)(15 μg/泳道),然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%牛血清白蛋白在室溫下封閉膜2 h,然后在4℃下與一抗孵育過(guò)夜,一抗是:NMT1(1∶2 000)、GAPDH( 1∶1 000),加入二抗常溫下繼續(xù)孵育1項(xiàng)目h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒使蛋白質(zhì)條帶可視化,凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶,使用Image J軟件定量蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)CircTRAF3、miR-136-5p表達(dá) 根據(jù)試劑盒提取細(xì)胞的總RNA,取OD260/280在2.0左右的樣本根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,隨后,將20 μl PCR混合物(10 μl 2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR,上下游引物各0.8 μl,2 μl cDNA和6.4 μl ddH2O)置于qRT-PCR儀,使用以下條件:在95℃下初始變性30 s,在95℃變性5 s,以及55℃退火延伸 30 s(共45個(gè)循環(huán))進(jìn)行擴(kuò)增。使用 2-ΔΔCT分析數(shù)據(jù),以GAPDH、U6作為內(nèi)部對(duì)照。見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.6 MTT法檢測(cè)HONE-1細(xì)胞增殖 將HONE-1細(xì)胞接種到96孔板中,密度為1×103個(gè)/孔,在37℃下孵育一夜,之后,用移液槍向每孔中加入10 μl濃度為5 mg/ml的MTT,繼續(xù)孵育4 h,然后向每孔中加入100 μl DMSO溶解沉淀物,在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量吸光度OD值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HONE-1細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染48 h后的HONE-1細(xì)胞,用胰酶消化后,置于離心機(jī)中1 000 r/min離心5 min,隨后去除上清液,用PBS洗滌后,與含有膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸酯熒光素和碘化丙啶的溶液孵育,室溫下孵育15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光,分析細(xì)胞凋亡率。

1.8 Transwell檢測(cè)HONE-1細(xì)胞侵襲、遷移能力 將200 μl HONE-1細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種在上室中。覆蓋有基質(zhì)膠的上室用于對(duì)細(xì)胞侵襲情況的測(cè)定,而普通上室用于遷移測(cè)定。下腔室充滿(mǎn)含有10%FBS的高葡萄糖RPMI-1640培養(yǎng)基。隨后,將細(xì)胞在37℃下孵育48 h。去除上室的細(xì)胞,并將遷移或侵襲的HONE-1細(xì)胞固定在10%中性緩沖液甲醛中,室溫下放置15 min,并于室溫下用結(jié)晶紫(5 g/L)染色20 min。在光學(xué)顯微鏡下每組隨機(jī)選擇4個(gè)視野計(jì)數(shù)HONE-1細(xì)胞數(shù)量。

1.9 荷瘤小鼠模型驗(yàn)證CircTRAF3對(duì)HONE-1移植瘤的影響 將HONE-1細(xì)胞懸浮在0.2 ml PBS中皮下注射到每只BALB/c小鼠的背部(4×106個(gè)/只),每周兩次用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)。計(jì)算腫瘤體積:體積(mm3)=長(zhǎng)度×寬度2/2,當(dāng)腫瘤達(dá)到約80 m3時(shí),將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組:NC組(注射等量0.9%氯化鈉溶液)、si-NC組(尾靜脈注射si-NC)、si-TRAF3組(尾靜脈注射si-TRAF3)、siTRAF3+anti-NC組(尾靜脈注射si-TRAF3和anti-NC)、si-TRAF3+anti-miR-136-5p組(尾靜脈注射si-TRAF3和anti-miR-136-5p),每組6只。注射35 d后,麻醉處死小鼠取出腫瘤組織稱(chēng)重,隨后固定在4%多聚甲醛,將腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后,用蘇木精-伊紅染色,并于顯微鏡下觀察腫瘤形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 CircTRAF3靶向調(diào)控miR-136-5p/NMT1軸 TargetScan網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)CircTRAF3與miR-136-5p,miR-136-5p與NMT1存在結(jié)合位點(diǎn)。與miR-NC+WT-TRAF3組比較,miR-136-5p mimic+WT-TRAF3組HONE-1細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而miR-136-5p mimic+MUT-TRAF3組HONE-1細(xì)胞的熒光素酶活性較miR-NC+MUT-TRAF3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與miR-NC+WT-NMT1組比較,miR-136-5p mimic+WT-NMT1組HONE-1細(xì)胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05),miR-136-5p mimic+MUT-NMT1組較miR-NC+MUT-NMT1組HONE-1細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)圖1,表2、3。

圖1 TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)CircTRAF3與miR-136-5p、miR-136-5p與NMT1的結(jié)合位點(diǎn)

表2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證CircTRAF3與miR-136-5p的靶向關(guān)系 n=6,

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-136-5p與NMT1的靶向關(guān)系 n=6,

2.2 CircTRAF3、miR-136-5p、NMT1在細(xì)胞中的表達(dá) 與NP69細(xì)胞相比,HONE-1、CNE-2、HNE-1、5-8F中CircTRAF3、NMT1水平均顯著上調(diào)(P<0.05),miR-136-5p顯著下調(diào)(P<0.05),且在HONE-1細(xì)胞CircTRAF3、NMT1水平最高,miR-136-5p表達(dá)水平最低(P<0.05),因此,以HONE-1細(xì)胞為研究對(duì)象。見(jiàn)圖2,表4。

圖2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中NMT1蛋白水平

表4 CircTRAF3、miR-136-5p、NMT1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)n=6,

2.3 CircTRAF3、miR-136-5p、NMT1蛋白在HONE-1細(xì)胞中的表達(dá) 與NC組、si-NC組相比,si-CircTRAF3組CircTRAF3、NMT1水平顯著下調(diào)(P<0.05),miR-136-5p表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);與si-CircTRAF3組、si-CircTRAF3+inhibitor NC組相比較,si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor組NMT1水平顯著上升(P<0.05),miR-136-5p表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖3,表5。

圖3 Western blot檢測(cè)HONE-1細(xì)胞NMT1蛋白表達(dá);A NC組;B si-NC組;C si-CircTRAF3組;D si-CircTRAF3+inhibitor NC組;E si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor組

表5 CircTRAF3、miR-136-5p、NMT1蛋白在HONE-1細(xì)胞中的表達(dá) n=6,

表6 沉默CircTRAF3或下調(diào)miR-136-5p對(duì)HONE-1細(xì)胞OD490值的影響 n=6,

表7 沉默CircTRAF3或下調(diào)miR-136-5p 對(duì)HONE-1細(xì)胞凋亡率的影響 n=6,%,

2.4 沉默CircTRAF3或下調(diào)miR-136-5p 對(duì)HONE-1細(xì)胞增殖的影響 與NC組、si-NC組相比,si-CircTRAF3組HONE-1細(xì)胞OD490值顯著減小(P<0.05);與si-CircTRAF3組、si-CircTRAF3+inhibitor NC組相比較,si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor組OD490值顯著增大(P<0.05)。見(jiàn)表6。

2.5 沉默CircTRAF3或下調(diào)miR-136-5p 對(duì)HONE-1細(xì)胞凋亡的影響 si-CircTRAF3組HONE-1細(xì)胞凋亡率較NC組、si-NC組顯著上升(P<0.05);si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor組HONE-1細(xì)胞凋亡率較si-CircTRAF3組、si-CircTRAF3+inhibitor NC組顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖4,表7。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HONE-1細(xì)胞凋亡

2.6 沉默CircTRAF3或下調(diào)miR-136-5p對(duì)HONE-1細(xì)胞侵襲、遷移的影響 si-CircTRAF3組較NC組、si-NC組HONE-1細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05);si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor組較si-CircTRAF3組、si-CircTRAF3+inhibitor NC組HONE-1細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P<0.05)。見(jiàn)圖5、6,表8。

圖5 Transwell檢測(cè)HONE-1細(xì)胞遷移情況(結(jié)晶紫×400)

圖6 Transwell檢測(cè)HONE-1細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫×400)

表8 沉默CircTRAF3或下調(diào)miR-136-5p 對(duì)HONE-1細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)量的影響n(yōu)=6,個(gè),

2.7 沉默CircTRAF3或miR-136-5p 對(duì)移植瘤的影響 與NC組、si-NC組相比,si-TRAF3組瘤重顯著減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與si-TRAF3組、si-TRAF3+anti-NC組相比,si-TRAF3+anti-miR-136-5p 組瘤重顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NC組、si-NC組腫瘤細(xì)胞排列密集,邊界清晰;si-TRAF3組、si-TRAF3+anti-NC組細(xì)胞排列疏松,胞核固縮,細(xì)胞碎片增多;si-TRAF3+anti-miR-136-5p 組與NC組結(jié)果相似。見(jiàn)表9,圖7、8。

圖7 5組小鼠腫瘤圖;A NC組;B si-NC組;C si-TRAF3組;D si-TRAF3+anti-NC組;E si-TRAF3+anti-miR-136-5p組

圖8 沉默CircTRAF3或miR-136-5p 對(duì)荷瘤小鼠移植瘤組織形態(tài)的影響(蘇木精伊紅染色×200)

表9 沉默CircTRAF3或miR-136-5p 對(duì)腫瘤重量的影響 n=6,mg,

3 討論

NPC是一種源自鼻咽上皮的罕見(jiàn)腫瘤。NPC是一種常見(jiàn)的癌癥,國(guó)內(nèi)發(fā)病率呈南北遞增趨勢(shì)。一般來(lái)說(shuō),NPC的發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因、多途徑的過(guò)程[9]。人類(lèi)皰疹病毒和化學(xué)誘導(dǎo)劑被認(rèn)為是NPC的主要危險(xiǎn)因素[10]。近年來(lái),隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,環(huán)境的污染越來(lái)越嚴(yán)重,空氣中的有毒顆?？赡苁荖PC的另一個(gè)危險(xiǎn)因素[11]。且大多NPC患者在首次就診時(shí)被診斷為晚期癌癥,轉(zhuǎn)移趨勢(shì)強(qiáng)烈,預(yù)后不良,這是NPC治療失敗的主要原因[12]。因此,尋找早期臨床標(biāo)志物對(duì)NPC的治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),CircRNA與NPC的腫瘤發(fā)生和化學(xué)耐藥性有關(guān)[13]。Fang等[5]發(fā)現(xiàn)CircTRAF3的增加與NPC患者的轉(zhuǎn)移和生存有關(guān)。敲低CircTRAF3可抑制NPC細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲,誘導(dǎo)體外和體內(nèi)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與Fang等[5]研究一致,研究發(fā)現(xiàn),在NPC細(xì)胞中CircTRAF3上調(diào),且在HONE-1細(xì)胞中差異最顯著,因此選擇HONE-1細(xì)胞為研究對(duì)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC組、si-NC組相比,si-CircTRAF3組CircTRAF3、OD490值、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著下調(diào),HONE-1細(xì)胞凋亡率顯著升高,表明沉默CircTRAF3可能抑制NPC的進(jìn)展。

通過(guò)TargetScan網(wǎng)站以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)CircTRAF3與miR-136-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-136-5p是癌癥研究的常見(jiàn)基因,上調(diào)miR-136-5p可以抑制胃癌的生長(zhǎng)[14]。而下調(diào)miR-136-5p可以促進(jìn)腎細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。而Pei等[7]發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-136-5p可以抑制NPC細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn),miR-136-5p在HONE-1細(xì)胞低表達(dá),與NC組、si-NC組相比,si-CircTRAF3組miR-136-5p表達(dá)量顯著增加,除此之外,miR-136-5p沉默逆轉(zhuǎn)了CircTRAF3低表達(dá)對(duì)HONE-1細(xì)胞的影響,表明CircTRAF3可能通過(guò)調(diào)控miR-136-5p表達(dá)來(lái)抑制NPC發(fā)展。

通過(guò)TargetScan網(wǎng)站以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-136-5p負(fù)向調(diào)控NMT1。NMT1在癌癥中的研究已經(jīng)非常普遍,NMT1是人非小細(xì)胞肺癌中的潛在腫瘤治療靶點(diǎn)[16]。阻斷NMT1酶活性可以抑制肝癌進(jìn)展[17]。而近期發(fā)現(xiàn),NMT1促進(jìn)了NPC細(xì)胞的增殖和輻射抵抗力,上調(diào)NMT1表達(dá)可以誘導(dǎo)NPC的發(fā)生[8]。本研究結(jié)果顯示,在HONE-1細(xì)胞中NMT1水平顯著上調(diào),且沉默CircTRAF3降低了HONE-1細(xì)胞中NMT1蛋白水平,而下調(diào)miR-136-5p則使NMT1蛋白水平升高,證實(shí)沉默CircTRAF3可能通過(guò)上調(diào)miR-136-5p來(lái)抑制NMT1表達(dá),進(jìn)而抑制HONE-1細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。通過(guò)荷瘤小鼠模型驗(yàn)證CircTRAF3對(duì)HONE-1移植瘤的影響,我們發(fā)現(xiàn),NC組、si-NC組小鼠腫瘤細(xì)胞排列密集,邊界清晰;沉默CircTRAF3小鼠腫瘤重量降低,腫瘤細(xì)胞排列疏松,胞核固縮,細(xì)胞碎片增多,而沉默miR-136-5p腫瘤重量增加。進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)CircTRAF3可能通過(guò)上調(diào)miR-136-5p來(lái)抑制NMT1的表達(dá),進(jìn)而抑制NPC的發(fā)生。

綜上所述,沉默CircTRAF3可能通過(guò)上調(diào)miR-136-5p來(lái)下調(diào)NMT1表達(dá),進(jìn)而抑制HONE-1細(xì)胞的惡性行為。