吳卓璇 李 蒙 陳金波 胡 楓 王向東 覃 莉

武漢市第一醫(yī)院皮膚科,湖北武漢,430022

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是以濕疹樣皮損為臨床表現(xiàn),伴有劇烈瘙癢的慢性炎癥性皮膚病。大多數(shù)AD患者在嬰幼兒時(shí)期發(fā)病,并持續(xù)到青春期甚至成年期[1-3]。早期發(fā)病是影響AD過敏性進(jìn)程和發(fā)展為中重度AD的高危因素。近來研究表明,嬰兒腸道早期菌群紊亂與機(jī)體特應(yīng)性、IgE相關(guān)濕疹和哮喘發(fā)展之間具有關(guān)聯(lián)性[4],推測(cè)腸道菌群可能在AD的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究將探討AD嬰兒和健康嬰兒腸道菌群在組成以及屬、種方面的差異性,對(duì)今后AD治療提供指導(dǎo)意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 病例來源 收集2019年7月至2020年12月到武漢市第一醫(yī)院皮膚科門診就診的1～12個(gè)月齡AD患兒。病例納入標(biāo)準(zhǔn)①符合Hanifin和Rajka診斷AD標(biāo)準(zhǔn)[5,6];②1～12個(gè)月齡足月產(chǎn)嬰兒;③無其他皮膚疾病;④無其他系統(tǒng)性疾病(除外過敏性結(jié)膜炎、過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性胃腸炎);⑤無精神疾病、殘疾、智力障礙;⑥近1個(gè)月未使用抗生素;⑦未服用含益生菌等微生物制劑。對(duì)照組來自武漢市1～12個(gè)月齡,無皮膚及其他系統(tǒng)疾病,未服用抗生素和益生菌的健康足月產(chǎn)嬰兒。

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的AD組患兒,男21例,女12例,平均年齡(7.55±3.01)個(gè)月;對(duì)照組,男17例;女13例,平均年齡(8.06±3.25)個(gè)月。2組入選者年齡、性別、分娩方式、喂養(yǎng)方式、家族史、生活環(huán)境均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究獲得武漢市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),研究對(duì)象的家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 樣本采集 取受試者糞便標(biāo)本(>1 g)儲(chǔ)存于-80℃冰箱。干冰運(yùn)至武漢百易匯能生物科技有限公司進(jìn)行檢測(cè)與測(cè)序分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 糞便樣本提取總DNA后采用Nanodrop對(duì)DNA進(jìn)行定量,并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。采用兩步PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增區(qū)域是V1-V9,引物是27F: AGRGTTYGATYMTGGCTCAG和1492R:RGYTACCTTGTTACGACTT,同時(shí)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。應(yīng)用武漢希望組生物科技有限公司使用PacBio Sequel測(cè)序儀對(duì)研究對(duì)象糞便細(xì)菌的16SrRNA基因V1-V9區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序及分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 α多樣性主要分析菌群的豐富度和多樣性,其中Chao1和Observed species指數(shù)表示豐富度,Shannon和Simpson指數(shù)表示多樣性,Faith’s PD 指數(shù)表示基于進(jìn)化的多樣性,Pielou’s evenness 指數(shù)表示均勻度,Good’s coverage指數(shù)表示覆蓋度;β多樣性使用PCoA圖,其中距離算法是Bray-Curtis分析;LEfSe (LDA Effect Size)分析是一種非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法,同時(shí)使用了Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和檢驗(yàn),結(jié)合線性判別分析(Linear discriminant analysis,LDA),在兩組中在豐度上有顯著差異的物種,LDA值代表了顯著差異物種的影響大小,LDA效應(yīng)量>2且P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組嬰兒腸道菌群在門和屬水平上的組成 兩組腸道菌群在門水平上的物種相對(duì)豐度排列前5位的菌門為放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia),見圖1。兩組腸道菌群在屬水平上的物種相對(duì)豐度排列前5位的菌屬為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、韋永氏球菌屬(Veillonella)、埃希氏桿菌屬(Escherichia),見圖2。

圖1 特應(yīng)性皮炎嬰兒與健康嬰兒腸道菌群在門水平上的物種相對(duì)豐度 圖2 嬰兒期特應(yīng)性皮炎患兒與健康嬰兒腸道菌群在屬水平上的物種相對(duì)豐度

2.2 α多樣性指數(shù) 研究環(huán)境中微生物的多樣性,通過alpha多樣性分析能較全面地評(píng)估菌群落的豐度及多樣性,其中Observed species指數(shù)和Shannon指數(shù),這兩組指數(shù)顯示AD組較對(duì)照組豐度、多樣性、均勻度中位數(shù)偏低,Good coverage值表示AD組覆蓋度偏高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖3。

每對(duì)箱線圖對(duì)應(yīng)一種α多樣性指數(shù),在其頂端灰色區(qū)域標(biāo)識(shí)。每個(gè)箱線圖中,橫坐標(biāo)為分組標(biāo)簽,縱坐標(biāo)為相應(yīng)α多樣性指數(shù)的值。箱線圖中,各符號(hào)含義如下:箱的上下端線,上下四分位數(shù)(Interquartile range,IQR);中位線,中位數(shù);上下邊緣,最大最小內(nèi)圍值(1.5倍的IQR);在上下邊緣的外部的點(diǎn),表示異常值。多樣性指數(shù)標(biāo)簽下的數(shù)字為Kruskal-Wallis檢驗(yàn)的P值。AD組:特應(yīng)性皮炎嬰兒;對(duì)照組:健康嬰兒圖3 嬰兒期特應(yīng)性皮炎患兒與健康嬰兒腸道菌群的α多樣性指數(shù)

2.3 β多樣性分析 研究不同生境間多樣性的比較,從圖中可以看出,兩組之間有明顯的不一致性,使用PERMANOVA檢驗(yàn)(P=0.032),提示兩組間菌落有顯著性差異,見圖4。

圖4 嬰兒期特應(yīng)性皮炎患兒與健康嬰兒腸道菌群的PCoA圖 圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本,不同顏色的點(diǎn)指示不同的組。坐標(biāo)軸括號(hào)中的百分比代表了對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)軸所能解釋的樣本差異數(shù)據(jù)(距離矩陣)的比例。兩點(diǎn)在坐標(biāo)軸上的投影距離越近,表明這兩個(gè)樣本在相應(yīng)維度中的群落組成越相似。橢圓形虛線圈為95%置信橢圓。AD:特應(yīng)性皮炎嬰兒;對(duì)照組:健康嬰兒 圖5 嬰兒期特應(yīng)性皮炎患兒與健康嬰兒腸道菌群的LEfSe圖 縱坐標(biāo)為組間具有顯著差異的分類單元,橫坐標(biāo)則以條形圖直觀地展示各分類單元的LDA分析對(duì)數(shù)得分值。分類單元按照得分值大小進(jìn)行排序,以此描述它們?cè)跇颖痉纸M中的特異性。長(zhǎng)度越長(zhǎng)表明該分類單元的差異越顯著,條形圖的顏色指示了該分類單元所對(duì)應(yīng)的豐度最高的樣本分組。AD組:嬰兒期特應(yīng)性皮炎患兒;對(duì)照組:健康嬰兒

2.4 LEfSe分析 采用LEfSe分析發(fā)現(xiàn)AD組腸道菌群中,弗氏檸檬酸桿菌(LDA=2.430)、產(chǎn)酸克雷伯菌(LDA=2.211)顯著性增加,對(duì)照組鏈球菌屬(LDA=4.517)、韋榮氏球菌屬(LDA=4.311)、巨球形菌屬(LDA=3.592)、唾液乳酸桿菌(LDA=3.510)、副流感嗜血桿菌(LDA=3.108)、埃格特菌屬(LDA=2.871)、第三梭狀芽胞桿菌(LDA=2.850)、肺炎鏈球菌(LDA=2.651)、共生梭菌(LDA=2.588)、無害芽胞梭菌(LDA=2.262)、小韋榮氏球菌(LDA=2.260)顯著高于AD組,見圖5。

3 討論

約有45%的AD發(fā)生在嬰兒期前6個(gè)月,研究表明AD嬰兒腸道菌群與健康嬰兒腸道菌群具有差異性,提示嬰兒腸道菌群定植在AD的發(fā)展中起著重要的作用[7-8]。嬰幼兒早期腸道微生物組的組成、功能和代謝產(chǎn)物與AD的自然進(jìn)程有關(guān)[9-10]。腸道中豐富的胎糞代謝組與菌群組成可以減少過敏性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),且菌群結(jié)構(gòu)和過敏表型之間具有顯著關(guān)系[11-12]。嬰兒期腸道菌群的不平衡可能是特應(yīng)性病程發(fā)展的重要條件[13]。

目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于AD嬰兒腸道菌群定植的報(bào)道甚少。本研究通過16S rRNA測(cè)序、α多樣性指數(shù)、β多樣性及LEfSe分析,比較患有AD的嬰兒與健康嬰兒腸道菌群的差異性。研究結(jié)果顯示,兩組腸道菌群在門水平上的物種相對(duì)豐度排列前5位的分別是放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、疣微菌門;在屬水平上的物種相對(duì)豐度排列前5位的有雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、韋永氏球菌屬、埃希氏桿菌屬,與國(guó)外研究一致[11,13]。兩組腸道菌群在組成結(jié)構(gòu)上有顯著性差異(P=0.032);AD組的菌群物種豐度和均勻度指數(shù)較對(duì)照組偏低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);采用LEfSe分析方法發(fā)現(xiàn)在屬和種水平上,AD組中弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌較對(duì)照組顯著性增加,對(duì)照組中鏈球菌屬、韋榮氏球菌屬、巨球形菌屬、唾液乳酸桿菌、副流感嗜血桿菌、埃格特菌屬、第三梭狀芽胞桿菌、肺炎鏈球菌、共生梭菌、無害芽胞梭菌、小韋榮氏球菌較AD組有顯著性增加。上述結(jié)果表明,健康對(duì)照組嬰兒腸道中益生菌與致病菌以共生形式存在,其菌群多樣性較AD組明顯增多,而AD組嬰兒腸道菌群較為單一,這可能是引發(fā)AD的原因。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)AD患兒腸道大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、梭狀芽孢桿菌的比例升高[7,14,15],而本研究中AD組嬰兒腸道中弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌的相對(duì)豐度顯著高于健康對(duì)照組,提示上述兩種菌可能在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),經(jīng)剖宮產(chǎn)出生嬰兒的腸道菌群中弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌等定植顯著相關(guān),推測(cè)可能是哮喘和過敏患病率增加的原因[16]。克雷伯氏菌在腸道定植發(fā)生在生命早期,作為腸道生態(tài)系統(tǒng)中的共生菌群在機(jī)會(huì)條件下致病,在3個(gè)月齡濕疹嬰兒的腸道中發(fā)現(xiàn)明顯富集,炎癥性腸病小鼠模型研究中也描述了克雷伯氏菌和嬰兒腸道早期炎癥的發(fā)生有關(guān)[17]。特應(yīng)性濕疹嬰兒的微生物組和代謝組進(jìn)行了分析通過肺炎克雷伯菌的富集,與糞便增加相關(guān)d-葡萄糖濃度和相關(guān)毒力因子基因表達(dá)增加有關(guān)[18]。

綜上所述,AD嬰兒腸道菌群相對(duì)豐度及生物多樣性與正常嬰兒存在差異性。腸道菌群的組成和比例差異與AD的發(fā)展相關(guān),腸道菌群可通過免疫、代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌途徑促進(jìn)AD的發(fā)展,影響其持續(xù)性和嚴(yán)重性[19]。因此,關(guān)注AD嬰兒早期腸道菌群定植,對(duì)AD預(yù)防和治療具有重要意義,但因腸道菌群受地域、環(huán)境、飲食等諸多因素影響而發(fā)生變化,其對(duì)疾病和過敏進(jìn)程的影響還需進(jìn)行更深入地前瞻性研究加以證實(shí)。