花芹 林泉祥 宋遠(yuǎn)輝 孫家猛 張祖普陳慶全 李金才 張海濤

（1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，230036，安徽合肥；2 江蘇紅旗種業(yè)科技有限公司，225311，江蘇泰州；3 江蘇?。t旗）稻麥良種繁育工程技術(shù)研究中心，225311，江蘇泰州）

水稻（OryzasativaL.）作為重要的糧食作物，其胚乳主要由近80%淀粉和10%貯藏蛋白組成，為人類日常膳食提供重要能量。淀粉的生物合成和貯藏蛋白積累直接影響稻米的外觀、產(chǎn)量和食味品質(zhì)。

胚乳發(fā)育中貯藏物質(zhì)的合成受復(fù)雜基因調(diào)控。淀粉中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶催化葡萄糖-1-磷酸和ATP 而產(chǎn)生活化的葡萄糖基供體ADP-葡萄糖和焦磷酸[1]。隨后在歧化酶、淀粉磷酸化酶、可溶性淀粉合酶、顆粒結(jié)合淀粉合酶I、淀粉分支酶和淀粉脫支酶等催化協(xié)同酶的作用下合成[2]。這些關(guān)鍵酶的缺失有可能導(dǎo)致胚乳皺縮[3]、黏稠[4]、白核[5]、粉質(zhì)[6]和暗淡[7]等異常表型。其中白核和粉質(zhì)等突變胚乳常表現(xiàn)為淀粉粒的數(shù)量、大小與排列等變異。SSG6編碼一種轉(zhuǎn)氨酶同源蛋白，其突變體ssg6成熟核淀粉顆粒增大，但千粒重顯著下降且呈輕微粉質(zhì)狀[8]；fse1和flo6中出現(xiàn)較小的淀粉粒且排列松散，導(dǎo)致胚乳呈粉質(zhì)狀態(tài)[9-10]；FLO19編碼一個(gè)定位在質(zhì)體的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E1 組分亞基α1，該基因突變導(dǎo)致復(fù)合型淀粉顆粒減少，單粒型淀粉顆粒增多，導(dǎo)致籽粒內(nèi)胚乳呈不透明狀[11]。除合成淀粉外，粉質(zhì)胚乳表型也與貯藏蛋白積累有關(guān)。谷蛋白合成相關(guān)的基因GPA4、GPA5和GPA6發(fā)生突變均呈現(xiàn)粉質(zhì)外觀。GPA4編碼一個(gè)保守膜蛋白GOT1B，通過(guò)與Sec23蛋白特異性互作調(diào)控COPII（coat protein complex II）組裝，積累57kD 的谷蛋白前體，形成2 種異常的Ⅰ型蛋白體，gpa4-1突變體的種子中蛋白含量顯著降低[12]；GPA5編碼一種植物特有的PX（phox-homology）結(jié)構(gòu)域蛋白，與Rab5a 和VPS9a協(xié)同互作調(diào)控密集囊泡介導(dǎo)的后高爾基體向蛋白貯藏液泡的運(yùn)輸[13]；GPA6編碼一個(gè)Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體OsNHX5，gpa6只有部分谷蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到II型蛋白體中，導(dǎo)致II 型蛋白體減小[14]。此外，一些基因突變導(dǎo)致淀粉與蛋白合成均受影響，形成粉質(zhì)胚乳。轉(zhuǎn)錄因子OsNAC20和OsNAC26雙突變體表現(xiàn)為淀粉和貯藏蛋白含量顯著下降，呈現(xiàn)粉質(zhì)胚乳[15]。FLO2編碼一個(gè)具有3 個(gè)四肽重復(fù)基序（TPR）蛋白，TPR 包含2 個(gè)反向平行的α-螺旋結(jié)構(gòu)，作為容納靶蛋白的互補(bǔ)區(qū)域，與多個(gè)目標(biāo)蛋白同時(shí)發(fā)生相互作用[6]。突變體中與FLO2相關(guān)的參與淀粉和貯藏蛋白生物合成的許多基因的表達(dá)水平顯著降低，產(chǎn)生異常胚乳，表現(xiàn)為暗色和粉質(zhì)特征，胚乳中貯藏物質(zhì)含量減少，籽粒變小，F(xiàn)1種子育性降低[16-17]。

雖然水稻粉質(zhì)胚乳成因研究取了一定進(jìn)展，但相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不明晰，仍需進(jìn)一步發(fā)掘相關(guān)品質(zhì)突變體，闡明淀粉和貯藏蛋白的生物合成與調(diào)控機(jī)制，促進(jìn)優(yōu)質(zhì)水稻育種。本文通過(guò)篩選中花11組織培養(yǎng)突變體庫(kù)，獲得一個(gè)呈粉質(zhì)、堊白和皺縮外觀胚乳的突變體cse（chalkinessandshrunken endosperm）。對(duì)突變體進(jìn)行表型觀察、理化性質(zhì)測(cè)定、遺傳分析、基因定位和候選基因克隆等研究，發(fā)現(xiàn)cse為flo2的一個(gè)新等位變異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與定位群體構(gòu)建

水稻粉質(zhì)胚乳突變體cse來(lái)源于粳稻（Oryza sativaL.ssp.japonica）品種中花11 的組織培養(yǎng)。自然環(huán)境下，連續(xù)多代自交和田間考察發(fā)現(xiàn)，突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳。將其與粳稻品種IRAT129 配制雜交組合獲得F1。F1自交獲得F2，F(xiàn)2群體用于遺傳分析和基因定位。親本、F1雜交種和F2群體材料均播種于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園（合肥），單株種植，株行距為18cm×25cm，田間管理同大田生產(chǎn)。其中親本各種植8 行，每行10 株，設(shè)3 次重復(fù)，觀察并記錄分析水稻各生育期親本間形態(tài)特征及農(nóng)藝性狀差異，并進(jìn)行單株收獲。利用JLGJ-45 型電動(dòng)礱谷機(jī)（大吉光電，杭州）去除穎殼后，統(tǒng)計(jì)群體中正常表型單株和突變體表型單株的分離比，選取極端個(gè)體用于精細(xì)定位。利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 籽粒干物質(zhì)積累測(cè)定

在中花11 和突變體穗部穎花開花后第3、7、14、21、28d 剪取穗頂部籽粒，置于105℃烘箱殺青30min 后，在80℃恒溫干燥箱中烘至恒重，脫除穎殼后測(cè)量干重，每個(gè)樣品設(shè)置10 次重復(fù)[18]。

1.3 碘染與掃描電鏡

親本種子去稃后用超純水浸潤(rùn)12h，橫切并滴加2%I2-KI 溶液染色，并置于尼康S261-60 型體視鏡下觀察并拍照記錄。掃描電鏡觀察參照Z(yǔ)hang等[19]方法，使用E1010 型離子濺射儀（日立，日本）在斷面鍍上碳膜，采用S-4800 型高分辨率掃描電子顯微鏡（日立，日本）觀察并拍照。

1.4 成熟種子的理化性質(zhì)測(cè)定

去殼籽粒采用200T 型高速多功能粉碎機(jī)研磨成糙米粉，過(guò)100 目篩，50℃恒溫箱中烘至恒重備用。采用A1481-1 植物淀粉含量試劑盒測(cè)定總淀粉含量；參照標(biāo)準(zhǔn)米質(zhì)方法NY 147-88 測(cè)定直鏈淀粉含量[20]；參照龍武華[21]的方法測(cè)定總蛋白含量；參照蒽酮比色法[22]測(cè)定可溶性糖含量；采用DA7200 型近紅外快速分析儀（Perten，美國(guó)）測(cè)定糙米中脂肪酸、堊白度、堿消值和膠稠度[23]；使用Pyris DSC8000 型差示掃描熱量?jī)x（Perten，美國(guó)）測(cè)定淀粉糊化特性[24]。參照于艷芳等[25]的方法測(cè)定尿素膨脹體積。每個(gè)樣本進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 目的基因定位與分子標(biāo)記的開發(fā)

SSR 和Indel 分子標(biāo)記的開發(fā)利用Gramene（http://www.gramene.org）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)下載日本晴和9311序列，通過(guò)BLAST 對(duì)比插入/缺失位點(diǎn)，利用Primer 3.0（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0）開發(fā)分子標(biāo)記，并由南京擎科生物科技有限公司合成。利用篩選出具有多態(tài)性的均勻分布于12 條染色體的197對(duì)SSR 和Indel 分子標(biāo)記。選取F2群體中具有粉質(zhì)胚乳表型的種子，用3%H2O2浸泡30min 破除休眠后，置于RXZ-50CD 型智能人工氣候箱（江南儀器，浙江）培養(yǎng)至三葉期，采用CTAB 法[26]提取葉片總DNA，構(gòu)建CSE定位的DNA 混池，尋找與目標(biāo)基因的連鎖位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上利用F2和F3群體進(jìn)行目標(biāo)基因的初步定位。再開發(fā)新的標(biāo)記，擴(kuò)大定位群體，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精細(xì)定位（表1）。10μL PCR 反應(yīng)體系如下，2×TaqPCR StarMix 5μL、正反向引物（10μmol/L）各1μL、DNA 模板1μL、10%聚乙烯吡咯烷酮（PVP，polyvinylpyrrolidone）1μL 和ddH2O 1μL。PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，退火溫度55℃～60℃退火30s，72℃延伸1min，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)；最后72℃下終延伸5min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、0.1%AgNO3染色后在3%的甲醛和NaOH 中顯色，觀察拍照并記錄基因型[27]。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.6 RNA 提取與Real-time PCR 表達(dá)分析

取野生型和突變體三葉期葉片、根、莖、旗葉、花后3、7、14、21 和28d 穗，于-80℃保存，使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（擎科）提取總RNA，超微量分光光度計(jì)（DENOVIX，美國(guó)）檢測(cè)濃度。RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾瑞科）獲得cDNA。利用CSE的CDS 設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物，水稻基因Ubiquitin（LOC_Os03g13170）作為內(nèi)參（表1）。反應(yīng)體系采用莫納生物科技有限公司試劑盒MonAmpTMChemoHS qPCR Mix（MQ00401），20μL反應(yīng)體系為0.4μmol/L 的正、反向引物、MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 以及適宜濃度的cDNA；在BIO-RAD CFX96TM型熒光定量PCR 儀（BIORAD，美國(guó)）上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性10s，60℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，用2-△△CT法計(jì)算CSE的表達(dá)量[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型分析

水稻粉質(zhì)胚乳突變體cse在合肥經(jīng)多年種植性狀穩(wěn)定。與野生型相比，cse在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段分蘗數(shù)顯著增加48.0%；生殖生長(zhǎng)階段，生長(zhǎng)較緩慢，株高顯著降低，主要表現(xiàn)在第3、4 節(jié)間分別縮短29.4%和40.0%、穗長(zhǎng)縮短7.9%（表2，圖1a～c）。考種結(jié)果（表2）表明，cse二次枝梗數(shù)和結(jié)實(shí)率分別降低29.7%和3.0%。cse成熟干燥穎果表現(xiàn)為輕微皺縮，胚胎外圍呈透明狀，內(nèi)胚乳粉質(zhì)堊白不透明；而野生型穎果飽滿，胚胎輪廓清晰，胚乳硬質(zhì)呈透明狀（圖1e～f）。與野生型相比，cse成熟籽粒的粒寬和粒厚顯著降低，千粒重僅為野生型的62.0%（圖1d，表2）。此外，我們分析了野生型和cse穎果發(fā)育過(guò)程中干重變化。從授粉后7d 開始，cse千粒重極顯著低于野生型，并且隨著籽粒的發(fā)育千粒重間差異逐漸擴(kuò)大（圖2）。以上結(jié)果表明，cse的突變不僅影響植株的發(fā)育，也影響籽粒的灌漿速率。

圖1 野生型和突變體cse 的表型鑒定Fig.1 Phenotypic characterization of wild type and the cse

圖2 野生型和cse 的不同時(shí)期干物質(zhì)積累比較Fig.2 Dry matter accumulation in wild type and cse at different stages

表2 野生型和突變體農(nóng)藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic traits between the wild type and cse

2.2 胚乳淀粉顆粒染色與結(jié)構(gòu)分析

野生型糙米橫截面呈透明狀且質(zhì)地緊密，而突變體糙米橫截面呈粉質(zhì)狀態(tài)且質(zhì)地疏松。經(jīng)2%的I2-KI 染色發(fā)現(xiàn)，突變體著色較野生型淺（圖3a～b），表明cse淀粉含量較野生型更低。利用掃描電鏡觀察野生型和cse成熟穎果橫斷面顯示，野生型胚乳淀粉顆粒緊密堆積、呈規(guī)則的多邊形晶體結(jié)構(gòu)（圖3c）；而cse淀粉粒呈不規(guī)則球形且淀粉顆粒間縫隙較大，排列疏松，多以單一、分散的淀粉粒存在（圖3d）。上述結(jié)果表明，cse對(duì)胚乳中淀粉顆粒的發(fā)育至關(guān)重要。

圖3 野生型和cse 的成熟胚乳碘染和掃描電鏡觀察Fig.3 Iodine staining and SEM observation of mature endosperm between wild type and cse

2.3 成熟籽粒的理化性質(zhì)分析

由于cse胚乳中淀粉發(fā)育異常，我們還檢測(cè)了成熟籽粒的理化性質(zhì)。與野生型相比，cse的總蛋白質(zhì)、脂肪酸和可溶性糖含量分別極顯著增加21.5%、83.7%和34.8%，堊白度增加340%；但總淀粉含量降低22.2%，且直鏈淀粉含量（8.8%）僅為野生型（17.6%）的49.9%（表3）。直鏈淀粉含量通常與糊化溫度、膠稠度相關(guān)。cse直鏈淀粉含量降低，其起始糊化溫度、峰值、結(jié)束溫度和焓變量也分別顯著降低6.9%、5.1%、3.1%和28.3%（表4），糊化溫度的關(guān)鍵指標(biāo)堿消值也相應(yīng)降低6.2%，但膠稠度增加11.2%。糊化特性影響米粉溶解性，尿素膨脹試驗(yàn)結(jié)果表明，兩者在5mol/L 出現(xiàn)明顯膨脹現(xiàn)象（圖4），但突變體的米粉膨脹體積變化始終低于野生型。以上結(jié)果說(shuō)明，cse突變影響了水稻穎果中淀粉和貯藏蛋白的累積，進(jìn)而改變胚乳淀粉的理化性質(zhì)。

圖4 野生型和cse 的尿素膨脹分析Fig.4 The swollen volume of wild type and cse starch in urea solutions of various concentrations

表3 野生型和突變體理化性質(zhì)比較Table 3 Physicochemical properties comparison between the wild type and cse

表4 野生型和突變體糙米粉的熱特性參數(shù)Table 4 Thermal parameters of the wild type and cse

2.4 cse 遺傳分析

以cse為母本，以粳稻品種IRAT129 為父本配制雜交組合，F(xiàn)1籽粒發(fā)育正常，F(xiàn)2籽粒出現(xiàn)正常表型和粉質(zhì)胚乳表型分離。2020 年隨機(jī)調(diào)查F2群體212 株，2021 年隨機(jī)調(diào)查F2群體743 株（表5），cse符合3:1（χ22020、2021<χ20.05,1=3.84）的分離規(guī)律，推斷cse的表型性狀受1 對(duì)隱性核基因控制。

2.5 粉質(zhì)胚乳基因的精細(xì)定位

利用2 個(gè)親本cse和IRAT129 間具有多態(tài)性的197 對(duì)分子標(biāo)記，對(duì)F2極端隱性表型單株構(gòu)成的DNA 混池進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)親本cse的帶型與位于第4 號(hào)染色體上標(biāo)記Os4-10 一致（圖5a）。進(jìn)一步利用Os4-10 附近的標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，并開發(fā)了另外5 對(duì)多態(tài)性引物Os4-11、Os4-12、Os4-12-11、Os4-13 和Os4-13-16，對(duì)550 株F2具有粉質(zhì)胚乳外觀單株進(jìn)行初定位，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因cse位于分子標(biāo)記Os4-13 和Os4-13-16 之間（圖5b）?；贕ramene 中水稻基因序列信息，在Os4-13 和Os4-13-16 之間開發(fā)出4 對(duì)新的SSR 和Indel 標(biāo)記（表2），借助3034 株F2隱性單株，將cse鎖定在物理距離為40kb 的Os4-14-8 和Os4-15 標(biāo)記間（圖5c）。

圖5 cse 的精細(xì)定位Fig.5 Fine mapping of cse

Gramene（http://www.gramene.org/）網(wǎng)站和Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/）上的基因預(yù)測(cè)信息表明上述40kb 候選區(qū)間內(nèi)共有6 個(gè)候選基因（圖5d，表6）。經(jīng)反復(fù)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，cse的ORF1～5 不存在堿基序列差異，但ORF6（LOC_Os04g55230）的第1 個(gè)外顯子處（-ATG 51bp）缺失3 個(gè)堿基（GGC）,導(dǎo)致甘氨酸缺失；第14 個(gè)外顯子處（-ATG 7887bp）堿基G 被替換成A，導(dǎo)致精氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔▓D5e）。cse編碼含有四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，是已經(jīng)報(bào)道[6,21]基因OsFLO2/OsCNY8的新等位基因。

表6 精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)注釋基因Table 6 Annotated genes in the fine mapping range

2.6 CSE 表達(dá)模式與同源分析

我們利用Phytozome13（https://phytozome.jgi.doe.gov）上LOC_Os04g55230序列信息，在水稻、擬南芥、小麥、玉米和大麥的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源蛋白，利用MEGA7.0 軟件對(duì)CSE 及同源蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)水稻中存在2 個(gè)未有相關(guān)研究報(bào)道的同源基因LOC_Os07g23990和LOC_Os02g15660，同源率分別為73.5%和72.2%。擬南芥中同源基因ATFLO2（AT1G15290）參與種子中貯藏物質(zhì)的積累，其T-DNA 插入突變體表現(xiàn)為種子易碎、數(shù)量減少以及千粒重降低[29]；ATFLL1（AT1G01320）參與葉片中淀粉合成和糖代謝[30]。因此，表明CSE是粉質(zhì)胚乳相關(guān)基因（圖6）。

圖6 CSE 和CSE 類蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of CSE(LOC_Os04g55230)and CSE-like proteins

利用Real-time PCR 檢測(cè)CSE在野生型中的表達(dá)模式，結(jié)果（圖7）表明，CSE在檢測(cè)的水稻組織包括葉片、根、莖、旗葉和不同時(shí)期發(fā)育的胚乳中均有表達(dá)，在旗葉中大量表達(dá)，授粉后14d 的發(fā)育胚乳中表達(dá)量達(dá)到峰值。

圖7 CSE 在野生型不同組織及不同發(fā)育時(shí)期胚乳的表達(dá)模式分析Fig.7 Wild type expression analysis of CSE in different tissues and endospern of different growth periods

3 討論

水稻胚乳的淀粉生物合成和貯藏蛋白積累是一個(gè)復(fù)雜而精密的生物過(guò)程，涉及一系列酶促反應(yīng)。淀粉合成受到抑制，導(dǎo)致胚乳細(xì)胞淀粉顆粒排列疏松，顆粒間的縫隙引起光的散射，光在穿過(guò)胚乳損失而表現(xiàn)為白色不透明[31]。已有多個(gè)胚乳發(fā)育基因突變導(dǎo)致胚乳不透明的研究報(bào)道，如FLO5、WAXY和BEIIb[5,32]。胚乳缺陷突變體是闡明種子發(fā)育和淀粉生物合成分子機(jī)制的寶貴資源。本研究中，我們分離并鑒定了籽粒輕微皺縮、胚乳外圍輪廓清晰透明及內(nèi)胚乳粉質(zhì)不透明表型的cse突變體。與野生型相比，cse籽粒灌漿速率下降、結(jié)實(shí)率、千粒重和淀粉含量降低，淀粉的糊化特性和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。掃描電鏡觀察顯示，cse橫截面質(zhì)地疏松，淀粉粒呈不規(guī)則球形，淀粉顆粒間縫隙較大、多以單一、分散的形式存在且碘染色力較弱；而野生型胚乳淀粉顆粒緊密堆積，呈規(guī)則的多邊形晶體結(jié)構(gòu)（圖3）。cse種子的橫截面外觀與flo7和flo5/ss3a突變體相似，flo7僅在籽粒外圍表現(xiàn)出粉狀的白色胚乳，而flo5/ss3a突變體則表現(xiàn)出白核粉狀胚乳[5,7]。淀粉合成由多個(gè)基因協(xié)同調(diào)控，因此，cse的粉質(zhì)胚乳表型可能是水稻淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)改變的共同作用。TPR 結(jié)構(gòu)域廣泛存在于多種蛋白質(zhì)中，并在蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞周期控制和翻譯后修飾等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，如編碼TPR 結(jié)構(gòu)域的基因OsST2，對(duì)水稻分蘗起調(diào)控作用[33-34]。cse的第16、17、18 外顯子編碼3 個(gè)TPR基序，但第14 個(gè)外顯子處存在一個(gè)堿基G 被替換成堿基A，導(dǎo)致精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，可能造成TPR 結(jié)構(gòu)域功能缺陷，使總淀粉含量降低22.2%，直鏈淀粉含量?jī)H為野生型的49.9%（表3）。由此推測(cè)，cse可能對(duì)淀粉的合成與積累產(chǎn)生影響。此外，flo2僅籽粒大小和淀粉品質(zhì)降低[6]，而cse還伴有植株變矮和分蘗數(shù)增加等性狀，表明cse是flo2的新等位基因突變體。

脂質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)活性間接影響淀粉粒的形成。編碼單半乳糖基二酰基甘油（MGDG）合酶的o5點(diǎn)突變導(dǎo)致MGDG 和半乳糖基二脂?；视停―GDG）減少，導(dǎo)致胚乳發(fā)育和淀粉合成異常[35]。此外，磷脂酸被證實(shí)與擬南芥中涉及半乳糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的幾種蛋白結(jié)合，包括ABC 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和DGD1[36]。粉質(zhì)胚乳突變體fse1中總DGDG含量顯著降低，但總MGDG 含量有降低的趨勢(shì)[9]。cse胚乳發(fā)育過(guò)程中，脂肪酸含量顯著增加83.7%。cse脂質(zhì)組成的改變可能導(dǎo)致種子發(fā)育異常，進(jìn)而造成淀粉合成異常。因此，脂質(zhì)介導(dǎo)的代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)可能是揭示種子淀粉積累機(jī)制的重要途徑，進(jìn)一步對(duì)淀粉體中淀粉合成和膜脂合成之間的功能聯(lián)系研究，有助于闡明這種聯(lián)系背后的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

cse是一個(gè)從組織培養(yǎng)后代植株中篩選出的胚乳發(fā)育異常突變體，該突變體籽粒受粉7d 后灌漿速率顯著降低，成熟籽粒表現(xiàn)為輕微皺縮，胚胎外圍呈透明狀，內(nèi)胚乳粉質(zhì)不透明。掃描電鏡結(jié)果顯示，淀粉粒呈不規(guī)則球形且淀粉顆粒間縫隙較大，排列疏松，多以單一、分散的淀粉粒存在且碘染色較淺。對(duì)籽粒理化性質(zhì)測(cè)定表明，突變體的蛋白質(zhì)、脂肪酸和可溶性糖含量顯著增加，總淀粉和直鏈淀粉含量降低。通過(guò)cse和IRAT129 配制雜交組合的F2遺傳定位群體分析表明，該性狀是由1 對(duì)隱性核基因控制。通過(guò)圖位克隆將該基因定位于4 號(hào)染色體Os4-14-8 和Os4-15 標(biāo)記之間，物理距離為40kb。測(cè)序表明，候選區(qū)間內(nèi)ORF6（LOC_Os04g55230）第1 個(gè)外顯子缺失3 個(gè)堿基（GGC）導(dǎo)致甘氨酸缺失，第14 個(gè)外顯子內(nèi)存在一個(gè)由G 到A 的突變，導(dǎo)致精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?。cse編碼的氨基酸改變，其蛋白功能活性受損，引起粉質(zhì)胚乳表型。