張紅巖，古偉玲，張桐語(yǔ)，秦鑫，楊振

（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012）

參芪顆粒是由黃芪、黨參、肉桂、大黃和益母草等中藥材經(jīng)過(guò)水提、干燥等一系列處理后加入輔料而制備成的中藥顆粒劑，主要用于脾腎氣虛以及濕濁內(nèi)蘊(yùn)型慢性腎功能衰竭的治療，臨床應(yīng)用中取得了較好的效果，現(xiàn)擬對(duì)其創(chuàng)新中藥復(fù)方制劑開(kāi)發(fā)進(jìn)行研究。為了對(duì)成品有更好的控制方法，保證參芪顆粒在用藥上的安全有效及質(zhì)量可控，在前期完成了參芪顆粒制備工藝研究的基礎(chǔ)上，我們又對(duì)制成的樣品開(kāi)展了一系列質(zhì)量控制方法規(guī)范化研究，利用色譜技術(shù)手段對(duì)所得樣品中各藥材的組成成分開(kāi)展了色譜鑒定研究。經(jīng)過(guò)深入研究后，黃芪、益母草和大黃的TLC 斑點(diǎn)鑒別顯著，陰性無(wú)干擾，重復(fù)性好。此外，在試驗(yàn)中還研究了利用高效液相色譜法測(cè)定參芪顆粒制劑中重要藥效成分黃芪甲苷含量的方法，對(duì)參芪顆粒3 批樣品內(nèi)所含黃芪甲苷依據(jù)所確定方法進(jìn)行測(cè)定，并確定了其含量限度。通過(guò)以上研究，為藥品質(zhì)量的控制打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（LC-10ATvp 型日本島津）；蒸發(fā)光檢測(cè)儀（ELSD-6000美國(guó)奧泰）；工作站（LCsolution Lite日本）；電子天平（XS105 型梅特勒-托利多）；超聲儀（250 W，頻率為40 KHz 昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸水蘇堿對(duì)照品（中檢院，批號(hào)：110712-201916，96.9%，供含量測(cè)定）；黃芪甲苷對(duì)照品（中檢院，批號(hào)：110781-201717，96.9%，供含量測(cè)定）；大黃對(duì)照藥材（中檢院，批號(hào)：120902-201311）；參芪顆粒（吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司，3 批參芪顆粒樣品批號(hào)：20210701、20210702、20210703）；乙腈（液相流動(dòng)相組成）為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芪薄層色譜鑒別 取參芪顆粒10 g，置于研缽中，研磨成粉末，加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液60 mL，30 min超聲處理，過(guò)濾得濾液，將濾液蒸干，加入20 mL 水使殘?jiān)芙猓运柡驼〈紴樘崛∪軇?0 mL/次，提取2 次，提取完成后合并正丁醇液，再使用30 mL 正丁醇飽和水洗1 次，蒸干正丁醇液，用1 mL 80%甲醇溶解殘?jiān)?，即得供試品溶液。另使?0%甲醇為溶劑配制成1 mg/mL 的黃芪甲苷對(duì)照品溶液。取不含黃芪的陰性樣品10 g，按供試品制備方法制得陰性對(duì)照溶液。按薄層色譜法（中國(guó)藥典2020年版四部 通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5μL、對(duì)照品溶液2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為三氯甲烷－甲醇－水（13:7:2），展開(kāi)完成后，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液顯色，在105 ℃烘烤至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，與黃芪甲苷對(duì)照品色譜對(duì)應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，薄層結(jié)果，見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪TLC 鑒別Fig.1 TLC chromatogram of

2.1.2 大黃薄層色譜鑒別 取參芪顆粒10 g，置于研缽中，研磨成粉末，加入80 mL 甲醇，進(jìn)行30 min 超聲處理，過(guò)濾得濾液，將濾液蒸干，加水20 mL 使殘?jiān)芙?，加鹽酸2 mL 后回流30 min，隨即立即冷卻，以三氯甲烷為提取溶劑進(jìn)行提取，20 mL/次，提取2 次，提取完成后合并三氯甲烷液，蒸干，使用1 mL 三氯甲烷溶解殘?jiān)?，即得供試品溶液。另? g 大黃對(duì)照藥材，按上述方法制得對(duì)照藥材溶液。再取不含大黃的陰性樣品10 g，同法制得陰性對(duì)照溶液。按薄層色譜法（中國(guó)藥典2020 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各5μL，于同一個(gè)硅膠G 薄層板上點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15:5:1）的上層溶液，展開(kāi)完成后，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色4個(gè)熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，薄層結(jié)果，見(jiàn)圖2。

圖2 大黃TLC 鑒別Fig.2 TLC chromatogram of

2.1.3 益母草薄層色譜鑒別 取參芪顆粒10 g，置于研缽中，研磨成粉末，加70%乙醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至5 mL，放冷，通過(guò)樣品柱（采用中性氧化鋁3 g裝柱），以50 mL 70%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，并將洗脫液蒸干，以1 mL 無(wú)水乙醇為溶劑溶解殘?jiān)?，即得供試品溶液。另取鹽酸水蘇堿對(duì)照品，以無(wú)水乙醇為溶劑制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。再取不含益母草的陰性樣品10 g，同法制得陰性對(duì)照溶液。按薄層色譜法（中國(guó)藥典2020 年版四部 通則0502）試驗(yàn)，分別吸取10μL 供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液，分別點(diǎn)于同一個(gè)硅膠G 薄層板上，以丙酮無(wú)水乙醇－鹽酸（10:6:1）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，在105 ℃加熱15min，放冷，噴以稀碘化鉍鉀試液和三氯化鐵試液（10:1）混合溶液至斑點(diǎn)清晰顯色。從薄層板斑點(diǎn)顯色結(jié)果可看出，供試品與對(duì)照品色譜在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，薄層結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 益母草TLC 鑒別Fig.3 TLC chromatogram of

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：YWC-C18（4.6 mm 150 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈：水（50:50）；柱溫：30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)；液相漂移管溫度：100 ℃，空氣泵空氣流速：2.8L/min。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算，不得低于4000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品（中檢院，批號(hào)：110781-201717）適量，以80%甲醇為溶劑進(jìn)行溶解，制成每l mL 含0.25 mg 的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取參芪顆粒，置于研缽中，研磨成粉末，取1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加含4%濃氨試液的80%甲醇溶液20 mL，隨后進(jìn)行超聲處理（250 w，40 kHz），40 min 后取出，放冷，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液15 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用水飽和正丁醇提取，10 mL/次，提取5 次，將正丁醇液合并后蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取參芪顆粒中除去黃芪外其余藥材，按工藝制成陰性樣品，以上述擬定的方法制成供試液及陰性對(duì)照液，按上述色譜條件測(cè)定，陰性無(wú)雜峰干擾，達(dá)到很好分離，見(jiàn)圖4。

圖4 參芪顆粒高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of Shenqi granules

2.2.4.2 線性范圍考察 取黃芪甲苷對(duì)照品，加80%甲醇制成0.4981mg/mL的溶液，分別吸取0.5mL、1mL、3 mL、5 mL、7 mL 和9 mL，分別放入10 mL 瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各20μL，按2.2.1 條件進(jìn)行測(cè)定。以黃芪甲苷μg數(shù)的Log 值為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積積分值的Log 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在0.498 1～8.965 2μg范圍內(nèi)，黃芪甲苷量的Log 值與峰面積積分值的Log值為良好線性關(guān)系?；貧w方程為y=1.77x+5.54，相關(guān)系數(shù)r=0.998 2。

2.2.4.3 精密度考察 精密吸取2.2.3 項(xiàng)下供試品溶液20μL，且連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積積分值為373 004、386 464、378 282、373 465、363 715 和376 759，RSD 為1.42%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取2.2.3 項(xiàng)下中同一份供試品溶液20μL，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h。對(duì)應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得得峰面積積分值分別為361 107、359 436、352 151、350201、359611、363 622 和369 266。結(jié)果表明，黃芪甲苷峰面積積分值的RSD 為1.82%，證明48h 內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批次參芪顆粒樣品按2.2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6 份，按照方法測(cè)定，6次測(cè)定結(jié)果分別0.6016mg/g、0.6105mg/g、0.6024mg/g、0.597 5mg/g、0.5892mg/g 和0.5996mg/g，RSD=1.15%，測(cè)定結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量參芪顆粒樣品6 份（黃芪甲苷含量為0.602 mg/g），分別精密加入一定量的黃芪甲苷對(duì)照品，按照2.2.3 項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定并分析，計(jì)算回收率，黃芪甲苷平均回收率為98.35%，RSD=1.16%，見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Recovery determination results

2.2.4.7 樣品測(cè)定 對(duì)中試規(guī)模制備的3 批參芪顆粒樣品中黃芪甲苷含量進(jìn)行了測(cè)定，見(jiàn)表2。

表2 參芪顆粒中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Content determination results of astragaloside IV in Shenqi granules

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

3.1.1 黃芪鑒別 黃芪為臨床治療的一味常見(jiàn)中藥材，味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)，其主要功效為補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫、固表止汗、托毒排膿和生津養(yǎng)血等，在臨床上多用于氣虛乏力、納差便溏及中氣下陷等的治療。根據(jù)研究表明，黃芪化學(xué)成分種類多樣，多糖類、黃酮類和皂苷類等是主要化學(xué)成分，其中，黃芪甲苷是主要的皂苷類化學(xué)成分，在抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降糖調(diào)脂、抗菌和抗輻射等方面發(fā)揮重要作用[1,2]。

《中國(guó)藥典》2020 版一部黃芪鑒別項(xiàng)下中采用樣品經(jīng)4%濃氨試液的80%甲醇提取后進(jìn)行鑒別，但本品為中藥復(fù)方制劑，雜質(zhì)多，若直接采用藥典方法制備供試品溶液直接點(diǎn)樣進(jìn)行鑒別，干擾較大，故參考相關(guān)研究方法[3-6]，采用將樣品的80%甲醇提取液蒸干后，經(jīng)水溶解后用正丁醇提取，用水洗滌方法，可除去大部分色素等雜質(zhì)，所制備的供試品溶液不黏稠，易于點(diǎn)樣。采用藥典薄層色譜條件進(jìn)行鑒別[7]，供試品色譜中特征斑點(diǎn)清晰，雜質(zhì)斑點(diǎn)少，方法重復(fù)性好，可作為制劑中黃芪鑒別方法。

3.1.2 大黃鑒別 大黃其性寒，味苦，歸脾胃、大腸、肝心包經(jīng)，臨床上主要用于實(shí)熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤腫痛、癰腫疔瘡、腸癰腹痛、瘀血經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻和跌打損傷等，可瀉火攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)及利濕退黃。大黃化學(xué)成分主要集中在蒽醌類、蒽醌衍生物類和蒽酮類等，同時(shí)也包括有機(jī)酸、糖類等，其中，蒽醌類、蒽酮類是大黃的有效成分[8,9]。據(jù)報(bào)道，大黃可在一定程度上治療腎纖維化，其原理為骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的表達(dá)因大黃素的存在而被促進(jìn)，腎間質(zhì)纖維化被延緩[10]。在薄層鑒別試驗(yàn)中，參考藥典及文獻(xiàn)方法[11]，對(duì)比石油醚（30～60 ℃）甲酸乙酯－甲酸（15:5:1）及正己烷－乙酸乙酯－冰醋酸（15:5:0.3）兩種展開(kāi)系統(tǒng)鑒別效果，結(jié)果以藥典方法中展開(kāi)系統(tǒng)鑒別效果最佳。

3.1.3 益母草鑒別 益母草成分較復(fù)雜，主要為生物堿、黃酮類化學(xué)成分[12]。鑒別試驗(yàn)中，參考《中國(guó)藥典》2020 版一部益母草鑒別項(xiàng)下供試品制備方法，增加氧化鋁純化步驟，可更好除去干擾物質(zhì)，從而使鑒別特征斑點(diǎn)清晰，具有更好的重復(fù)性。

3.2 含量測(cè)定

3.2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜條件選擇中主要包括色譜柱和流動(dòng)相選擇，并主要參考文獻(xiàn)測(cè)定方法[13-18]，在試驗(yàn)中，對(duì)比了下列色譜條件的分離情況：色譜柱主要包括YWC-C18（4.6 mm 250 mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm 250 mm，5μm）和Ultimate-C18（4.6 mm 250 mm，5μm）；流動(dòng)相主要包括：乙腈：水（49:51）、乙腈：水（50:50）和乙腈：水（51:49）。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)上述3 種色譜柱分別與3 種不同比例乙腈:水流動(dòng)相組成不同的色譜條件，以分離度、色譜峰形狀、保留時(shí)間等相關(guān)因素進(jìn)行考察，最終以YWCC18（4.6 mm 250 mm，5μm）色譜柱與乙腈:水（50:50）組合，分離效果最好，故選擇為色譜條件。

3.2.2 參芪顆粒樣品溶液制備方法選擇 3 種溶劑被用于提取考察，結(jié)果表明，以乙醇、甲醇和80%甲醇為溶劑，超聲40 min獲得的參芪顆粒樣品中黃芪甲苷含量分別為0.493 6 mg/g、0.577 4 mg/g 和0.603 2 mg/g，樣品中黃芪甲苷含量最高的是80%甲醇；進(jìn)一步對(duì)超聲提取30 min 和超聲提取50 min 獲得供試品中黃芪甲苷含量進(jìn)行了考察，結(jié)果分別為0.552 2 mg/g 和0.603 6 mg/g，表明提取40min，黃芪甲苷可被完全提取。

3.2.3 耐用性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，參照上述測(cè)定條件，考察在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響程度。試驗(yàn)主要考察了不同品牌色譜柱、不同柱溫和不同流動(dòng)相配比等變動(dòng)因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

本試驗(yàn)選用YWC-C18、AgilentZORBAXSB-C18、Shimpack-C183 個(gè)不同品牌的色譜柱測(cè)得樣品中黃芪甲苷含量分別為：0.6001mg/g、0.6101 mg/g 和0.5984 mg/g；采用YWC-C18 色譜柱，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃條件下測(cè)得樣品中黃芪甲苷含量分別為：0.606 9 mg/g、0.600 1 mg/g 和0.596 3 mg/g；選擇乙腈—水（50:50）、乙腈—水（49:51）、乙腈—水（51:49）3 個(gè)比例流動(dòng)相測(cè)得黃芪甲苷含量分別為0.597 5 mg/g、0.593 7 mg/g 和0.582 7 mg/g。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，在色譜條件有微小變化時(shí)，樣品中黃芪甲苷含量無(wú)明顯變化，本方法耐用性良好。本研究通過(guò)薄層鑒別和高效液相方法建立參芪顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期為后續(xù)開(kāi)發(fā)新藥奠定基礎(chǔ)。