宋欣宏，尚禹東，初孟瑤，程立業(yè)，艾長山，陳長寶※，王恩鵬※

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.長春科技學(xué)院鹿茸科學(xué)與產(chǎn)品技術(shù)研究所，吉林 長春 130000）

燒燙傷是一種臨床上常見的疾病，一旦發(fā)生會給患者帶來極大的身心傷害，嚴(yán)重的威脅著人類的健康[1]。燙傷的損傷一般發(fā)生在體表，但反應(yīng)在全身，燙傷愈重，反應(yīng)愈烈[2]。燙傷會破壞皮膚天然屏障，導(dǎo)致血液循環(huán)障礙甚至喪失血液灌注，同時(shí)造成局部營養(yǎng)缺乏，全身免疫力下降，為細(xì)菌入侵提供便利條件[3]。創(chuàng)面感染發(fā)病急、進(jìn)展快，持續(xù)惡化可引起膿毒癥（Sepsis）、膿毒性休克（Septic shock）、多器官功能障礙綜合征（MODS），甚至死亡[4]。珍珠燒傷膏是一種治療燒燙傷的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，歷經(jīng)20 余年40 余萬例患者的應(yīng)用，具有良好的臨床療效和安全性，具備較好的開發(fā)價(jià)值和市場前景。珍珠燒傷膏具有祛腐排膿、修復(fù)組織、生肌斂口、增強(qiáng)免疫、清熱解毒、活血祛瘀和消腫止痛的功效[5，6]，方中有黃芩、當(dāng)歸、紫草、白芷、甘草和金銀花等藥味，諸藥相配，可以在燒燙傷治療過程中，起到輔助緩解疼痛的作用[7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network pharmacology）是基于大數(shù)據(jù)的分析平臺，通過篩選中藥中有效化合物成分，結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫中疾病的相關(guān)信息，篩選出藥物作用于疾病的靶點(diǎn)及機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，對藥物作用及機(jī)制的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，直觀反映藥物與疾病的關(guān)聯(lián)程度[8,9]，隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為中醫(yī)藥探索的有力工具[10,11]。分子對接是一項(xiàng)可以利用Auto-Dock 及PyMOL 等軟件來模擬配體和受體結(jié)合的技術(shù)，通過分析其結(jié)合能力的大小，從而對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證[12]。本研究主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測出珍珠燒傷膏輔助緩解疼痛的有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號通路，然后利用分子對接的方法進(jìn)行初步驗(yàn)證，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）；Uniport（https://www.uniprot.org/）；DrugBank（https://go.drugbank.com/）；GeneCards（https://www.genecards.org/）；STRING（https://cn.string-db.org/）；Metascape（https://metascape.org/）；Cytoscape 3.8.2；OpenBabel 3.1.1；AutoDock Tools 1.5.7；PyMOL 2.3.2。

1.2 珍珠燒傷膏活性成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以金銀花、黃芩、白芷、紫草、當(dāng)歸和甘草等為關(guān)鍵詞檢索化學(xué)成分，以藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（ADME）為依據(jù)[13]，由于珍珠燒傷膏為外用藥，因此，不將口服生物利用度列為篩選條件，僅將類藥性DL≥0.18 設(shè)為篩選條件，過濾獲得燒傷膏的止疼活性成分作為研究對象。

1.3 珍珠燒傷膏活性成分作用靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到1.2 中活性成分對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，將靶標(biāo)蛋白通過UniProt 數(shù)據(jù)庫檢索查詢其對應(yīng)的基因名稱。

1.4 珍珠燒傷膏輔助緩解疼痛的潛在靶點(diǎn)預(yù)測

在DrugBank 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫輸入“pain”[14]檢索獲得疼痛的作用靶點(diǎn)。使用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/）云平臺中的維恩圖軟件將藥物預(yù)測的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得珍珠燒傷膏輔助緩解疼痛的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建“藥物－活性成分－靶點(diǎn)基因－疾病”網(wǎng)絡(luò)

將中藥材、活性成分及1.4 項(xiàng)下所得的疼痛潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建“藥物－活性成分－靶點(diǎn)基因－疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)，采用“Network analyzer”插件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.4 項(xiàng)下潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，勾選multiple proteins，物種選擇Homo sapines，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）關(guān)系圖。另外將得到的數(shù)據(jù)用tsv 的格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，運(yùn)用Cytoscape 軟件中CytoNVA插件的betweenness功能，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的介數(shù)中心性。

1.7 生物通路富集分析

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org）對1.4 中獲得的共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）功能富集分析，包括生物過程（Biological process,BP）、細(xì)胞組成（Cell composition,CC）、分子功能（Molecular function,MF），各篩選前10 條重要通路，用微生信在線網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com）繪制柱狀圖。同樣在該數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析，設(shè)置P-value ＜0.01，篩選前20 條重要通路制作氣泡圖。最后將上述得到的靶點(diǎn)、通路導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2，得到靶點(diǎn)－通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 核心活性成分 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)分子對接

從PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲取1.5 中篩選出來的核心活性成分的三維結(jié)構(gòu)并保存為SDF 文件，用Open-Babel 3.1.1 將核心活性成分轉(zhuǎn)化為PDB 文件，再由AutoDock Tools 1.5.7 轉(zhuǎn)化為PDBQT文件；另從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫中獲取從1.6 中篩選出來的關(guān)鍵靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)并保存為PDB 文件，用PyMOL 2.3.2 軟件去除關(guān)鍵靶蛋白晶體中的水分子并加極性氫，去除活性中心的原配體，將處理后的關(guān)鍵靶蛋白保存為PDB 文件，再通過AutoDock Tools 1.5.7 軟件轉(zhuǎn)化為PDBQT 文件，通過AutoDock Tools 1.5.7 軟件對處理完的核心活性成分和關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行對接模擬，最后利用PyMOL 2.3.2 軟件作出分子對接圖，以直觀展示分子對接的結(jié)合模式。

2 結(jié)果

2.1 珍珠燒傷膏活性成分的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，設(shè)定DL≥0.18，篩選出符合條件的化合物，檢索到黃芩有效成分36 個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，金銀花23 個(gè)，紫草12 個(gè)，白芷22 個(gè)，甘草92 個(gè)，篩選去除共有成分，共計(jì)156 個(gè)（表1）。

表1 珍珠燒傷膏化合物基本信息Table 1 Compounds basic information of Zhenzhu Burn Ointment

2.2 珍珠燒傷膏活性成分作用靶點(diǎn)

通過UniProt 數(shù)據(jù)庫檢索到黃芩潛在作用靶點(diǎn)92個(gè)，當(dāng)歸潛在作用靶點(diǎn)40 個(gè)，金銀花潛在作用靶點(diǎn)174個(gè)，紫草潛在作用靶點(diǎn)13 個(gè)，白芷潛在作用靶點(diǎn)44 個(gè)，甘草潛在作用靶點(diǎn)191個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共計(jì)245個(gè)。

2.3 珍珠燒傷膏輔助緩解疼痛的潛在靶點(diǎn)

通過DrugBank 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫輸入“pain”檢索、篩查并整合后獲得疼痛的作用靶點(diǎn)1 667個(gè)。使用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/）云平臺中的維恩圖軟件將珍珠燒傷膏預(yù)測的靶點(diǎn)與疼痛的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得珍珠燒傷膏輔助緩解疼痛的潛在作用靶點(diǎn)149 個(gè)（圖1）。

圖1 珍珠燒傷膏緩解疼痛潛在靶點(diǎn)維恩圖Fig.1 Venn diagram of a potential target for pain relief from Zhenzhu Burn Ointment

2.4 “藥物－活性成分－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型及分析

采用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“藥物－活性成分靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)共有407 個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括245 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，162 個(gè)活性化合物節(jié)點(diǎn)（包括中藥名稱），共有2143 條邊（每條邊代表活性化合物與靶點(diǎn)基因之間的相互作用關(guān)系）?！罢呅巍北硎舅幬锏幕钚曰衔锕?jié)點(diǎn)，“菱形”為靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，“正方形”表示中藥材名稱，由圖2 可見，珍珠燒傷膏中各藥物之間存在各種相互作用關(guān)系，同一成分對應(yīng)不同的靶點(diǎn)，不同成分也可對應(yīng)同一靶點(diǎn)，形成復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)，也充分體現(xiàn)了珍珠燒傷膏緩解疼痛的多成分、多靶點(diǎn)治療機(jī)制。

圖2 “藥物－活性成分－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 “Drugs Ingredients Targets”network

2.5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將珍珠燒傷膏緩解疼痛的149 個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種限定為“Homo sapiens”，得到潛在作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3）保存其TSV 格式文件。將文件中的node1，node2，combined score 信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行Network Analyze分析，網(wǎng)絡(luò)中共包含148 個(gè)節(jié)點(diǎn)（節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)），3 075 條邊（邊代表靶點(diǎn)之間的相互作用），一個(gè)有更高介數(shù)中心性的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中有更強(qiáng)的控制能力。運(yùn)用Cytoscape 軟件中的CytoNVA 插件的betweenness 功能計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的介數(shù)中心性，圖中節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，則表明度值越大，依次排序?yàn)镮L6、AKT1、TNF、ESR1、CAV1、SLC6A4、MMP9、IL1B、TP53 和CTNNB1 等。

圖3 珍珠燒傷膏蛋白－蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network of Zhenzhu Burn Ointment

2.6 GO功能富集和KEGG通路分析

將以上靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫，共得到GO富集條目331 個(gè)，其中生物過程（BP）238 個(gè)，分子功能（MF）57 個(gè)，細(xì)胞組分（CC）36 個(gè)。BP方面與疼痛相關(guān)的生物過程有22 條，選取BP 與疼痛相關(guān)的10 個(gè)條目、MF 與CC 排名A 前10 位的條目，分別繪制條形圖（圖4）。BP 主要富集在無機(jī)物質(zhì)反應(yīng)、細(xì)胞對氮化合物反應(yīng)和對異種刺激的反應(yīng)等；MF 主要富集在激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、氧化還原酶活性和－蛋白質(zhì)同源二聚活性等；CC 主要涉及膜筏、囊泡腔、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合物、受體復(fù)合物和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等。KEGG通路分析結(jié)果，共得到信號通路200 條，其中，與疼痛密切相關(guān)的通路有20 條（圖5）。

圖4 GO 分析生物過程、分子功能和細(xì)胞組成情況Fig.4 GO analysis of the biological process,molecular function and cellular composition

圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

2.7 “活性成分－重要靶點(diǎn)－關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建

基于以上結(jié)果，獲得藥物的活性成分、重要靶點(diǎn)和關(guān)鍵通路，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建“活性成分重要靶點(diǎn)－關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)模型，進(jìn)行Network Analyze分析，見圖6。該網(wǎng)絡(luò)共有274 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 509 條邊，平均度值是11.01。圖6 中節(jié)點(diǎn)越大表明度值越大，大于平均度值的活性成分有21 個(gè)，分別是槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、山柰酚和黃芩素等；靶點(diǎn)有27 個(gè)，分別是MAPK14、KDR、AKT1、TP53 和CCND1 等；信號通路有11 條，分別是癌癥相關(guān)通路、PI3K-Akt信號通路和Hepatitis C 信號通路等。

圖6 “活性成分－重要靶點(diǎn)－關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Ingredient-Target-Key pathway network

2.8 分子對接

將2.7 網(wǎng)絡(luò)中度值最大的活性成分槲皮素、木犀草素分別與PPI 網(wǎng)絡(luò)中確定的4 個(gè)關(guān)鍵靶蛋白IL6、AKT1、TNF 和TP53 進(jìn)行分子對接分析，這些小分子化合物通過氫鍵結(jié)合到目標(biāo)蛋白上，這是一種靜電相互作用，見圖7 和表2。結(jié)果顯示，槲皮素與木犀草素與4 個(gè)關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合活性均小于 20.94 kJ/mol，表明它們之間具有潛在的結(jié)合活性。

圖7 分子對接圖Fig.7 Molecular docking maps

表2 關(guān)鍵活性分子與靶點(diǎn)對接表Table 2 Docking of key active molecules and targets

3 討論

為了進(jìn)一步研究與探討珍珠燒傷膏輔助緩解疼痛的藥效基礎(chǔ)和潛在的生物學(xué)機(jī)制，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出藥效靶點(diǎn)，并與疾病靶點(diǎn)結(jié)合構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用基因靶點(diǎn)富集分析及通路預(yù)測等手段得到槲皮素、木犀草素、漢黃芩素和山柰酚等核心活性成分。槲皮素（Quercetin）能作用于信號通路相關(guān)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素是廣泛的激酶抑制劑，可作用于許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如PI3K/Akt/PKB通路，酪氨酸激酶、蛋白激酶C（PKC）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路[16]。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，具有抗炎、抑菌、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性[18]。漢黃芩素有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，漢黃芩素還能促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的凋亡，聯(lián)合應(yīng)用NF-κB 特異性抑制劑或轉(zhuǎn)錄、蛋白合成抑制劑（如放線菌素D 和放線菌酮）可增強(qiáng)TNF-α對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。山柰酚（Kaempferol）可以抑制皮膚纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷來改善皮膚細(xì)胞的纖維化[15]。

PPI 分析結(jié)果顯示，珍珠燒傷膏可能是通過IL6、AKT1、TNF 和TP53 等關(guān)鍵蛋白質(zhì)靶點(diǎn)來輔助緩解疼痛。其中蛋白激酶1（Kinase 1，AKT1）是3 種蛋白激酶之一，參與多個(gè)炎癥、免疫、代謝和細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路[17]。AKT蛋白在大多數(shù)癌癥類型中都高度表達(dá)，包括HCC、肺癌、乳腺癌以及結(jié)腸癌，其中AKT1是治療癌癥的主要藥物靶點(diǎn)，在細(xì)胞增殖和抗凋亡的過程中發(fā)揮作用。IL6 是機(jī)體炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，促進(jìn)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致皮膚表面膿瘡腫痛。目前，已知TNF家族中有約30 種生物活性因子，TNF-α與異位內(nèi)膜的凋亡、基因表達(dá)、酶的活性以及激素和細(xì)胞因子的作用均是細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)，所以TNF 可以促進(jìn)皮膚細(xì)胞去腐生肌，進(jìn)而緩解疼痛。

KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，珍珠燒傷膏主要通過調(diào)控癌癥信號通路（Pathways in cancer）、炎癥信號通路（TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway）和細(xì)胞增殖信號通路（MAPK signaling pathway）等發(fā)揮其緩解疼痛的作用。PI3K-Akt 信號通路能夠調(diào)控萎縮性細(xì)胞的損傷程度，當(dāng)PI3K 激活后，在細(xì)胞質(zhì)膜上產(chǎn)生磷脂酰肌醇三磷酸酯，該蛋白與信號蛋白Akt 和磷酸肌醇依賴性激酶1 結(jié)合，后者在細(xì)胞中含有PH結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致Akt 激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[19]。MAPK 信號通路絲裂活化蛋白酶是一種絲氨酸蛋白激酶，是MAPK 信號通路的樞紐。MAPK 信號通路能將細(xì)胞外信號傳導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，參與不同細(xì)胞功能的調(diào)控，調(diào)控細(xì)胞增殖、代謝及黏附等過程[20]。以上通路均能促進(jìn)細(xì)胞再生修復(fù)，進(jìn)而緩解疼痛。

綜上所述，珍珠燒傷膏可以通過槲皮素、木犀草素、漢黃芩素和山柰酚等核心活性成分，作用于IL6、AKT1、TNF 和TP53 等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)PI3K-Akt 和MAPK等信號通路來輔助緩解疼痛。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對珍珠燒傷膏輔助緩解疼痛進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)了其潛在的作用靶點(diǎn)，闡明了珍珠燒傷膏活性成分、靶點(diǎn)和通路之間相互作用的關(guān)系，可為下一步驗(yàn)證珍珠燒傷膏對于以上預(yù)測關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號通路影響提供理論依據(jù)，為明確其臨床作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。