劉靜璇，戴玲玲，譚松，趙嘯虎，侯愛畫※

（1.山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，山東 濟南 250014；2.煙臺市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，山東 煙臺 264001）

結直腸癌（Colorectal cancer,CRC）是世界第三大癌種，在常見癌癥死亡原因中，結直腸癌升至第2 位。2020 年，我國CRC 新增患者達55.5 萬，在惡性腫瘤中占第3 位[1]。流行病學提示，過去三十年內(nèi)，全球大部分地區(qū)CRC 疾病發(fā)病率、死亡率和早發(fā)率大幅增高[2]。據(jù)估計，至2040 年全球結腸癌和直腸癌新增病例將分別達到192 萬和116 萬[3]。目前，CRC 治療方式涉及手術、輔助放化療和靶向治療等，但其治療伴隨的毒副作用及生活質(zhì)量下降等問題仍不可忽視[4]。

中醫(yī)藥抗腫瘤效果已在臨床中得到證實，此外中藥涉及多靶點和多信號途徑的抗腫瘤機制。中醫(yī)無“結直腸癌”之病名，其對該病的論述散見于“積聚”、“腸蕈”、“臟毒”、“下痢”、“便血”和“鎖肛痔”等。中醫(yī)認為CRC 內(nèi)因以正氣虛損為主，外因為邪毒入侵；病機為本虛標實，正虛以脾虛為代表，以“痰濕瘀毒”為標[5]。根據(jù)以上病因病機認識及臨床經(jīng)驗，煙臺市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科以“健脾化痰，清熱解毒袪瘀”為治療CRC 基本治則，擬定益腸散結湯（黨參，白術，茯苓，女貞子，浙貝母，山慈菇，露蜂房，北豆根，郁金，枳殼，蛇莓和藤梨根）。前期臨床研究表明，益腸散結湯具有改善CRC患者癥狀，降低腫瘤標志物水平，減輕化療毒副反應和提高生活質(zhì)量的作用[6]。

網(wǎng)絡藥理學基于生物網(wǎng)絡，分析藥物靶點，探究成分靶點－疾病網(wǎng)絡之間的機制，揭示復雜疾病與中藥配方之間的生物學基礎[7]。本研究基于以上技術，初步研究益腸散結湯潛在治療CRC 的作用機制，為進一步臨床和試驗研究拓展思路。

1 材料與方法

1.1 篩選益腸散結湯活性成分及其靶點

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）輸入各中藥名檢索，篩選條件為口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%、類藥性（drug likeness,DL）≥0.18。TCMSP 數(shù)據(jù)庫未收錄成分，則使用Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/）補充。TCMSP 獲取活性成分相關治療靶點蛋白數(shù)據(jù)，缺少靶點數(shù)據(jù)的成分則使用Swiss Target Prediction網(wǎng)站（http://swisstargetprediction.ch/）補充治療靶點，靶點篩選標準為置信度（Probabilty）=1。

1.2 獲取CRC疾病靶點

在Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com ）、Therapeutic Target Database 數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.org/ttd/）與Gene Cards 數(shù)據(jù)庫（https://genecards.org/），以“colorectal cancer”、“colorectal carcinoma”和“colon cancer”為關鍵詞檢索，獲取CRC 相關疾病靶點。

1.3 構建中藥－成分－靶點－疾病網(wǎng)絡

將CRC 靶點、益腸散結湯靶點導入Venny2.1，取交集靶點。中藥、成分與各靶點創(chuàng)建網(wǎng)絡映射，Cytoscape 3.7.1 軟件用于可視化“結直腸癌－益腸散結湯靶點網(wǎng)絡圖”。

1.4 構建靶蛋白相互作用網(wǎng)絡

利用STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），篩選標準為置信度（Medium confidence）=0.700，獲取交集靶點的蛋白互作（Protein-protein interaction,PPI）數(shù)據(jù)，使用Cytoscape 3.7.1 軟件可視化PPI 網(wǎng)絡圖，使用度值（Degree）確定PPI 網(wǎng)絡的核心節(jié)點。

1.5 GO功能與KEGG通路富集分析

運行R 3.6.2 的“cluster Profiler”包，設置篩選標準為FDR 法校正P ＜0.05，對交集靶點作基因本體論（Gene ontology,GO）和京都基因及基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析，結果使用氣泡圖顯示。

1.6 分子對接

在AutoDock 軟件內(nèi)導入木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、柚皮素和槲皮素共6 個小分子活性成分及TNF、EGFR、TP53 和IL6 共4 個核心靶點結構文件，通過Autogrid、AutoDock 程序（設置半柔性對接），使用Lamarckian GA 算法后進行對接，exhaustiveness 設為8，輸出的最大構象數(shù)設為9，統(tǒng)計對接結合能情況，并使用PyMOL 軟件可視化。

2 結果

2.1 益腸散結湯活性成分及其靶點的篩選結果

使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫，Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫查詢并補充“黨參”、“白術”、“茯苓”、“女貞子”、“浙貝母”、“山慈菇”、“露蜂房”、“北豆根”、“郁金”、“枳殼”、“蛇莓”和“藤梨根”成分，整理篩選后，獲取76 個具有靶點的活性成分（表1），其對應靶點共188 個。

表1 益腸散結湯活性成分表Table 1 Table of active components in Yichang Sanjie decoction

2.2 CRC靶點獲取與交集靶點結果

檢索“Genecards”、“Drugbank”和“Therapeutic Target Database”數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點并去重，獲取11 853 個疾病靶點。將藥物、疾病靶點導入Venny 2.1在線工具，獲取交集靶點153 個，見圖1。

圖1 益腸散結湯與CRC 交集基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Yichang Sanjie decoction and colorectal cancer intersection gene

2.3 網(wǎng)絡可視化

通過Cytoscape 3.7.1 軟件，構建圖2，圖中矩陣為靶點，綠色菱形為中藥，其余節(jié)點為藥物成分，節(jié)點共有276 個，連線共有1 219 條。活性成分中度值前10位的分別為槲皮素（A7）、β-谷甾醇（A3）、光千金藤定堿（BDG8）、碎葉紫堇堿（BDG4）、豆甾醇（A2）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（DS4）、木犀草素（A1）、光千金藤堿（BDG7）、常春藤皂苷元（FL9）和柚皮素（A6）。

圖2 結直腸癌－益腸散結湯靶點網(wǎng)絡圖Fig.2 Colorectal cancer-Yichang Sanjie decoction-target network diagram

2.4 PPI網(wǎng)絡構建和核心蛋白篩選結果

PPI 網(wǎng)絡（圖3）提示，存在131 個節(jié)點，547 條連線，節(jié)點度值均值為8.35，圖譜使用節(jié)點大小和顏色深度表示度值差異。圖4 結果顯示，度值排序前15 的靶點，分別是轉(zhuǎn)錄因子JUN（TranscriptionfactorJun,JUN），編碼p53 蛋白（Tumor Protein P53,TP53），表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor,EGFR），白介素6（Interleukin 6,IL6），腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor,TNF），促分裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated protein kinase3,MAPK3），白介素-1β（Interleukin-1 beta,IL1B），雌激素受體（Estrogen receptor,ESR1），促分裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1），血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA），環(huán)氧合酶2（Prostaglandin-endoperoxidase synthase 2,PTGS2），基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP9），促分裂原活化蛋白激酶8（Mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8），促分裂原活化蛋白激酶14（Mitogen-activated protein kinase14,MAPK14），表皮生長因子（Epidermal growth factor,EGF），見圖4。

圖3 共同靶點蛋白互作圖Fig.3 Protein-protein interaction network mapping of mutual targets

圖4 度值前15 位靶點Fig.4 The top 15 targets

2.5 GO功能與KEGG通路富集分析

利用R3.6.2 軟件“cluster Profiler”包進行分析，圖5 中以氣泡圖展示，其中-lgP值越大氣泡顏色越紅，數(shù)目即為富集基因數(shù)目，基因比率為該途徑富集基因數(shù)占總基因數(shù)比率。GO 功能結果涉及2 244 條生物過程，126 條細胞組成、203 條分子功能，KEGG 結果涉及171 條通路。圖5 顯示各功能的前5 位富集結果與篩選得到的密切相關通路5 條。

圖5 GO 功能與KEGG 通路富集分析Fig.5 The enrichment analysis of GO function and KEGG pathway

2.7 分子對接結果

選取槲皮素、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚和柚皮素共6個小分子活性成分及TNF、EGFR、TP53、IL6 共4 個核心靶點進行分子對接，進一步探究其作用效果。對接靶點與分子的具體對接信息，見表2。結合能排名前5 位的是TNF 與β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素、山柰酚和豆甾醇。分子對接分析得到：β-谷甾醇與TNF A 鏈的Q102 和R103，C 鏈的Q102 和E104存在疏水作用；木犀草素與TNF A 鏈的氨基酸殘基E116、B 鏈的Q102、C 鏈E104 形成3 條氫鍵，與A鏈Q102 存在疏水作用；槲皮素與TNF A 鏈的氨基酸殘基P100 和Q102，B 鏈的K98 和S99、C 鏈E104形成6 條氫鍵，與B 鏈Q102 存在疏水作用；山柰酚與TNF A 鏈的氨基酸殘基S99，B 鏈的Q102、C 鏈P100 和E116 形成5 條氫鍵，與A 鏈的Q102，C 鏈的Q102，B 鏈的E104 存在疏水作用；豆甾醇與TNF A 鏈Q102，B 鏈的Q102、R103 和E104，C 鏈的Q102、E104，存在疏水作用，見圖6。

圖6 分子對接圖Fig.6 Molecular docking diagrams

表2 分子對接信息表Table 2 Molecular docking information table

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡藥理學技術對益腸散結湯的多種中藥成分及其潛在作用靶點與通路進行分析，獲取高度值成分、靶點及密切相關信號通路。結果顯示槲皮素、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇和常春藤皂苷元等成分，TP53、EGFR、TNF、ESR1、VEGFA、PTGS2 和EGF等靶點，IL-17信號通路，腫瘤壞死因子信號通路，Th17細胞分化通路，HIF-1 信號通路等可能與益腸散結湯治療CRC 的機制相關。

槲皮素、木犀草素和柚皮素是黃酮類化合物，其中槲皮素通過阻斷Akt-CSN6-Myc信號軸活性抑制HT-29人結腸癌細胞凋亡[8,9]。槲皮素亦能作用于內(nèi)源性大麻素受體（Endocannabinoids receptor,CB1-R）抑制Caco2與DLD-1 兩種人結直腸癌細胞系的增殖[10]。此外Lin等[11]研究表明，槲皮素可通過抑制基因組穩(wěn)定性調(diào)控核心激酶（Ataxia-telangiectasia mutated kinase,ATM kinase）活性，增強人結直腸癌DLD-1 細胞裸鼠移植瘤模型對放療的敏感性。Krifa 等[12]研究表明，木犀草素通過觸發(fā)多聚ADP 核糖聚合酶（Poly-ADP-ribose polymerase,PARP）分裂，誘導BE 人結直腸癌細胞凋亡，并上調(diào)腫瘤抑制基因p16 表達。此外Yoo 等[13]研究表明，木犀草素通過p53 依賴性途徑誘導HCT116人結腸癌細胞自噬與凋亡。柚皮素阻滯SW1116 和SW837 兩種人結直腸癌細胞的細胞周期，并上調(diào)其促凋亡基因，下調(diào)抗凋亡基因及促生存信號通路的表達[14]。Wang 等[15]研究表明，β-谷甾醇通過抑制乳腺癌耐藥蛋白（Breast cancer resistance protein,BCRP）的表達，恢復奧沙利鉑對耐藥HCT161 細胞的敏感性，此外在該耐藥細胞系移植瘤小鼠模型中，β-谷甾醇可協(xié)同奧沙利鉑抑瘤。常春藤皂苷元能破壞線粒體膜電位，從而誘導LoVo 人結直腸癌細胞凋亡[16]。

TP53，亦稱p53，是一種重要的抑癌基因，能接收癌癥相關的應激信號，包括高ROS 水平、DNA 損傷、癌基因激活、端?？s短和缺氧等，促使腫瘤細胞死亡、衰老或分化，從而預防腫瘤發(fā)展[17]。EGFR 是EGF 的受體，其功能涉及細胞增殖、分化和存活，而EGFR 靶向治療在多瘤種治療中已廣泛應用[18,19]。EGFR 是CRC 患者常見突變類型，EGFR 的單克隆抗體西妥昔單抗與帕尼單抗，可以延長10%～20%復發(fā)轉(zhuǎn)移CRC患者的生存期[20]。Nagasaki 等[21]研究表明，結腸癌基質(zhì)成纖維細胞可增強IL6 產(chǎn)生，以增強成纖維細胞VEGF 產(chǎn)生，從而誘導腫瘤血管生成。TNF-α是TNF家族的重要成員，涉及多種細胞途徑，包括細胞增殖、分化和死亡，參與腫瘤的局部血管侵襲以及腫瘤血管系統(tǒng)的破壞[22]。Hader 等[23]研究表明，早期CRC 患者淋巴結ESR1 啟動子的甲基化可能作為CRC 局部復發(fā)的標志物。Liu 等[24]發(fā)現(xiàn)m6A 甲基化的上皮細胞激酶（Ephrin type-A receptor 2,EphA2）與VEGFA 可通過胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白2/3（Nsulinlike growth factor 2 mRNA-binding protein 2/3,IGF2BP2/3）調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 和ERK1/2 信號通路，促進CRC中血管生成擬態(tài)的形成。PTGS2 普遍由發(fā)揮屏障功能的腫瘤相關成纖維細胞表達，其有利于抗腫瘤M1 巨噬細胞群發(fā)揮作用。Vene 等[25]研究表明，腫瘤基質(zhì)細胞中PTGS2 的表達可以對結直腸癌患者總生存率具有保護作用。

IL-17 信號通路中IL17A 可促進CRC 細胞表達VEGF 促進血管生成[26]。TNF 信號通路已被證實與CRC 細胞的遷移和侵襲密切相關，其中TNF-α可通過ERK1/2 信號通路上調(diào)腫瘤相關鈣信號轉(zhuǎn)導蛋白2（Tumor-associated calcium signal transduction protein-2,TROP-2），顯著增強了結腸癌細胞的遷移和侵襲。另一項研究提示TNF-α可激活JNK信號通路誘導HCT116細胞DNA 損傷[27,28]。此外IL-17 與TNF-α亦分別可單獨激活NF-κB 和ERK1/2 信號，以上調(diào)PD-L1 在人結直腸癌HCT116 細胞中的表達[29]。Th17 細胞是能分泌IL-17 的T 細胞亞群，TGF-信號轉(zhuǎn)導促進Th17 細胞產(chǎn)生IL-22，從而促進CRC 發(fā)展[30]。Garzon等[31]研究表明，腫瘤細胞內(nèi)源性HIF-1α可誘導異常血管生成并與TRAF6 信號通路相互作用，對CRC 的發(fā)生產(chǎn)生影響，此外Dong 等[32]經(jīng)體內(nèi)、外試驗研究，提示HIF-1α誘導的代謝重編程是由ROS/PI3K/Akt 與Wnt/β-catenin 信號通路激活，以導致CRC 對5-氟尿嘧啶的耐藥。

4 結論

綜上所述，本文基于中藥數(shù)據(jù)庫相關數(shù)據(jù)，通過網(wǎng)絡藥理學分析，分子對接初步驗證與文獻回顧，初步證實槲皮素、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、柚皮素與TP53、TNF、IL6、EGFR 可能在益腸散結湯治療CRC 中具有重要作用，IL-17 信號通路、TNF 信號通路等通路為潛在作用通路，益腸散結湯多成分、多靶點、多通路治療結直腸癌的作用機理。但網(wǎng)絡藥理學方法亦存在局限性，其結果后續(xù)需通過藥理試驗進行驗證。