張玲，何運轉(zhuǎn)，孫占勤，李新暢，李海燕，張瑩瑩

（1.河北省承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北 承德 067000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，河北 保定 071000；3.圍場滿族蒙古族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局植保植檢站，河北 承德 068450）

茶作為中國的傳統(tǒng)飲品之一，具有悠久的歷史文化和傳統(tǒng)文化。而別樣茶是指不屬于山茶科來源的但廣泛應(yīng)用于民間作茶飲的植物[1]。其中傳統(tǒng)中藥黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）其地上部分的莖、葉在我國北方各省及云南部分地區(qū)一直作為代茶飲用，具有清熱燥濕，瀉火解毒，消炎等作用，又稱為黃芩茶、黃金茶[2]。河北承德是道地黃芩主產(chǎn)區(qū)之一，有“熱河黃芩”之美稱。黃芩白粉病是黃芩生產(chǎn)常見病害之一，關(guān)于黃芩白粉病病原的研究，在90 年代初韓金聲等[3]報道了二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC.）。張海燕等[4]2010 年鑒定為蓼白粉菌（Erysiphe polygoni DC）。病害在黃芩成株期發(fā)生，主要侵害葉片，亦可為害果莢，嚴(yán)重時葉片干枯，對黃芩的質(zhì)量和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。目前，生產(chǎn)上仍以化學(xué)防控為主，對黃芩茶產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)造成一定威脅。因此探究環(huán)保、經(jīng)濟、安全的生物防治技術(shù)尤為重要。

目前，利用微生物及其代謝物防治植物病害已成為研究熱點，但關(guān)于黃芩莖葉的研究主要集中在毒理學(xué)、藥理活性成分及作用機制、代謝生物學(xué)、提取工藝等方面[5-9,10]，少量研究涉及到莖葉部分病害的化學(xué)藥劑篩選方面[11,12]，未見黃芩葉部病害生物防治相關(guān)研究。本試驗以黃芩葉部病害黃芩白粉病為研究對象，以黃芩中黃酮類成分為測定對象，比較3 種生物制劑對黃芩白粉病的防治效果及對葉部總黃酮類和黃芩苷藥用成分含量的影響，以期為黃芩白粉病生物防控技術(shù)及黃芩資源的合理安全利用提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 試驗材料及處理方法

供試作物為三年生道地黃芩，種子由承德市農(nóng)林科學(xué)院藥用動植物研究所提供。試驗地在承德市隆化縣中關(guān)鎮(zhèn)大鋪村承德市農(nóng)林科學(xué)院科創(chuàng)基地進行。該地屬于承德北部較溫涼型農(nóng)業(yè)氣候區(qū)，平均海拔600～800 m，年平均氣溫4～8 ℃，年平均降水量450～600 mm，全年無霜期140 d 左右，≥10 ℃的有效積溫2 000～3 200℃。試驗地沙壤土，地勢平坦，肥力中等。黃芩白粉病田間自然發(fā)病，白粉菌病原經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和生工生物工程（上海）有限公司測序后鑒定為二孢白粉菌，田間常規(guī)管理，不施用其他殺菌劑。

1.2 試驗試劑

0.5 %幾丁聚糖水劑（成都特普生物科技有限公司）；1 億cfu/g 枯草芽孢桿菌微囊粒劑（成都特普生物科技有限公司）；10 億個/mL（枯草芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌）懸浮劑（云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司）；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒（先正達(dá)南通作物保護有限公司）。乙醇（優(yōu)級純，天津科密歐）；乙腈（HPLC 純，美國Fisher 公司）；甲酸（LCMS 級，美國Anaqua Chemicals Supply 公司）；水（一級水，過Millipore 公司的Milli-Q Direct 8 過濾器）。

1.3 試驗儀器

LC-20ADXR型高效液相色譜儀（Shimadzu公司，Japan），配有二極管陣列檢測器；SB25-12DTD 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司，China）；Milli-Q Direct 8 實驗室純水系統(tǒng)（Millipore 公司，USA）；T3 色譜柱（美國Waters Atlantis?T3，250 mm 4.6 mm，5μm）；0.22μm 有機系針頭過濾器（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司，China）。

2 試驗方法

2.1 田間藥效試驗

試驗采用隨機區(qū)組排列，每個小區(qū)面積20 m2，小區(qū)之間設(shè)保護行，3 次重復(fù)，黃芩白粉病田間自然發(fā)病。設(shè)5 個處理（藥劑濃度按推薦劑量設(shè)定）。分別是處理1 為10 億個/mL 解淀粉芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌懸浮劑300 倍液；處理2 為1 億cfu/g 枯草芽孢桿菌微囊粒劑500 倍液；處理3 為0.5%幾丁聚糖水劑500 倍液；處理4 為發(fā)病葉片（僅噴施清水），處理5 為10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑。常規(guī)噴霧，噴藥間隔為4d，共噴施2 次，試驗期間不施用其他藥劑。

在噴藥前、噴藥間隔期后進行白粉病病情調(diào)查。各小區(qū)隨機調(diào)查3 點，每點調(diào)查5 株。每株選取東、南、西、北4 個方向上3 個分枝，每分枝自頂端向下選取10 片復(fù)葉，共計120 片復(fù)葉，于第1 次調(diào)查后標(biāo)記所選定的分枝，第2 次繼續(xù)調(diào)查。參照周天旺等[13]的方法，根據(jù)病斑面積占葉片比率進行分級。0 級：無病斑；1 級：病斑面積占整葉面積5%及以下；3 級：病斑面積占整葉面積6%～10%；5 級：病斑面積占整葉面積11%～25%；7 級：病斑面積占整葉面積26%～50%；9級：病斑面積占整葉面積50%以上。計算病情指數(shù)和防效，采用Excel、DPS 軟件分析數(shù)據(jù)，采用鄧肯氏新復(fù)極差法（SSR）分析處理間差異顯著性。

式中：CK0為空白對照區(qū)施藥前病情指數(shù)，CK1為空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)，PT0為藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù)，PT1為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

2.2 葉片中黃酮類成分的變化

2.2.1 試驗設(shè)計及材料 試驗采用隨機區(qū)組排列，每個小區(qū)面積20 m2，小區(qū)之間設(shè)保護行，3 次重復(fù)，黃芩白粉病田間自然發(fā)病。設(shè)5 個處理（藥劑濃度按推薦劑量設(shè)定）。分別是處理1 為10 億個/mL 解淀粉芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌懸浮劑300 倍液；處理2 為1 億cfu/g枯草芽孢桿菌微囊粒劑500 倍液；處理3 為0.5%幾丁聚糖水劑500 倍液；處理4 為發(fā)病葉片（僅噴施清水）；處理5 為未發(fā)病葉片（清水處理）。常規(guī)噴霧，噴藥間隔為4 d，共噴施2 次。第2 次噴施制劑后第7 天自頂端完全展開復(fù)葉開始向下采集葉片，常溫陰干，備用。

2.2.2 色譜條件 采用Waters Atlantis?T3（250 mm 4.6 mm,5μL。在該色譜條件下，樣品和對照品中4 個黃酮類成分色譜峰均得到較好的分離，分離度＞1.5?；旌瞎┰嚻啡芤汉蛯φ掌啡芤荷V圖，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖譜Fig.1 Chromatogram of HPLC

圖2 黃芩白粉病田間癥狀表現(xiàn)Fig.2 Field symptoms of powdery mildew

2.2.3 供試品溶液的制備 將已烘干的黃芩樣品用粉碎機粉碎，過100 目篩，精密稱取0.2 g，置于50 mL的離心管中，加入70%乙醇25 mL，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），9 000 r/min 離心10 min 后上清液倒入50 mL 容量瓶中，殘渣再用70%乙醇20 mL，精密稱定，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），9 000 r/min 離心10 min 后上清液合并到50 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容，混勻后取上清液用0.22μm有機濾膜濾過到2 mL 進樣瓶，待液相色譜測定。

2.2.4 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素，10 mg左右，分別用甲醇溶解并配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。依次吸取黃芩苷，漢黃芩苷，黃芩素，漢黃芩素標(biāo)準(zhǔn)貯備液各1 mL 都放置于50 mL 容量瓶中用甲醇定容，即得標(biāo)準(zhǔn)使用液，待液相色譜測定。并參照《中華人民共和國藥典》要求進行了系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。

3 結(jié)果分析

3.1 黃芩白粉病田間癥狀表現(xiàn)

根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果，黃芩白粉病主要危害葉片和果莢。黃芩葉片正反兩面均可發(fā)生白粉病，植株下部葉片最開始發(fā)病，發(fā)病初期葉片兩面出現(xiàn)白色粉狀圓斑，圓斑逐漸擴大，匯合成邊緣不明顯的大片白粉區(qū)，上面布滿白色粉狀物，嚴(yán)重時覆蓋整個葉面，為病原菌的無性世代時期。進入9 月白粉層變?yōu)榛野咨蹖又谐跻婇冱S色小顆粒，后變黑色，為病菌有性世代的閉囊殼。被病菌侵染的植株葉色發(fā)黃，焦枯至脫落，嚴(yán)重時全株枯死。

3.2 生物制劑對黃芩白粉病田間防效測定

由表1 可見，3 種生物制劑對黃芩白粉病均有良好的防治效果。第1 次噴藥前，各處理病情指數(shù)在14～24 之間，第1 次用藥后，各處理病情指數(shù)在8～10之間，10 億個/mL（枯草芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌）懸浮劑、1 億cfu/g 枯草芽孢桿菌微膠囊粒劑防效均達(dá)60%以上，0.5%幾丁聚糖水劑防效為54.4%，均低于化學(xué)藥劑對照組10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑防效81.21%。3 個生物制劑處理之間的防治效果差異均顯著，且與化學(xué)藥劑對照組差異極顯著。10 億個/mL（枯草芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌）懸浮劑防治效果與其他兩種生物制劑相比，差異極顯著。

表1 3 種生物制劑對黃芩白粉病田間防治效果Table 1 Effect of three biological agents against powdery mildew in the field

表1 3 種生物制劑對黃芩白粉病田間防治效果Table 1 Effect of three biological agents against powdery mildew in the field

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P ＜0.05），不同大寫字母代表不同處理間差異極顯著（P ＜0.01）。Note:Different small letters in the same column indicated significant differences between different treatments(P ＜0.05).Different capital letters indicated significant differences between different treatments(P ＜0.01).

第2 次用藥調(diào)查結(jié)果顯示，10 億個/mL（枯草芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌）懸浮劑防治效果達(dá)84.75%，且與其他兩個生物制劑處理相比，差異極顯著；1 億cfu/g枯草芽孢桿菌微膠囊粒劑，0.5%幾丁聚糖水劑防治效果均達(dá)70%以上，且2 個處理之間差異不顯著。3 個生物制劑防效明顯低于化學(xué)藥劑對照組，差異極顯著。且總體來看，復(fù)合菌制劑比單一菌制劑防控白粉病效果更佳。

3.3 生物制劑對黃芩葉中主要藥用成分的影響

結(jié)果顯示，經(jīng)生物制劑處理后的葉片，其主要藥用成分總黃酮和黃芩苷含量發(fā)生不同程度的變化。未發(fā)病葉片總黃酮含量為24.18 mg/g，發(fā)生白粉病植株葉片的病情指數(shù)為16.59 的情況下，總黃酮含量下降至18.18 mg/g，噴施兩次生物制劑后，各處理總黃酮含量較發(fā)病葉片上升顯著，但仍低于正常葉片中總黃酮含量。方差分析結(jié)果顯示，10 億個/mL（枯草芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌）懸浮劑處理后，總黃酮含量23.25 mg/g高于其他2 種生物制劑，且與未發(fā)病葉片總黃酮含量相比差異不顯著，與其他處理差異顯著。噴施1億cfu/g枯草芽孢桿菌微膠囊粒劑和0.5%幾丁聚糖水劑后，總黃酮含量21.79 mg/g、21.22 mg/g 高于發(fā)病葉片但低于正常葉片，兩處理間差異不顯著，與其他處理相比差異顯著。未發(fā)病葉片黃芩苷含量為0.26 mg/g，發(fā)病后植株葉片黃芩苷含量下降至0.17 mg/g，噴施2 次生物制劑后，各處理黃芩苷含量上升顯著。黃芩苷含量由高到低的處理排列順序為10 億個/mL（草芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌）懸浮劑處理（黃芩苷含量1.01 mg/g），其次是1 億cfu/g 枯草芽孢桿菌微膠囊粒劑處理（黃芩苷含量0.83 mg/g），再次是0.5%幾丁聚糖水劑處理（黃芩苷含量0.61 mg/g），3 個處理黃芩苷含量均高于未發(fā)病葉片，且3 個處理間、3 個處理與未發(fā)病葉片間差異均顯著，見表2。

4 討論與結(jié)論

4.1 生物制劑對黃芩白粉病田間防效分析

芽孢桿菌屬革蘭氏陽性細(xì)菌，是防治植物病害最有前途的常規(guī)農(nóng)藥替代品，可產(chǎn)生多種活性物質(zhì)促進植物生長，誘導(dǎo)植物自身抗性，抑制多種植物病害，通過競爭空間和營養(yǎng)成分對微生物病原體造成拮抗作用[14]。幾丁聚糖是我國第一個登記為植物誘抗劑的生物農(nóng)藥，通過激活植物免疫系統(tǒng)與生長系統(tǒng)來增強植物的抗逆性，還具有促進生長、形成保水薄膜等作用[15]。研究表明，這3 種生物制劑對黃芩白粉病菌均有良好的抑制作用，施用2 次后，1 億cfu/g 枯草芽孢桿菌微膠囊粒劑、0.5%幾丁聚糖水劑防治效果均達(dá)70%以上，10億個/mL（枯草芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌）懸浮劑防治效果最好，達(dá)84.75%。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是通過產(chǎn)生脂肽類、胞外蛋白、聚酮化合物、抗菌多肽等多種抗菌物質(zhì)對植物病菌產(chǎn)生明顯的抑制作用[16,17]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種典型的植物生長促生菌，定殖植物組織后可產(chǎn)生與植物細(xì)胞和根系生長相關(guān)的激素和揮發(fā)性有機物質(zhì)，促進植物獲取養(yǎng)分[18-20]?？赡苡捎诮獾矸垩挎邨U菌的促生長作用，加強了植物發(fā)病組織的愈合能力，與枯草芽孢桿菌共同作用，較單一菌株作用下植物抗逆性顯著增強，防治效果明顯提升。

4.2 生物制劑對黃芩葉中主要藥用成分的影響

黃芩葉片中黃酮類化學(xué)成分主要是野黃芩苷、野黃芩素、芹菜素7-O--D-葡萄糖醛酸苷及白楊素7-O--D-葡萄糖醛酸苷等[10,21,22]。采用HPLC 法對黃芩不同部位及其茶制品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 這5 種黃酮類成分進行比較，測得黃芩葉中只含有黃芩苷[21]，且其含量很低。黃芩葉部HPLC 指紋圖譜也僅指認(rèn)出該5 種黃酮類成分中黃芩苷色譜峰[22]。黃芩苷是黃芩素在黃酮類7-O-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UBGAT）的催化下生成的。黃芩中黃酮代謝途徑不僅受內(nèi)部基因的調(diào)控，還受外部因素的影響。其中誘導(dǎo)子（生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子）可調(diào)控黃芩中活性黃酮的積累，促進次生代謝產(chǎn)物的積累。有研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,MeJA）能夠通過上調(diào)黃酮合成途徑相關(guān)基因從而促進黃芩懸浮細(xì)胞、愈傷組織和發(fā)根中黃芩苷的積累。一定濃度的水楊酸會抑制黃芩愈傷組織生長，但能促進黃芩苷的積累。黃芩愈傷組織培養(yǎng)基添加外源植物激素如6-芐氨基嘌呤[N-(phenylmethyl)-9H-purin-6-amine,6-BA]和萘乙酸（1-naphthylaceticacid,NAA），也能夠提高黃芩苷含量[10]。本研究發(fā)現(xiàn)植物誘抗劑、微生物次生代謝物可提高黃芩白粉病發(fā)病葉片中總黃酮類成分及黃芩苷的含量，噴施制劑后總黃酮類成分含量未恢復(fù)到正常葉片水平，黃芩苷含量較正常葉片有顯著提升。相比總黃酮類成分，黃芩苷合成路徑更易受到這些代謝物的影響，黃酮類和黃芩苷合成路徑的代謝物種類及其調(diào)控作用方式還有待進一步研究。