汪雪瑩，楊銀莉，潘戰(zhàn)宇，姜戰(zhàn)勝※

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心中西醫(yī)結(jié)合科，天津 300060）

肺癌的發(fā)病率和死亡率均居世界首位[1]，主要包括小細(xì)胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）。NSCLC患者約占所有肺癌患者的80%，其中肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）是NSCLC 的主要組織學(xué)亞型，占所有肺癌病例的40%以上[2]。

鐵死亡是一種不同于細(xì)胞凋亡、焦亡和壞死的程序性細(xì)胞死亡，這一過(guò)程特點(diǎn)是依賴(lài)鐵離子及活性氧誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積[3]。有證據(jù)表明，鐵死亡在癌癥尤其是肺癌的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，特別是在肺癌中常常出現(xiàn)鐵死亡被抑制的現(xiàn)象[4]。肺部組織相對(duì)于其他組織長(zhǎng)期處于高氧濃度環(huán)境中，這種特殊環(huán)境使得肺部腫瘤需要承受很大的氧化壓力，肺癌細(xì)胞為了避免在轉(zhuǎn)化過(guò)程中出現(xiàn)被易化和強(qiáng)化的鐵死亡，采取了多種措施提高鐵死亡的誘導(dǎo)閾值，從而導(dǎo)致鐵死亡受抑，進(jìn)而促進(jìn)肺癌的發(fā)生和發(fā)展[5]。

人參為五加科植物，具有大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津安神的功效。有大量研究證實(shí)，人參及其主要活性成分在治療肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-8]。有研究顯示，紅參作為人參蒸熟、曬干或烘干后的產(chǎn)物，其主要成分紅參多糖可以顯著抑制肺癌或乳腺癌細(xì)胞的增殖并加速誘導(dǎo)鐵死亡，使乳酸脫氫酶釋放、脂質(zhì)過(guò)氧化物積累[9]。這些研究表明人參、鐵死亡與肺癌之間存在聯(lián)系，然而迄今為止，人參調(diào)控鐵死亡治療肺癌尤其是LUAD的機(jī)制尚不十分明確。因此，本研究擬通過(guò)識(shí)別人參調(diào)控LUAD的鐵死亡基因并構(gòu)建更準(zhǔn)確的預(yù)后模型，闡述人參調(diào)控鐵死亡治療LUAD 可能的作用機(jī)制，以期為后續(xù)研究提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 人參活性成分的獲取和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmsp-e.com/）中以生物口服利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和類(lèi)藥性（Drug-likeness,DL）≥0.18 為篩選條件；在ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/）中以score ≥0.8 為篩選條件；在Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中以P ＜0.05、score ≥10 為篩選條件，分別下載人參活性成分及其作用靶基因，并通過(guò)Cytoscape v3.9.0 軟件對(duì)人參活性成分及相關(guān)靶基因進(jìn)行分析，繪制人參活性成分－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，人參活性成分度值圖。

1.2 鑒定人參治療LUAD的鐵死亡基因

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載了574 名LUAD 患者的RNA 測(cè)序（RNA-seq）FPKM數(shù)據(jù)集和臨床信息，運(yùn)行R軟件“edgeR、gplots”程序包，以Fold change ＞1、P ＜0.05 為過(guò)濾條件對(duì)LUAD 患者的RNA-seq 基因進(jìn)行差異基因篩選。從FerrDb 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.datjar.com:40013/bt2104/）下載鐵死亡相關(guān)基因，并通過(guò)Draw Veen Contents 在線(xiàn)工具篩選出人參作用靶基因、鐵死亡基因和LUAD差異基因的交集基因，并對(duì)交集基因的差異表達(dá)進(jìn)行可視化。

1.3 GO功能分析與KEGG通路注釋分析

通過(guò)David 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集基因分別進(jìn)行基因本體（GO）功能分析、京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路注釋分析，以P ＜0.05 為篩選條件，進(jìn)行可視化。

1.4 構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型并篩選關(guān)鍵鐵死亡基因

將交集基因相關(guān)的TCGA 數(shù)據(jù)集與患者臨床信息合并，去除正常組織數(shù)據(jù)和脫落數(shù)據(jù)后，使用R 軟件“survival”程序包進(jìn)行單因素Cox分析，以P＜0.05為條件篩選交集基因中與總體生存期（OS）有關(guān)的具有預(yù)后價(jià)值的基因。為了進(jìn)一步篩選人參治療LUAD的關(guān)鍵鐵死亡基因，在相關(guān)預(yù)后基因的基礎(chǔ)上，采用R軟件“glmnet、survival”程序包進(jìn)行Lasso回歸分析，構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，篩選出關(guān)鍵鐵死亡基因，并進(jìn)行基因的相關(guān)性分析。

1.5 評(píng)估預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型

通過(guò)以下公式計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分：Riskscore=coef（關(guān)鍵鐵死亡基因1）expr（關(guān)鍵鐵死亡基因1）+coef（關(guān)鍵鐵死亡基因2）expr（關(guān)鍵鐵死亡基因2）+…+coef（關(guān)鍵鐵死亡基因n）expr（關(guān)鍵鐵死亡基因n）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)將患者劃分為“高風(fēng)險(xiǎn)”和“低風(fēng)險(xiǎn)”組，構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)曲線(xiàn)和散點(diǎn)圖，觀察風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)患者死亡與存活狀態(tài)的影響，利用R 軟件“survival”包對(duì)兩組患者進(jìn)行生存分析，通過(guò)建立時(shí)間依賴(lài)ROC 曲線(xiàn)以評(píng)估預(yù)后模型的可靠程度，應(yīng)用R軟件“ggplot2、Rtsne”程序包主成分分析（PCA）和分布式隨機(jī)鄰居嵌入（t-SNE）分析，以證明該模型的分組能力。

1.6 分子對(duì)接

通過(guò)Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載人參活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）下載關(guān)鍵鐵基因的靶點(diǎn)蛋白，分別將其導(dǎo)入AutoDock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接并預(yù)測(cè)分子與靶點(diǎn)結(jié)合能。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參活性成分和作用靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

從中藥數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選出人參活性成分77 個(gè)和人參作用靶點(diǎn)1 676 個(gè)（圖1A）；人參活性成分，根據(jù)度值排序結(jié)果，見(jiàn)圖1B。

圖1 人參活性成分-靶點(diǎn)分析圖Fig.1 Ginseng active ingredient-target analysis diagram

2.2 人參治療LUAD的鐵死亡基因鑒定結(jié)果

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選出3 300 個(gè)LUAD 差異基因，其中包括1 166 個(gè)上調(diào)基因，2 134 個(gè)下調(diào)基因；通過(guò)對(duì)中藥數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出1 676 個(gè)人參作用靶點(diǎn)、FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出388個(gè)鐵死亡基因和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的3 300 個(gè)LUAD 差異基因，Venn分析后發(fā)現(xiàn)29 個(gè)人參治療LUAD 的鐵死亡基因（圖2A），其中包括9個(gè)上調(diào)基因，20個(gè)下調(diào)基因，見(jiàn)圖2B。

圖2 人參治療LUAD 的鐵死亡基因的鑒定結(jié)果圖Fig.2 Identification results of ferroptosis gene of Ginseng in treating LUAD

2.3 富集分析結(jié)果

針對(duì)29 個(gè)交集靶點(diǎn)通過(guò)GO 功能分析可知，在P ＜0.05水平篩選出生物過(guò)程（Biological process,BP）條目59 個(gè)，其中涉及RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控和凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等；細(xì)胞組分（Cellular component,CC）條目8 個(gè)，其中涉及基底外側(cè)膜、細(xì)胞膜穴樣凹陷和黑素體等；分子功能（Molecular function,MF）條目14 個(gè)，其中涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白異源二聚化活性和酶結(jié)合等；根據(jù)基因數(shù)進(jìn)行排序，分別將前10 位的條目進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖3A。

圖3 富集分析結(jié)果圖Fig.3 Enrichment analysis results

通過(guò)KEGG 分析獲得32 條信號(hào)通路，分別對(duì)前8 條疾病途徑和前7 條信號(hào)通路進(jìn)行可視化（圖3B），這些信號(hào)通路多與免疫炎癥和低氧相關(guān)，提示人參治療LUAD 的鐵基因可能通過(guò)這些通路發(fā)揮作用。

2.4 相關(guān)預(yù)后基因篩選結(jié)果

去除正常組織數(shù)據(jù)和脫落數(shù)據(jù)后，剩余499 列LUAD 患者信息。對(duì)余下499 列患者進(jìn)行分析，根據(jù)單因素Cox 回歸分析篩選出6 個(gè)影響總體生存期（OS）預(yù)后的基因：RRM2、AURKA、SLC2A1、TXNRD1、TLR4 和CAV1。在預(yù)后基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行Lasso 回歸分析構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，發(fā)現(xiàn)由SLC2A1、RRM2、CAV1、TXNRD1 和TLR4 組成的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型最為穩(wěn)定（圖4A），這5 個(gè)基因可能是人參調(diào)節(jié)LUAD 的關(guān)鍵鐵死亡基因。其中，TLR4 是LUAD 預(yù)后保護(hù)因素，SLC2A1、RRM2、CAV1 和TXNRD1 可能是LUAD 預(yù)后危險(xiǎn)因素（圖4B）?；蛑g相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TLR4 與SLC2A1、RRM2、CAV1 和TXNRD1呈負(fù)相關(guān)；SLC2A1、RRM2、CAV1 和TXNRD1 之間呈正相關(guān)，見(jiàn)圖4C。

圖4 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型和關(guān)鍵鐵死亡基因分析結(jié)果圖Fig.4 Risk prognostic model and analysis results of key ferroptosis genes

2.5 鐵死亡基因預(yù)后模型的評(píng)估結(jié)果

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值，將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=249 例）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=250 例），高風(fēng)險(xiǎn)組患者死亡人數(shù)高于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖5A 和5B）。KM 生存曲線(xiàn)分析表明，遠(yuǎn)期低風(fēng)險(xiǎn)組的生存時(shí)間長(zhǎng)于高風(fēng)險(xiǎn)組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5C）；ROC 曲線(xiàn)（AUC=0.676）證明該預(yù)后模型具有可靠性（圖5D）；PCA 和t-SNE 雖有待優(yōu)化，但基本證明該模型能將高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組樣本區(qū)分（圖5E-F）。經(jīng)評(píng)估證明RRM2、SLC2A1、TXNRD1、TLR4 和CAV1 這5 個(gè)關(guān)鍵鐵死亡基因?qū)UAD 的預(yù)后影響顯著且模型穩(wěn)定可靠。

圖5 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型評(píng)估結(jié)果Fig.5 Risk prognostic model assessment results

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

大多數(shù)中藥的皂苷、多糖和揮發(fā)油成分對(duì)肺癌具有一定的干預(yù)作用，皂苷類(lèi)成分和多糖類(lèi)成分主要通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[10]。人參化學(xué)成分有皂苷、有機(jī)酸、揮發(fā)油和多糖等[11]。根據(jù)人參化學(xué)成分分類(lèi)，度值排名前3 位的活性成分作為配體，5個(gè)關(guān)鍵鐵死亡基因作為受體，進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為，結(jié)合能小于0 說(shuō)明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤ 20.92 kJ/mol 表示具有較好的結(jié)合性，同時(shí)所需的能量越少，代表配體與受體的相互作用的親和力越強(qiáng)，構(gòu)象越穩(wěn)定[12,13]。通過(guò)AutoDock Vina 分析，發(fā)現(xiàn)人參的重要活性成分與關(guān)鍵鐵死亡基因均能自發(fā)結(jié)合，見(jiàn)表1。

表1 人參主要活性成分與關(guān)鍵鐵死亡基因結(jié)合能量表Table 1 Energy table of main active components of ginseng combined with ferroptosis genes 單位：kJ/mol

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)人參作用靶點(diǎn)、鐵死亡基因和LUAD 差異基因進(jìn)行Venn 分析發(fā)現(xiàn)29 個(gè)人參治療LUAD 的鐵死亡基因。通過(guò)KEGG 信號(hào)通路分析可知，Toll 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等可能是人參調(diào)控鐵死亡基因治療LUAD的主要途徑?；贚asso回歸分析構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后模型，分別由5 個(gè)鐵死亡相關(guān)基因（SLC2A1、RRM2、CAV1、TXNRD1 和TLR4）組成，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，KM 生存曲線(xiàn)和ROC 曲線(xiàn)證明這5 個(gè)關(guān)鍵鐵死亡基因?qū)UAD 的預(yù)后影響顯著且模型具有可靠性，PCA 和t-SNE 證明該模型基本能將高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組樣本區(qū)分，但后續(xù)需要基礎(chǔ)試驗(yàn)的進(jìn)一步優(yōu)化及驗(yàn)證。分子對(duì)接結(jié)果顯示，人參的主要活性成分與5 個(gè)鐵死亡關(guān)鍵基因均能自發(fā)結(jié)合。由此推斷這5 個(gè)鐵死亡關(guān)鍵基因是人參通過(guò)調(diào)節(jié)鐵死亡途徑治療LUAD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

鐵死亡在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起雙重作用，一方面，藥物可以通過(guò)半胱氨酸耗竭或抑制GPX4 來(lái)誘導(dǎo)鐵死亡，從而遏制NSCLC 細(xì)胞的生長(zhǎng)；另一方面，鐵死亡可以引起免疫抑制，通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)促使NSCLC腫瘤生長(zhǎng)[14]。人參是一種天然抗氧化劑，抗氧化劑的發(fā)現(xiàn)與天然存在的非酶抗氧化劑有關(guān)，后者形成完整的防御系統(tǒng)以防止體內(nèi)氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激被證明與鐵死亡相關(guān)[15,16]。雙氫青蒿素作為天然抗氧化劑青蒿的主要提取物，已經(jīng)被證實(shí)與Ce6 光動(dòng)力療法聯(lián)合應(yīng)用可以抑制GPX4，升高活性氧，誘發(fā)鐵死亡，抑制肺癌細(xì)胞的活力[17,18]，為人參調(diào)控鐵死亡治療LUAD的機(jī)制提供了參考依據(jù)。

有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥在腫瘤進(jìn)展中有著不可忽視的作用，Toll 樣受體介導(dǎo)的疾病中多伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生[19]。Toll樣受體4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)活性氧對(duì)NSCLC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有重要作用，其主要機(jī)制是上調(diào)NSCLC細(xì)胞中miR-21 促進(jìn)原發(fā)性NSCLC 的生長(zhǎng)，而通過(guò)清除活性氧可以減少原發(fā)性NSCLC 細(xì)胞中miR-21的上調(diào)從而減慢NSCLC 的生長(zhǎng)。NADPH 氧化酶對(duì)于Toll樣受體4 信號(hào)增強(qiáng)的NSCLC轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[20,21]。一旦產(chǎn)生了過(guò)量的活性氧，超過(guò)細(xì)胞自身抗氧化能力，活性氧可能發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而損害細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核酸等，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22]。HIF-1信號(hào)通路在細(xì)胞、組織和器官的低氧損傷和適應(yīng)過(guò)程中有關(guān)鍵的調(diào)控作用，低氧可以增加HIF-1 的穩(wěn)定性，促進(jìn)HIF-1 與低氧反應(yīng)元件的結(jié)合，從而誘導(dǎo)低氧靶基因的激活。有研究證實(shí)EGLN1 基因和c-Myc 基因通過(guò)抑制HIF-1α直接激活淋巴特異性解旋酶的表達(dá)，淋巴特異性解旋酶與WDR76 相互作用，通過(guò)激活脂質(zhì)代謝相關(guān)基因GLUT1 以及與鐵死亡相關(guān)的基因SCD1 和FADS2 參與Warburg 效應(yīng)抑制鐵死亡，促進(jìn)NSCLC 的進(jìn)展[23,24]。由此可見(jiàn)，Toll 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路與LUAD 鐵死亡有著緊密聯(lián)系。

RRM2、SLC2A1 和TXNRD1 在一些研究中被證實(shí)可能與鐵死亡和肺癌相關(guān)。RRM2 是核糖核苷酸還原酶的兩個(gè)不同亞基之一，該還原酶催化核糖核苷酸形成脫氧核糖核苷酸，并以細(xì)胞周期依賴(lài)性的方式調(diào)節(jié)編碼蛋白（M2）合成。敲除RRM2 能夠通過(guò)介導(dǎo)鐵死亡影響肺腺癌細(xì)胞的增殖，而鐵死亡抑制劑Fer-1可以逆轉(zhuǎn)RRM2 敲除后的抗腫瘤效果。由此證實(shí)了RRM2 不僅是鐵死亡的標(biāo)志基因，也是鐵死亡的抑制基因[25]。SLC2A1 介導(dǎo)的葡萄糖攝取促進(jìn)糖酵解，從而促進(jìn)丙酮酸氧化，促進(jìn)三羧酸循環(huán)，并刺激脂肪酸合成，最終加速誘導(dǎo)鐵死亡[26]。在肺癌患者的癌前病變和腫瘤中檢測(cè)到SLC2A1 的過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)滅活SLC2A1會(huì)影響癌細(xì)胞中的糖酵解途徑，使體內(nèi)、外的肺癌細(xì)胞減少[27]。TXNRD1 參與抗氧化防御，并與癌細(xì)胞的耐藥性相關(guān)，受TXNRD1 調(diào)節(jié)的代謝途徑在癌癥中至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸充足時(shí)，TXNRD1 和GSH/GPX4 共同作用，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，避免鐵死亡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸缺乏時(shí)，半胱氨酸耗竭會(huì)引起一定程度的TXNRD1 酶活性和GSH/GPX4 水平下降，導(dǎo)致氧化水平急劇升高，發(fā)生鐵死亡[28-30]。

生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接為新藥研發(fā)及臨床用藥提供理論依據(jù)，但是目前仍存在局限性，主要有：首先每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)收納的藥物活性成分不同，用不同數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的作用靶點(diǎn)可能存在差異；其次受樣本量限制，預(yù)后模型評(píng)估結(jié)果可能與真實(shí)情況存在誤差；最后相關(guān)疾病的具體分子機(jī)制尚不完全清楚，因此，分子對(duì)接等技術(shù)可能與實(shí)際情況存在區(qū)別，需要后續(xù)進(jìn)行基礎(chǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，人參可通過(guò)SLC2A1、RRM2、CAV1、TXNRD1 和TLR4 等關(guān)鍵鐵死亡基因介導(dǎo)Toll 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等發(fā)揮治療LUAD 的作用，為進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)和參考。